Summary
ويرد طريقة لاستخراج المستقلب من المجتمعات العوالق الجرثومية. ويتحقق كل مجتمع أخذ العينات عن طريق الترشيح على مرشحات أعدت خصيصا لذلك. بعد lyophilization، يتم استخراج مائي للذوبان في الأيضات. ويسمح هذا النهج لتطبيق الايض البيئية عبر omics التحقيقات في المجتمعات الميكروبية الطبيعية أو التجريبية.
Abstract
الايض البيئية هو حقل الناشئة التي تروج فهما جديدا في كيفية الرد على الكائنات الحية والتفاعل مع البيئة وغيرها كل على الصعيد البيوكيميائية 1. الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي) الطيفي هي واحدة من عدة تكنولوجيات، بما في ذلك الغاز اللوني الكتلة الطيفي (GC-MS)، مع وعد كبير لمثل هذه الدراسات. مزايا الرنين المغناطيسي هي أنه لا يصلح لتحاليل غير مستهدفة، وتوفر المعلومات الهيكلية، ويمكن الاستعلام عن الأطياف في الأدب الكمية والإحصائية ضد قواعد البيانات المتوفرة مؤخرا من أطياف المستقلب 2،3 فرد. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الجمع بين البيانات الرنين المغناطيسي الطيفي مع البيانات من مستويات omics الأخرى (على سبيل المثال transcriptomics، وعلم الجينوم) لتوفير فهم أكثر شمولا من الاستجابات الفسيولوجية من الأنواع لبعضها البعض والبيئة 4،5،6. ومع ذلك، الرنين المغناطيسي النووي هو أقل حساسية من تقنيات metabolomic الأخرى، مما يجعل من الصعب ا ف برقائق لأنظمة الميكروبية الطبيعية حيث السكان عينة يمكن أن يكون تركيز منخفض الكثافة ومنخفض مقارنة المستقلب إلى الأيضات من يعرف جيدا و. مصادر استخراجها بسهولة مثل الأنسجة كله، biofluids أو خلية ثقافات وبناء على ذلك، واقتصرت على بعض الدراسات البيئية المباشرة metabolomic من الميكروبات القيام بها لتاريخ النظم الإيكولوجية ذات الكثافة العالية القائمة على الثقافة أو المعرفة بسهولة مثل المضيف المتكافل النظم، وشارك في بناء ثقافات أو التلاعب في بيئة القناة الهضمية حيث وضع العلامات النظائر المستقرة يمكن أن يكون وبالإضافة إلى ذلك تستخدم لتعزيز إشارات الرنين المغناطيسي النووي 7،8،9،10،11،12. الطرق التي تسهل التركيز وجمع من الأيضات البيئية بتركيزات مناسبة لالرنين المغناطيسي النووي تعاني من نقص. منذ تم إيلاء اهتمام الأخيرة إلى الايض البيئية للكائنات الحية في البيئة المائية، حيث توسطت كثيرا من تدفق الطاقة والمواد من قبل المجتمع العوالق 13،14، وقد طورنا طريقة لتركيزاتنشوئها واستخراج كامل المجتمع الأيضات من النظم الميكروبية العوالق عن طريق الترشيح. يتم التعامل مع خصيصا المتاحة تجاريا ماء بولي-1 ،1-difluoroethene (PVDF) مرشحات لإزالة تماما extractables، التي يمكن أن تظهر إلا في شكل ملوثات في تحليلات لاحقة. ثم يتم استخدام هذه الفلاتر لتصفية تعامل العينات البيئية أو التجريبية من الفائدة. المرشحات التي تحتوي على مادة العينة الرطبة هي مجفف بالتجميد، ويتم استخراج مائي للذوبان في الأيضات مباشرة لطيف الرنين المغناطيسي النووي التقليدية باستخدام فوسفات البوتاسيوم موحدة العازلة استخراج 2. ويمكن تحليل البيانات المستمدة من هذه الأساليب الإحصائية لتحديد أنماط ذات معنى، أو دمجها مع مستويات omics أخرى لفهم شامل للمجتمع وظيفة النظام الإيكولوجي.
