Summary
Mikrobiyal planktonik toplulukların metaboliti çıkarımı için bir yöntem sunulmaktadır. Tüm topluluk örnekleme özel hazırlanmış filtreler üzerine filtrasyon sağlanır. Liyofilizasyon sonra, sulu çözünür metabolitleri ekstre edilir. Bu yaklaşım doğal ya da deneysel mikrobiyal toplulukların trans-omik araştırmalar çevre metabolomik uygulaması için izin verir.
Abstract
Çevre metabolomik organizmalar cevap ve biyokimyasal 1. düzeyde çevre ve birbirleri ile nasıl etkileşime yeni bir anlayışın geliştirilmesinde bir gelişmekte olan bir alandır. Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi gibi çalışmalar için önemli vaadi ile, gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC-MS) dahil olmak üzere çeşitli teknolojileri biridir. NMR avantajları, hedefsiz analizler için uygundur yapısal bilgi sağlar ve spektrumları bireysel metaboliti spektrumları 2,3, son zamanlarda mevcut veri tabanları karşı niceliksel ve istatistiksel davranış içinde sorgulanabilir olmasıdır. Buna ek olarak, NMR spektral veriler birbirine taksonların fizyolojik yanıtları ve çevre 4,5,6 daha kapsamlı bir anlaşılmasını sağlamak için başka bir omik seviyeleri (örn. transkriptomik, genomik) veriler ile kombine edilebilir. Ancak, NMR zor yapma, diğer metabolomic yöntemlerine göre daha az duyarlı olduğu aphasta populasyonu düşük iyi tanımlanmış ve bu bütün dokuları, biofluids veya hücre kültürleri gibi kolayca ekstrakte kaynakları. metabolitlerin kıyasla düşük yoğunluklu ve metabolit konsantrasyonları olabilir doğal mikrobiyal sistemlerine kat Sonuç olarak, bugüne kadar yapılan mikropların birkaç doğrudan çevresel metabolomic çalışmalar, ana-symbiont sistemleri gibi kültür-tabanlı veya kolayca tanımlanan yüksek yoğunluklu ekosistemler, kararlı izotop etiketleme olabilir bağırsak çevre ko-kültür veya manipülasyonlar inşa sınırlı olmuştur Buna ek olarak NMR sinyalleri 7,8,9,10,11,12 artırmak için kullanılır. NMR için uygun konsantrasyonda çevresel metabolitlerinin konsantrasyonu ve toplanmasını kolaylaştırmak yöntemler eksiktir. Son dikkatini çok enerji ve malzeme akışının planktonik topluluk 13,14 aracılık su ortamında, içindeki organizmaların çevre metabolomik verilmiş olduğundan, biz konsantrasyon için bir yöntem geliştirdiTION ve süzülerek planktonik mikrobiyal sistemlerinden tam topluluk metabolitlerin çıkarma. Piyasada bulunan hidrofilik poli-1 ,1-difluoroethene (PVDF) filtreleri özel olarak tamamen aksi takdirde daha sonraki analizlerde kirleticiler gibi görünebilir özleri, kaldırmak için tedavi edilir. Bu tedavi filtreler daha sonra ilgi, çevresel ya da deney örnekleri filtrelemek için kullanılır. Islak numune filtreleri içeren liyofilize ve sulu-çözünür metabolitleri standart bir potasyum fosfat tampon ekstraksiyon 2 kullanılarak konvansiyonel NMR spektroskopisi için doğrudan ayıklanır. Bu yöntemlerden elde edilen veriler istatistiksel olarak anlamlı desenleri tanımlamak için analiz, ya da topluluk ve ekosistem fonksiyonlarının kapsamlı bir anlayış için diğer omik seviyeleri ile entegre edilebilir.
Protocol
1. Ekstrakte kaldırma Filtre Hazırlık
- 25-mm çapında 0.22 mikron gözenek boyutu Durapore PVDF hidrofilik filtreler (Millipore) kullanın. Temiz bir 500 ml Pyrex kabı koyun filtreler cımbız kullanarak. Damıtılmış su ile üç kez ön-yıkama. Eğer birbirine yapışmasını önlemek için durulama filtreleri gibi girdap. 300 ml Milli-Q (Millipore) ya da eşdeğeri yüksek kaliteli su ilave edilir. Filtreler ekstrakte tümüyle kaldırılmasını kolaylaştırmak için otoklavlayın.
