Summary
Метод метаболитов извлечения из микробных сообществ планктона представлена. Всего выборки сообщества достигается путем фильтрации на специально подготовленных фильтров. После лиофилизации, водно-растворимых метаболитов выделяются. Такой подход позволяет для применения экологических метаболомики к транс-omics исследования природных и экспериментальных микробных сообществ.
Protocol
1. Подготовка фильтров для удаления экстрагируемых
- Использование 25-мм диаметром 0,22 мкм поры размером Durapore PVDF гидрофильные фильтры (Millipore). Место фильтры в чистом стакане 500 мл Pyrex с помощью пинцета. Предварительно промыть три раза дистиллированной водой. Swirl хорошо, как вы промыть, чтобы предотвратить фильтры от прилипания к друг другу. Добавить 300 мл Milli-Q (Millipore) или эквивалент высокого качества воды. Автоклав для облегчения полного удаления экстрагируемых из фильтров.
- Вылейте Milli-Q и снова промыть тройной фильтр, на этот раз с Milli-Q. С помощью пинцета место отдельные фильтры на чистую сухую поверхность (например, алюминиевой фольгой) и либо сухой по разумной температуры (например, 37 ° С) и сухой воздух. Фильтры готов к работе.
2. Фильтрация материала образца
- Для демонстрации этого протокола, сталь нержавеющая Millipore 3 место фильтр многообразие с 25-мм микроанализа фильтр столбцов со стеклом поддерживаети механический насос используется. Использование асептики, поместите одну 25-мм фильтра на фильтр базы колонке, применяются колонны и зажать вместе.
- Загрузить 15 мл образца на колонку, открыть запорный клапан на фильтре многообразие, и включить насос. Фильтр под мягкое давление, чтобы минимизировать разрыв клетки (<5 кПа). Другие насосы, таких как руки или перистальтического насоса могут быть адаптированы к этому протоколу. Для более низких образцы плотности, последовательное добавление воды может быть необходимым, не позволяйте фильтр сухой закон в течение длительного периода времени между добавлением воды.
- Для морских образцов, после того, как фильтруется ваш пример, вы можете выполнить дополнительную пресной воды промыть, чтобы уменьшить остаточную парамагнитных ионов в образце и на фильтре. Это может помочь в более точной настройке спектрометра магнита. Просто аккуратно добавить небольшое количество воды и фильтруют через собранных образцов в конце.
- После фильтрации закончится, выключите насос и оставьте клапан OPEя так до сих пор отрицательное давление в фильтре. Снимите зажим и фильтр столбцов.
- С одной стороны, использовать чистую пинцет, чтобы завладеть фильтра. Сложите фильтр по себе, а не возрастать. Другой рукой использовать губу стерильный 2 мл микроцентрифужных трубки удерживать фильтр. Отпустите пинцет затем использовать их повторно захватить оба края фильтра. Regrip на угол 45 ° в отчий дом.
- Поместите фильтр в 2-мл трубы и выпуска, так что открывается с образцом стороной внутрь. Вы можете разместить до двух фильтров в 2 мл стерильной микроцентрифужных трубы таким образом. При использовании двух фильтров, чтобы они перекрываются как можно меньше. Сразу заморозить (по крайней мере -30 ° C).
3. Добыча водно-растворимых метаболитов
- Lyophilize свои образцы на ночь или, по крайней мере 10 часов.
- После лиофилизации, добавить нержавеющей стали дробилки для каждой трубки (Tokken). Добавить 750 мкл стандартизированных калияфосфат ЯМР буфера в оксид дейтерия (2 H> 90%) с 2,2-диметил-2-silapentane-5-сульфонат (DSS), стандартный (KPI; 38,3 мМ KH 2 PO 4, 61.7 мМ K 2 HPO 4, 0,1 DSS мМ, рН 7,0, 90% D 2 O) 2.
- Разрушать ультразвуком образцов в течение 5 минут при температуре 4 ° С в воде sonicator (Bioruptor, Diagenode) для удаления клеточного материала из фильтра. Снимите фильтр с чистым пинцетом.