Protocol
1. مرشح التحضير لإزالة Extractables
- استخدم 25 ملم قطرها 0.22 ميكرون مسام الحجم Durapore المرشحات PVDF ماء (ميليبور). المرشحات في مكان نظيف 500 مل دورق بيركس باستخدام ملاقط. قبل شطف ثلاث مرات مع الماء المقطر. دوامة كذلك يمكنك شطف لمنع المرشحات من الالتصاق مع بعضها البعض. إضافة 300 مل ملي-Q (ميليبور) أو ما يعادلها من المياه ذات الجودة العالية. الأوتوكلاف لتسهيل الإزالة الكاملة للextractables من المرشحات.
- صب قبالة ملي-Q وثلاثية ثانية شطف المرشحات، وهذه المرة مع ميلي-Q. باستخدام مرشحات مكان ملاقط فرد على سطح جاف ونظيف (مثل رقائق الألومنيوم)، وإما جاف عند درجة حرارة معقولة (على سبيل المثال 37 درجة مئوية) أو جفاف الهواء. المرشحات هي الآن جاهزة للاستخدام.
2. الترشيح للمواد عينة
- لإثبات هذا البروتوكول، والفولاذ المقاوم للصدأ ميليبور 3-مكان مشعب فلتر مع أعمدة التحليل الدقيق 25 مم مع فلتر الزجاج تدعموتستخدم مضخة ميكانيكية. باستخدام تقنية معقمة، ومكان واحد 25 مم مرشح على قاعدة عمود مرشح، وتطبيق العمود والمشبك معا.
- تحميل 15 مل من العينة إلى العمود، وفتح صمام حابس على مرشح المتعددة، وتشغيل المضخة. تصفية تحت ضغط لطيف للحد من كسر الخلية (<5 كيلو باسكال). يمكن تكييفها مضخات أخرى، مثل اليد أو مضخة تحوي على هذا البروتوكول. لعينات أقل كثافة، والإضافات المتلاحقة من المياه قد يكون من الضروري، لا تدع مرشح يذهب الجافة لفترة طويلة من الزمن بين الإضافات من الماء.
- لعينات البحرية، بعد أن كنت قد تمت تصفيتها عينة الخاص بك، يمكنك إجراء اختياري شطف المياه العذبة للحد من الأيونات متوازي المغنطيسية المتبقية في عينة الخاص بك وعلى مرشح. وهذا قد يساعد في ضبط أكثر دقة من المغناطيس مطياف. ببساطة إضافة بلطف كمية صغيرة من الماء وتصفيته من خلال عينة الخاص التي تم جمعها في نهاية المطاف.
- يتم الانتهاء من تصفية مرة واحدة، إيقاف مضخة، وترك مكتب مستشار رئيس الوزراء صمامن حتى لا يكون هناك لا يزال الضغط السلبي تحت التصفية. إزالة الشبك وعمود مرشح.
- بيد واحدة، واستخدام الملقط نظيفة لاتخاذ اجراء من مرشح. طي مرشح عبر نفسها، ولكن لا تجعد. مع يدك الأخرى استخدام شفة من أنبوب معقم microcentrifuge 2 مل إلى الاستمرار على مرشح. الافراج عن ملاقط ثم استخدامها لإعادة قبضة كلا حواف فلتر. Regrip بزاوية 45 درجة إلى حظيرة.
- وضع مرشح في أنبوب 2 مل والافراج حتى يتم فتحه مع الجانب عينة التي تواجه الداخل. يمكنك وضع ما يصل الى اثنين مرشحات في معقم 2 مل أنبوب microcentrifuge بهذه الطريقة. إذا باستخدام اثنين من المرشحات، والتأكد من أنها تتداخل بأقل قدر ممكن. تجمد على الفور (ما لا يقل عن -30 درجة مئوية).
3. استخراج مائي للذوبان في المستقلبات
- Lyophilize العينات الخاصة بك بين عشية وضحاها أو على الأقل 10 ساعة.