- Milli-Q off dökün ve tekrar üçlü Milli-Q ile, bu kez filtreleri durulayın. Temiz ve kuru bir yüzey (alüminyum folyo gibi) ve makul bir sıcaklıkta (örneğin 37 ° C) veya kuru hava ya da kuru zeminde cımbız yerde bireysel filtrelerini kullanma. Filtreleri artık kullanıma hazır.
2. Örnek Malzeme Filtrasyon
- Cam destekler ile 25 mm mikroanaliz filtre sütunları ile bu protokol, bir Millipore paslanmaz çelik 3 yerinde filtre manifoldu göstermek içinve mekanik bir pompa kullanılır. Aseptik teknik kullanarak, filtre sütun kaidesi üzerinde tek bir 25 mm filtre koyun, sütun uygulamak ve birbirine kenetlenmiştir.
- , Sütun örneği 15 ml yükleyin filtre manifolduna stop-valf açılır ve pompa açın. Hücre kırılması (<5 kPa) en aza indirmek için hafif bir basınç altında filtre. Bu eli ya da bir peristaltik pompa gibi diğer pompaları, bu protokolü için uyarlanmış olabilmektedir. Düşük yoğunluklu örnekleri için, su arda eklemeler gerekli olabilir, filtrenin su eklemeler arasında uzun bir süre kuru gitmesine izin verme.
- Eğer numune filtre ettikten sonra deniz örnekleri için, isteğe bağlı bir tatlı su ürünleri örnek ve filtre üzerinde kalan paramanyetik iyonların azaltmak için durulama gerçekleştirebilirsiniz. Bu spektrometre mıknatısın daha hassas ayar ile yardımcı olabilir. Sadece hafifçe suyu küçük bir hacim kazandırmak ve sonunda toplanan örnek süzülür.
- Sonra filtreleme bittiğinde pompa kapatın ve vana ope terkn böylece altında filtre negatif basınç hala. Kelepçe ve filtre sütun çıkarın.
- Tek bir el ile, filtrenin beklemeye almak için temiz cımbız kullanın. Kendisi üzerinden filtre katlayın, ama kırışık yok. Diğer elinizle filtre aşağı tutmak için steril 2 ml mikrosantrifüj tüpü dudak kullanın. Filtre her iki kenarları yeniden kavramak için bunları kullanmak ve sonra cımbız bırakın. Kavuşturmak için bir 45 ° açıyla Regrip.
- Içeriye bakan örnek tarafında açılır böylece 2 ml tüp ve içine serbest filtre yerleştirin. Sen steril 2 ml mikrosantrifüj tüpü bu şekilde içine iki filtreye kadar yerleştirebilirsiniz. İki filtreleri kullanarak, bunlar mümkün olduğunca az örtüşme sağlamak. Hemen (en az -30 ° C) dondurma.
3. Sulu-çözünür Metabolitlerinin Ekstraksiyon
- Senin örnekleri gece boyunca veya en az 10 saat Lyophilize.
- Liyofilizasyon sonra, her bir tüp (Tokken) için bir paslanmaz çelik kırıcı ekleyebilir. 750 ul standart potasyum ekle2,2-Dimetil-2-silapentane-5-sülfonat (DSS) standardı (KPI ile döteryum oksit (2 H>% 90) fosfat NMR tampon; 38.3 mM KH 2 PO 4, 61.7 mM K 2 HPO 4, DSS 0.1 mM, pH 7.0,% 90 D 2 O) 2.
- Bir su içinde sonikatör ° C (Bioruptor, Diagenode) filtreden hücre malzemelerin ayrılması için 4, 5 dakika boyunca örnekleri sonikasyon. Temiz bir cımbız ile filtreleri çıkarın.
- 5 dakika için bir değirmen kırıcı (1600 rpm) ile hücreleri bozabilir.
- 15 dakika boyunca bir tezgah üst çalkalayıcı (Eppendorf) üzerine (1400 rpm) çalkalanarak 65 ° C'de inkübe edin.
- Temiz cımbızla metal domuz kaldırmak ve 5 dakika boyunca 13.000 g'de Örnek santrifüjlenir.