- Разрушать клетки, используя мельницу дробилку (1600 оборотов в минуту) в течение 5 минут.
- Инкубировать при температуре 65 ° C при встряхивании (1400 оборотов в минуту) на настольный шейкер (Eppendorf) в течение 15 минут.
- Снимите металлическую свинья с чистым пинцетом, и центрифуги образца при 13000 г в течение 5 минут.
- Слить надосадочную непосредственно к трубе ЯМР спектроскопии ЯМР.
4. ЯМР-спектроскопия и анализ данных
- Загрузите образец в ЯМР-спектрометра (здесь, Bruker DRX-500 Спектрометр оснащенTXI зонд с тройной осью градиента управляет компьютер XWIN-ЯМР).
- Получить 1D 1 H ЯМР с использованием соответствующих методов ранее опубликованные 2,15 от XWIN-ЯМР-интерфейс. В настоящем исследовании 1 Н-ЯМР-спектры записаны на DRX-500 спектрометр, работающий на 500,03 МГц при 298 К. Остаточное сигналов воды были подавлены Уотергейт последовательность импульсов с частотой повторения время 1,2 с. 128 переходных были собраны для получения 32 000 точек данных в спектре.
- Передача каталоги ЯМР данных на ПК установлена NMRPipe программное обеспечение 16. Обработка исходных данных и набор DSS как 0 промилле ссылки вручную фазы спектров. Оцифровка спектральных данных в набор дискретных значений путем интеграции или "биннинга" их с помощью программного обеспечения, таких как rNMR, Automics, или с помощью общедоступных FT2B пакет с сайта ECOMICS сети ( https://database.riken.jp/ecomics/ ) 3,17. В йявляется, например, спектры были интегрированы между 0,5 и 10,5 промилле на 0,032 промилле целостных областей использования ECOMICS, и нормированных либо DSS или суммарная интенсивность сигнала. Выходные данные теперь могут быть использованы для последующих статистического анализа, такие как анализ главных компонент (PCA) с помощью бесплатных пакетов программного обеспечения, как R 18.
5. Представитель Результаты
Пример 1 Н-ЯМР-спектры получены с помощью этих методов показано на рисунке 1. Эти образцы, от двух моментов времени микромира эксперимент показывает четкие различия из-за водорослей метаболической активности. 4-й день спектр показывает значительное обилие пиков, в частности, в диапазоне 3-4 частей на миллион по сравнению с 1-й день пробы. Эти пики можно объяснить сахара производится по цветущим диатомовых водорослей в микромире. В аналогичном эксперименте сравнения рост природных сообществ планктона в искусственной или натуральной морской воды, статистических подходов суч как основной компонент анализа (РСА) оценка участка, полученных от binned спектров ЯМР могут быть использованы, чтобы показать ясно метаболические различия между двумя методами лечения (рис. 2), в то время как загрузка участков можно определить пики в спектрах, что форма распределения данных . Такие результаты могут быть сопоставлены с данными других уровней omics, например, из геномной дактилоскопии методов (рис. 3). Эти пики ЯМР могут быть запрошены в индивидуальном порядке (например, на BMRB; http://www.bmrb.wisc.edu/ ) 19, или всего спектра могут быть проанализированы статистически (например, с SpinAssign на http://prime.psc.riken. JP /? = действие nmr_search ) 2. В этом примере различия между процедурами были связаны с обилием пиков в области сахара (3,39 промилле до 4,04 промилле) спектров из природного сообщества планктона метаболитов, а также несколько пиков, характерных для искусственной морской водой общины были предварительно язьntified как лактат и формиат использованием SpinAssign.
Рисунок 1. Представитель 1 H ЯМР спектры, полученные из образцов, обработанных с помощью этой процедуры. Микрокосм были взяты образцы до (день 1) и во время (день 4) интенсивное цветение диатомовых водорослей. ЯМР эксперименты проводились на Bruker DRX-500 сигналы нормированы на внутренний стандарт высоты пика (DSS, 0 промилле).