- بعد lyophilization، إضافة محطم الفولاذ المقاوم للصدأ على كل أنبوب (Tokken). إضافة 750 البوتاسيوم موحدة ميكرولترالفوسفات عازلة الرنين المغناطيسي النووي في أكسيد الديوتيريوم (2 H> 90٪) مع 2،2-ثنائي ميثيل-2-silapentane-سلفونات-5 (DSS) معيار (KPI، 38.3 ملي KH 2 PO 4، 61.7 ملي K 2 هبو 4، مفاجآت صيف دبي 0.1 مم، درجة الحموضة 7.0، 90٪ D 2 O) 2.
- يصوتن العينات لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في sonicator المياه (Bioruptor، Diagenode) لإزالة المواد خلية من مرشح. إزالة المرشحات مع ملاقط نظيفة.
- تعطيل الخلايا باستخدام محطم مطحنة (1600 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق.
- احتضان في 65 درجة مئوية مع الهز (1400 دورة في الدقيقة) على مقاعد البدلاء شاكر العلوي (إيبندورف) لمدة 15 دقيقة.
- إزالة خنزير مع ملاقط معدنية نظيفة، وأجهزة الطرد المركزي في العينة 13000 ز لمدة 5 دقائق.
- رسم الخروج من طاف مباشرة إلى أنبوب الرنين المغناطيسي لمطياف الرنين المغناطيسي النووي.
4. الرنين المغناطيسي الطيفي وتحليل البيانات
- تحميل عينة الخاص بك إلى مطياف الرنين المغناطيسي النووي (هنا، DRX-500 بروكر مطياف مجهزةTXI التحقيق مع الثلاثي محور التدرج التي يسيطر عليها جهاز كمبيوتر يعمل بنظام XWIN-NMR).
- الحصول 1D 1 أطياف الرنين المغناطيسي H باستخدام الطرق الملائمة لنشر سابقا 2،15 من واجهة XWIN، الرنين المغناطيسي النووي. في هذه الدراسة تم تسجيل 1 H NMR الأطياف على مطياف DRX-500 في التشغيل 500.03 ميغاهيرتز في ك 298 الإشارات المياه المتبقية قمعت من قبل تسلسل نبض ووترغيت، مع فترة تكرار 1.2 ق. وقد تم جمع 128 العابرين للحصول على نقاط البيانات 32000 لكل طيف.
- نقل الدلائل البيانات الرنين المغناطيسي النووي على جهاز كمبيوتر مثبت NMRPipe البرمجيات 16. معالجة البيانات الخام ومفاجآت صيف دبي مجموعة ك 0 مرجع جزء في المليون ثم تخلص يدويا الأطياف. رقمنة البيانات الطيفية إلى مجموعة من القيم المنفصلة عن طريق دمج أو "binning 'لهم مع برامج مثل rNMR، Automics، أو باستخدام حزمة FT2B متاحة للجمهور من خلال موقع ECOMICS ( https://database.riken.jp/ecomics/ ) 3،17. في الوالمثال، تم دمج الأطياف ما بين 0.5 و 10.5 جزء في المليون على مناطق لا يتجزأ 0،032 جزء في المليون باستخدام ECOMICS، وتطبيع إما إلى مفاجآت صيف دبي أو مجموع كثافة الإشارة. ويمكن الآن إخراج البيانات يمكن استخدامها لأغراض التحليل الإحصائي المصب مثل تحليل المكونات الرئيسية (PCA) باستخدام حزم البرمجيات الحرة مثل آر 18.