- NMR spektroskopisi bir NMR tüpü doğrudan süpernatant kapalı çizin.
4. NMR Spektroskopisi ve Veri Analizi
- (Burada, Bruker DRX-500 spektrometre ile donatılmış bir NMR spektrometresi içine örnek yükleyinXWIN-NMR çalıştıran bir bilgisayar) tarafından kontrol edilen üç eksenli gradient TXI prob.
- XWIN-NMR arayüzden uygun yöntemler, daha önce yayınlanmış 2,15 kullanılarak 1D 1 H-NMR spektrası elde. Bu çalışmada 1 H NMR spektrumları 1.2 s tekrarlama zamanı ile, Watergate darbe dizisi bastırılmıştır 298 K. Artan su sinyallere 500,03 MHz'de bir DRX-500 spektrometresi işletim kaydedildi. 128 geçici spektrum başına 32.000 veri noktası elde etmek için toplandı.
- NMRPipe yazılımı 16 yüklü bir PC'ye NMR verileri dizinleri aktarın. 0 ppm referans sonra el spektrumları faz olarak ham veri ve set DSS işleyin. Sayısallaştır entegre veya 'binning' onlar gibi rNMR, Automics üzere yazılım veya ECOMICS web sitesi (gelen halka açık FT2B paketini kullanarak ayrık değerler kümesi içine spektral verileri https://database.riken.jp/ecomics/ ) 3,17. Th, spektrumları 0.032 ppm ayrılmaz ECOMICS kullanarak bölgeler ve DSS veya toplam sinyal yoğunluğu ya normalize üzerinden 0,5 ile 10,5 ppm arasında örneğin entegre edildi edilir. Çıkış verileri şimdi bu tür R 18 gibi ücretsiz yazılım paketleri kullanılarak temel bileşenler analizi (PCA) olarak aşağı istatistiksel analiz için kullanılabilir.
5.. Temsilcisi Sonuçlar
1 H NMR spektrumları bir örneği, yukarıdaki yöntemlerin Şekil 1 'de gösterilmiştir kullanılarak elde edilmiştir. Bu örnekler, bir evren deney iki kez puan alg metabolik faaliyetleri nedeniyle belirgin farklılıklar göstermektedir. 4 gün spektrumu gün 1 örnek karşılaştırıldığında özellikle 3-4 ppm aralığında tepe önemli bolluk, gösterir. Bu zirveleri mikrokozmos içinde diatom çiçeklenme tarafından üretilen şekerler atfedilebilir. Yapay veya doğal deniz suyu ile doğal plankton topluluklarının büyümesini karşılaştırarak benzer bir deneyde, istatistiksel yaklaşımlar syükleme araziler spektrumu içinde zirveleri tespit olurken sağlıklı bir yer NMR türetilen temel bileşenler analizi (PCA) puanı komplo olarak uch, iki tedavi (Şekil 2) arasında belirgin metabolik farklılıklar göstermek için kullanılabilecek şekil veri dağıtım . Bu sonuçlar gibi genomik parmak izi yöntemleri gibi başka omik seviyeleri, (Şekil 3) gelen veri ile mukayese edilebilir. Bunlar NMR pikleri (BMRB örn. bireysel olarak sorgulanabilir http://www.bmrb.wisc.edu/ 19, ya da tüm spektrumu (at SpinAssign ile örneğin istatistiksel analiz edilebilir) http://prime.psc.riken. jp /? action = nmr_search ) 2. Bu örnekte, tedaviler arasındaki farklılıkları doğal plankton topluluğunun metabolitlerden spektrumlarının şekerler bölgede zirveleri bir bolluk (3.39 ppm 4.04 ppm) sonucu ortaya çıkmış ve yapay deniz suyu topluluklara karakteristik birkaç tepe geçici ide vardılaktat ve SpinAssign kullanarak format gibi ntified.
Şekil 1. Bu prosedür kullanılarak elde edilen işlenmiş örnekleri Örnek 1 H-NMR. Microcosm örnekleri öncesi (1. gün) ve (4 gün), yoğun bir diatom çiçeklenme sırasında alınmıştır. NMR deneyleri internal standart pik yüksekliği (; 0 ppm DSS) normalize sinyalleri ile bir Bruker DRX-500 üzerinde yapıldı.