Рисунок 2. Основной компонент анализа (РСА), оценка участка для binned спектров ЯМР от metabolomes естественно, полученные микробным планктонных сообществ, выращенные в микрокосм с естественной (открытая алмазов) или искусственные (черные кружки) морской воды. Очистить метаболические различия можно наблюдать на диаграмме рассеяния. Загрузка участка из такого анализа могут быть использованы для идентификации различных пиков значениесистемы; эти пики могут быть в дальнейшем проанализированы по мере необходимости.
Рисунок 3. Примере нескольких omics анализ сочетания ЯМР геномных данных. Основной состав на основе денатурации электрофорез градиент геля 18S (слева) и 16S (справа) рРНК генов из тех же образцов, анализ которых на рисунке 2 также показывает различные модели микробного сообщества между физическими (открытый алмазов) и искусственные (черные кружки) морской микрокосм. Такое соответствие между метаболом и геном от природных систем демонстрирует полезность такого подхода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод фильтрации и метаболитов добычи продемонстрировали здесь позволяет микробной биомассы планктонных должны быть собраны в достаточном количестве для метаболомики ЯМР. В то время как только добыча водно-растворимых метаболитов на основе KPI и 1D 1 H ЯМР показал, другие растворители добычи и спектроскопические методы могут быть использованы. Одним из полезных примеров является использование дейтерированного метанола в качестве полу-полярного растворителя, который был показан для получения более высоких спектров ЯМР из разнородных образцов и менее чувствительны к загрязнению парамагнитных ионов, которые встречаются в пробах морских 15. В таком случае, осадок от добычи выше, должны быть сохранены для последующих извлечений. Наши предыдущие исследования показали стабильность спектров в такое время инкубации и температуры и пригодности прямой водной экстракции для ЯМР спектроскопии 15,20. Однако исследователи могут также предпочитают изменять добычу шаги, например, с помощью ДенаТьюринга шаг для инактивации ферментов до добычи, или с помощью быстрой закалки методы, которые отличаются от просто замораживания клеток, как показано здесь. Кроме того, в то время как методы, представленные здесь лучше всего подходит для наблюдения пропорционального изменения в метаболитов через лечение, при необходимости, фильтры могут быть предварительно взвешивают, а затем вес опять после фильтрации и лиофилизации образца для получения сухой вес или объем выборки фильтром может быть используются для получения количественных метаболит источника данных.
В конечном счете, полезность ЯМР для планктонных проб ограничено количество массы, которая может быть успешно собрали, и даже высокой плотности культуры может потребовать больших объемов (> 100 мл), чтобы получить достаточно сухой биомассы. Однако в экспериментальной базы, стабильный изотоп маркировки в микро-или мезокосмические эксперименты, 2D-1 H-13 C гетероядерных одной квантовой когерентности (HSQC) подходов. Кроме того, мы дополнительно использовали 47 -мм фильтров и 5 мл труб полипропиленовых, чтобы увеличить количество биомассы, которая может быть собрана для добычи, так как даже большие объемы могут быть необходимы (например,> 2 л) для природных сообществ от, например, олиготрофных водах, где клетки плотность низкая.