5. ممثل النتائج
حصل على سبيل المثال من 1 أطياف الرنين المغناطيسي H باستخدام ترد الأساليب المذكورة أعلاه في الشكل 1. هذه العينات، من نقاط مرة اثنين من تجربة مصغرة تظهر اختلافات واضحة من جراء الأنشطة الأيضية الطحالب. اليوم 4 طيف يظهر وفرة كبيرة من القمم، ولا سيما في نطاق 3-4 جزء في المليون مقارنة مع عينة 1 يوم. ويمكن أن تعزى هذه القمم على السكريات التي تنتجها تزهر الدياتومات داخل مصغرا. في تجربة مماثلة بمقارنة نمو المجتمعات العوالق الطبيعية في مياه البحر مصطنعة أو طبيعية، والنهج الإحصائية Sويمكن استخدام اوك كما الرئيسي مؤامرة تحليل عنصر درجة (PCA) مشتقة من أطياف الرنين المغناطيسي النووي اهمال لاظهار الاختلافات التمثيل الغذائي واضح بين المعاملتين (الشكل 2)، في حين أن المؤامرات التحميل يمكن التعرف على قمم داخل الأطياف أن شكل توزيع البيانات . ويمكن مقارنة هذه النتائج مع بيانات من مستويات omics أخرى، مثل من طرق أخذ البصمات الجينية (الشكل 3). ويمكن الاستعلام عن هذه القمم الرنين المغناطيسي بشكل فردي (على سبيل المثال في BMRB؛ http://www.bmrb.wisc.edu/ ) 19، أو يمكن تحليلها إحصائيا الأطياف كامل (على سبيل المثال مع SpinAssign في http://prime.psc.riken. ج ب /؟ عمل = nmr_search ) 2. في هذا المثال، وكانت الخلافات بين العلاجات بسبب وفرة من القمم في المنطقة السكريات (3.39 جزء في المليون إلى 4،04 جزء في المليون) من أطياف المجتمع من الطبيعي الأيضات العوالق، وعدة قمم المميزة للمجتمعات مياه البحر الاصطناعي كان مؤقتا IDEntified كما اللاكتات وفورمات باستخدام SpinAssign.
الشكل 1. الممثل 1 أطياف الرنين المغناطيسي H تم الحصول عليها من العينات المصنعة باستخدام هذا الإجراء. وتم أخذ عينات مصغرة قبل (يوم 1) وخلال (يوم 4) وازهر المشطورة مكثفة. وأجريت تجارب الرنين المغناطيسي النووي على 500-DRX بروكر مع إشارات طبيعية لارتفاع مستوى الذروة الداخلية (مفاجآت صيف دبي، 0 جزء في المليون).
الشكل 2. المكون الرئيسي مؤامرة تحليل درجة (PCA) لأطياف الرنين المغناطيسي النووي اهمال من metabolomes من الطبيعي المستمدة من مجتمعات العوالق الجرثومية التي تزرع في عوالم مصغرة مع الطبيعية (الماس مفتوح) أو مياه البحر الاصطناعي (الدوائر السوداء). ويمكن ملاحظة الفروق الأيض واضحة في مخطط التشتت. ويمكن بعد ذلك تحميل مؤامرة من هذا التحليل يمكن استخدامها لتحديد قمم متميزة من أهمية فيالنظام، ويمكن هذه القمم لمزيد من التحليل حسب الحاجة.