Şekil 2. Doğal olan mikrokosmlarından yetiştirilen doğal kaynaklı mikrobiyal planktonik topluluklar (açık karo) veya yapay (siyah daireler) deniz suyu metabolomes gelen sağlıklı bir yer NMR için temel bileşenler analizi (PCA) skoru arsa. Açık bir metabolik farklılıklar saçılım görülebilir. Böyle bir analizden bir yükleme arsa daha sonra da önemini farklı zirveleri tanımlamak için kullanılabilirSistem; gerektiği gibi, bu zirveleri daha analiz edilebilir.
Şekil 3. Çok-omik analizi için bir örnek genomik NMR verileri ile birleştirilmesi. Topluluk kompozisyon denatüre edici gradient jel elektroforezi 18S (solda) ve Şekil 2'de analiz aynı örneklerde 16S (sağda) rRNA genlerinde göre de doğal (açık elmas) ve yapay (siyah daireler) deniz suyu mikrokosmlarından arasındaki farklı mikrobiyal toplum modellerini gösterir. Doğal sistemlerinden metabolome ve genom arasındaki bu yazışmalar bu yaklaşımın yararlılığı tanıtılmakta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada gösterildiği filtrasyon ve metaboliti ekstraksiyon yöntemi NMR metabolomik için yeterli miktarda toplanabilir üzere mikrobik planktonik biyokütle sağlar. KPI ve 1D 1 H-NMR kullanarak sulu bir çözünür metabolitlerinin, sadece ekstraksiyon gösterilmiştir birlikte, başka bir ekstraksiyon çözücüsü ve spektroskopik yaklaşımlar kullanılabilir. Bir yararlı örneğin heterojen örnekleri üstün NMR spektrumları üretmek için gösterilen ve paramanyetik iyonları tarafından kirlenmeye daha az hassas olduğu gibi deniz numuneler 15 bulunur edilmiş bir yarı-polar bir çözücü, döteryumlanmış olarak metanol kullanımıdır. Bu gibi durumlarda, yukarıda ekstraksiyonu pelet ardışık ekstraksiyon üzere saklanmalıdır. Daha önceki çalışmalar gibi kuluçka süreleri ve sıcaklıkları ve NMR spektroskopisi 15,20 doğrudan sulu ekstraksiyon uygunluğu altında spektrumlarının istikrar göstermiştir. Bununla birlikte, aynı zamanda, bir araştırmacı dena kullanılarak, örneğin, emme adımları değiştirmek için tercih edebilirönce çıkarılması için enzimler inaktif hale turing adım, ya da burada gösterildiği gibi sadece hücre dondurma farklı hızlı söndürme yöntemleri kullanarak. Burada sunulan yöntemleri en iyi istenirse, tedavileri boyunca metabolitleri oransal değişimi gözlemleyerek için uygundur ederken Ayrıca, filtreler önceden tartılmış edilebilir ve daha sonra kuru ağırlık, ya da olabilir filtre örnek hacmi elde etmek için numune filtrasyon ve liyofilizasyon sonra tekrar tartılır daha nicel metaboliti kaynak veri elde etmek için kullanılır.
Sonuçta, planktonik örnekler için NMR programını başarıyla toplanabilir kütle miktarı ile sınırlanmıştır; hatta yüksek yoğunluklu kültürler yeterli kuru biyokütle elde etmek için büyük hacimlerde (> 100 ml) gerekebilir. Bununla birlikte, mikro-veya mesocosm deneylerde deneysel bir çerçeve, izotop etiketleme içinde, 2B 1 H-13 C heteronükleer tek kuantum uyumluluk (HSQC) yaklaşımlar mümkündür. Ayrıca, biz ayrıca 47 kullandık -hatta daha büyük birimler olarak, ekstraksiyon için toplanabilir biyokütle miktarını artırmak için mm filtre ve 5 ml polipropilen tüpler hücre yoğunlukları düşüktür doğal topluluklar, örneğin oligotrofik suları için (yani> 2 L) gerekli olabilir.