Фильтрация по выгодной центрифугирования, как это наше наблюдение, что некоторые небольшие микробных таксонов (особенно малых гетеротрофных бактерий) часто не гранулы хорошо. Фильтрация может осуществляться вручную в поле, и объемы фильтруется ограничены только количеством фильтров. Кроме того, избыток воды или средства массовой информации могут быть сняты в этой манере, и образцы можно промыть в случае необходимости. Конечно, даже с фильтрацией, собранных сообществом будет ограничен размер доли до среза фильтра, который в данном примере составляет 0,22 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано частично грантов-в-помощь по научным исследованиям для сложных поисковых исследований (JK), а также научных исследований (A) (JK и SM) от Министерства Образования, Культуры, Спорта, Науки и Технологии Японии . RIKEN FPR стипендий (RCE), при условии дополнительной поддержки. Авторы выражают благодарность д-ра. Eisuke Chikayama, Yasuyo Sekiyama и Мами Окамото для оказания технической помощи с помощью ЯМР и статистического анализа.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm hydrophilic Durapore PVDF filters, 25 mm | EMD Millipore | GVWP02500 | |
| Microanalysis Filter Holder, 25 mm, fritted glass support | EMD Millipore | XX1002500 | |
| 3-place manifold, 47 mm, stainless steel | EMD Millipore | XX2504735 | |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-04245 | |
| K2HPO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 164-04295 | |
| Deuterium oxide, 2H > 90% | Campridge Isotope Laboratoties | DLM-4 | |
| DSS | Fluka | 92754 | |
| Automill | Tokken | TK-AM4 | Stainless steel crushers included |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Vacuum evaporator | EYELA | CVE-3100 | |
| NMR | Bruker Corporation | DRX-500 with 5 mm-TXI probe | |
| Spectral binning tool | Originally developed | FT2DB | https://database.riken.jp/ecomics/ |
| Metabolite annotation tool and database | Originally developed | SpinAssign | http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search |
References
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: a critical review and future perspectives. Metabolomics. 5, 3-21 (2008).
- Chikayama, E., et al. Statistical indices for simultaneous large-scale metabolite detections for a single NMR spectrum. Anal. Chem. 82, 1653-1658 (2010).
- Lewis, I. A., Schommer, S. C., Markley, J. L. rNMR: open source software for identifying and quantifying metabolites in NMR spectra. Magn. Reson. Chem. 47, S123-S126 (2009).
- Li, M., et al. Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2117-2122 (2008).
- Mochida, K., Furuta, T., Ebana, K., Shinozaki, K., Kikuchi, J. Correlation exploration of metabolic and genomic diversity in rice. BMC Genomics. 10, 568 (2009).
- Fukuda, S., et al. Bifidobacteria can protect from enteropathogenic infection through production of acetate. Nature. 469, 543-547 (2011).
- Kikuchi, J., Hirayama, T. Practical aspects of stable isotope labeling of higher plants for a hetero-nuclear multi-dimensional NMR-based metabolomics. Methods Mol. Biol. 358, 273-286 (2007).
- Martin, F. P., et al. A top-down systems biology view of microbiome-mammalian metabolic interactions in a mouse model. Mol. Syst. Biol. 3, 112 (2007).
- Mahrous, E. A., Lee, R. B., Lee, R. E. A rapid approach to lipid profiling of mycobacteria using 2D HSQC NMR maps. J. Lipid Res. 49, 455-463 (2008).
- Fukuda, S., et al. Evaluation and characterization of bacterial metabolic dynamics with a novel profiling technique, real-time metabolotyping. PloS ONE. 4, e4893 (2009).
- Date, Y., et al. New monitoring approach for metabolic dynamics in microbial ecosystems using stable-isotope-labeling technologies. J. Biosci. Bioeng. 110, 87-93 (2010).
- Nakanishi, Y., et al. Dynamic omics approach identifies nutrition-mediated microbial interactions. J. Proteome Res. 10, 824-836 (2011).
- Falkowski, P., Barber, R., Smetacek, V. Biogeochemical controls and feedbacks on ocean primary production. Science. 281, 200-207 (1998).
- Viant, M. R. Metabolomics of aquatic organisms: the new 'omics' on the block. Mar. Ecol. Prog. Ser. 332, 301-306 (2007).
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Evaluation of a semipolar solvent system as a step toward heteronuclear multidimensional NMR-based metabolomics for 13C-labeled bacteria, plants, and animals. Anal. Chem. 83, 719-726 (2011).
- Delaglio, F., et al. NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR. 6, 277-293 (1995).
- Wang, T., et al. Automics: an integrated platform for NMR-based metabonomics spectral processing and data analysis. BMC Bioinformatics. 10, 83 (2009).
- The R Project for Statistical Computing. , Available from: http://www.r-project.org/ (2010).
- Eldon, L., et al.
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Profiling polar and semipolar plant metabolites throughout extraction processes using a combined solution-state and high-resolution magic angle spinning NMR approach. Anal. Chem. 82, 1643-1652 (2011).