الشكل 3. مثال متعددة omics تحليل الجمع بين الرنين المغناطيسي النووي مع بيانات الجينوم. تكوين مجتمع يقوم على تبديل طبيعة التدرج الكهربائي للهلام من 18S (يسار) و16S (يمين) الجينات الريباسي من العينات التي تم تحليلها في نفس ويبين الشكل 2 أيضا متميزة أنماط المجتمع الجرثومية بين (الماس مفتوح) الطبيعية والاصطناعية (الدوائر السوداء) عوالم مصغرة مياه البحر. هذه المراسلات بين metabolome والجينوم من النظم الطبيعية يدل على جدوى هذا النهج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طريقة استخراج الترشيح والمستقلب تظاهر هنا يسمح للالكتلة الحيوية الميكروبية العوالق التي سيتم جمعها في كمية كافية لالايض الرنين المغناطيسي النووي. في حين يتجلى فقط من استخراج مائي للذوبان في الأيضات باستخدام مؤشرات الأداء الرئيسية و1D 1 H NMR، يمكن استخدام المذيبات استخراج والنهج الأخرى الطيفية. مثال واحد من المفيد هو استخدام الميثانول deuterated كمذيب شبه القطبية، وهو ما ثبت لانتاج متفوق أطياف الرنين المغناطيسي النووي من عينات غير متجانسة وأقل حساسية للتلوث بواسطة أيونات ممغطس كما هي وجدت في عينات البحرية 15. في مثل هذه الحالات، ينبغي الابقاء على بيليه من استخراج فوق لإخراج المتعاقبة. وقد أظهرت عملنا السابقة استقرار الأطياف تحت حضانة هذه الأوقات ودرجات الحرارة ومدى ملاءمتها لاستخراج مائي مباشر لطيف الرنين المغناطيسي النووي 15،20. ومع ذلك، قد يفضل الباحثون أيضا إلى تعديل خطوات استخراج، على سبيل المثال باستخدام دناتورينج خطوة لتعطيل الإنزيمات قبل الاستخراج، أو عن طريق استخدام وسائل التبريد السريع التي تختلف عن تجميد ببساطة الخلايا كما هو موضح هنا. بالإضافة إلى ذلك، بينما هي الأنسب الأساليب المقدمة هنا لرصد التغيرات النسبية في الأيضات عبر العلاجات، إذا رغبت، ويمكن مرشحات مسبقا وزنه ومن ثم وزنه مرة أخرى بعد ترشيح عينة وlyophilization للحصول على الوزن الجاف، أو حجم العينة التي تمت تصفيتها يمكن أن يكون استخدامها للحصول على مزيد من البيانات الكمية مصدر المستقلب.
في النهاية، يتم تقييد فائدة الرنين المغناطيسي النووي لعينات العوالق، من خلال حجم الكتلة التي يمكن جمعها بنجاح، وحتى عالية الكثافة والثقافات قد تتطلب كميات كبيرة (> 100 مل) للحصول على الكتلة الحيوية الجافة كافية. ومع ذلك، ضمن الإطار التجريبي، ووضع العلامات النظائر مستقرة في التجارب الصغيرة أو mesocosm، 2D 1 H-13 C heteronuclear واحدة الكم التماسك (HSQC) النهج ممكنة. علاوة على ذلك، وقد استخدمنا وبالإضافة إلى ذلك 47 -قد المرشحات ملم وأنابيب البولي بروبلين 5 مل إلى زيادة كمية الكتلة الحيوية التي يمكن جمعها لاستخراج، وكميات أكبر من ذلك يكون من الضروري (على سبيل المثال> 2 ليتر) للمجتمعات الطبيعية من مياه oligotrophic على سبيل المثال حيث كثافة الخلية منخفضة.
الترشيح هو مفيد خلال الطرد المركزي كما هو ملاحظتنا أن بعض الأنواع أصغر الجراثيم (البكتيريا متغايرة صغيرة خاصة) غالبا ما لا بيليه أيضا. لا يمكن أن يؤديها الترشيح يدويا في هذا المجال، وتقتصر وحدات التخزين التي تمت تصفيتها فقط من قبل عدد من المرشحات المتاحة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إزالة الزائدة أو وسائل الإعلام المياه بهذه الطريقة، ويمكن أن تشطف العينات اذا لزم الامر. بالطبع، حتى مع الترشيح، سوف تقتصر على المجتمع التي تم جمعها إلى جزء صغير الحجم وصولا الى قطع مرشح، والتي في هذا المثال هو 0.22 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث في جزء من المنح التي تقدم للمساعدة للبحث العلمي للطعن البحوث الاستكشافية (كيه)، والبحث العلمي (A) (كيه و SM) من وزارة التربية والتعليم، الثقافة والرياضة والعلوم، والتكنولوجيا، واليابان . وقدم FPR بتبريد زمالة (RCE) دعم إضافي. الكتاب إعراب عن امتنانهم للالدكاترة. إيسوكي Chikayama، Yasuyo Sekiyama وأوكاموتو مامي لتقديم المساعدة التقنية مع الرنين المغناطيسي النووي والتحليلات الإحصائية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm hydrophilic Durapore PVDF filters, 25 mm | EMD Millipore | GVWP02500 | |
| Microanalysis Filter Holder, 25 mm, fritted glass support | EMD Millipore | XX1002500 | |
| 3-place manifold, 47 mm, stainless steel | EMD Millipore | XX2504735 | |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-04245 | |
| K2HPO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 164-04295 | |
| Deuterium oxide, 2H > 90% | Campridge Isotope Laboratoties | DLM-4 | |
| DSS | Fluka | 92754 | |
| Automill | Tokken | TK-AM4 | Stainless steel crushers included |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Vacuum evaporator | EYELA | CVE-3100 | |
| NMR | Bruker Corporation | DRX-500 with 5 mm-TXI probe | |
| Spectral binning tool | Originally developed | FT2DB | https://database.riken.jp/ecomics/ |
| Metabolite annotation tool and database | Originally developed | SpinAssign | http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search |
References
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: a critical review and future perspectives. Metabolomics. 5, 3-21 (2008).
- Chikayama, E., et al. Statistical indices for simultaneous large-scale metabolite detections for a single NMR spectrum. Anal. Chem. 82, 1653-1658 (2010).
- Lewis, I. A., Schommer, S. C., Markley, J. L. rNMR: open source software for identifying and quantifying metabolites in NMR spectra. Magn. Reson. Chem. 47, S123-S126 (2009).
- Li, M., et al. Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2117-2122 (2008).
- Mochida, K., Furuta, T., Ebana, K., Shinozaki, K., Kikuchi, J. Correlation exploration of metabolic and genomic diversity in rice. BMC Genomics. 10, 568 (2009).
- Fukuda, S., et al. Bifidobacteria can protect from enteropathogenic infection through production of acetate. Nature. 469, 543-547 (2011).
- Kikuchi, J., Hirayama, T. Practical aspects of stable isotope labeling of higher plants for a hetero-nuclear multi-dimensional NMR-based metabolomics. Methods Mol. Biol. 358, 273-286 (2007).
- Martin, F. P., et al. A top-down systems biology view of microbiome-mammalian metabolic interactions in a mouse model. Mol. Syst. Biol. 3, 112 (2007).
- Mahrous, E. A., Lee, R. B., Lee, R. E. A rapid approach to lipid profiling of mycobacteria using 2D HSQC NMR maps. J. Lipid Res. 49, 455-463 (2008).
- Fukuda, S., et al. Evaluation and characterization of bacterial metabolic dynamics with a novel profiling technique, real-time metabolotyping. PloS ONE. 4, e4893 (2009).
- Date, Y., et al. New monitoring approach for metabolic dynamics in microbial ecosystems using stable-isotope-labeling technologies. J. Biosci. Bioeng. 110, 87-93 (2010).
- Nakanishi, Y., et al. Dynamic omics approach identifies nutrition-mediated microbial interactions. J. Proteome Res. 10, 824-836 (2011).
- Falkowski, P., Barber, R., Smetacek, V. Biogeochemical controls and feedbacks on ocean primary production. Science. 281, 200-207 (1998).
- Viant, M. R. Metabolomics of aquatic organisms: the new 'omics' on the block. Mar. Ecol. Prog. Ser. 332, 301-306 (2007).
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Evaluation of a semipolar solvent system as a step toward heteronuclear multidimensional NMR-based metabolomics for 13C-labeled bacteria, plants, and animals. Anal. Chem. 83, 719-726 (2011).
- Delaglio, F., et al. NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR. 6, 277-293 (1995).
- Wang, T., et al. Automics: an integrated platform for NMR-based metabonomics spectral processing and data analysis. BMC Bioinformatics. 10, 83 (2009).
- The R Project for Statistical Computing. , Available from: http://www.r-project.org/ (2010).
- Eldon, L., et al.
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Profiling polar and semipolar plant metabolites throughout extraction processes using a combined solution-state and high-resolution magic angle spinning NMR approach. Anal. Chem. 82, 1643-1652 (2011).