Bazı daha küçük mikrobiyal takson (özellikle küçük heterotrofik bakteriler) çoğu saçma değil mi bizim gözlem olarak Filtrasyon santrifüj üzerinde avantajlıdır. Filtrasyon alanında elle yapılabilir, ve süzülmüş hacimleri yalnızca filtre numarası ile sınırlıdır. Buna ek olarak, fazla medya veya su bu şekilde uzaklaştırılabilir ve gerekirse örnekleri durulanır. Tabii ki, hatta filtrasyon ile toplanan topluluk bu örnekte 0.22 mikron olan filtre kesme, bir boyut fraksiyonu aşağı sınırlı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu araştırma kısmen desteklenen Hibeler-Aid Eğitim, Kültür, Spor, Bilim Bakanlığı keşif araştırma (JK), ve Bilimsel Araştırma (A) (JK ve SM) zorlu Bilimsel Araştırma ve Teknoloji, Japonya . Bir RIKEN FPR Bursu (RCE) ek destek sağlanmaktadır. Yazarlar Dr kendi şükranlarımı sunuyorum. Eisuke Chikayama, NMR ve istatistiksel analizler ile teknik yardım için Yasuyo Sekiyama ve Mami Okamoto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm hydrophilic Durapore PVDF filters, 25 mm | EMD Millipore | GVWP02500 | |
| Microanalysis Filter Holder, 25 mm, fritted glass support | EMD Millipore | XX1002500 | |
| 3-place manifold, 47 mm, stainless steel | EMD Millipore | XX2504735 | |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-04245 | |
| K2HPO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 164-04295 | |
| Deuterium oxide, 2H > 90% | Campridge Isotope Laboratoties | DLM-4 | |
| DSS | Fluka | 92754 | |
| Automill | Tokken | TK-AM4 | Stainless steel crushers included |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Vacuum evaporator | EYELA | CVE-3100 | |
| NMR | Bruker Corporation | DRX-500 with 5 mm-TXI probe | |
| Spectral binning tool | Originally developed | FT2DB | https://database.riken.jp/ecomics/ |
| Metabolite annotation tool and database | Originally developed | SpinAssign | http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search |
References
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: a critical review and future perspectives. Metabolomics. 5, 3-21 (2008).
- Chikayama, E., et al. Statistical indices for simultaneous large-scale metabolite detections for a single NMR spectrum. Anal. Chem. 82, 1653-1658 (2010).
- Lewis, I. A., Schommer, S. C., Markley, J. L. rNMR: open source software for identifying and quantifying metabolites in NMR spectra. Magn. Reson. Chem. 47, S123-S126 (2009).
- Li, M., et al. Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2117-2122 (2008).
- Mochida, K., Furuta, T., Ebana, K., Shinozaki, K., Kikuchi, J. Correlation exploration of metabolic and genomic diversity in rice. BMC Genomics. 10, 568 (2009).
- Fukuda, S., et al. Bifidobacteria can protect from enteropathogenic infection through production of acetate. Nature. 469, 543-547 (2011).
- Kikuchi, J., Hirayama, T. Practical aspects of stable isotope labeling of higher plants for a hetero-nuclear multi-dimensional NMR-based metabolomics. Methods Mol. Biol. 358, 273-286 (2007).
- Martin, F. P., et al. A top-down systems biology view of microbiome-mammalian metabolic interactions in a mouse model. Mol. Syst. Biol. 3, 112 (2007).
- Mahrous, E. A., Lee, R. B., Lee, R. E. A rapid approach to lipid profiling of mycobacteria using 2D HSQC NMR maps. J. Lipid Res. 49, 455-463 (2008).
- Fukuda, S., et al. Evaluation and characterization of bacterial metabolic dynamics with a novel profiling technique, real-time metabolotyping. PloS ONE. 4, e4893 (2009).
- Date, Y., et al. New monitoring approach for metabolic dynamics in microbial ecosystems using stable-isotope-labeling technologies. J. Biosci. Bioeng. 110, 87-93 (2010).
- Nakanishi, Y., et al. Dynamic omics approach identifies nutrition-mediated microbial interactions. J. Proteome Res. 10, 824-836 (2011).
- Falkowski, P., Barber, R., Smetacek, V. Biogeochemical controls and feedbacks on ocean primary production. Science. 281, 200-207 (1998).
- Viant, M. R. Metabolomics of aquatic organisms: the new 'omics' on the block. Mar. Ecol. Prog. Ser. 332, 301-306 (2007).
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Evaluation of a semipolar solvent system as a step toward heteronuclear multidimensional NMR-based metabolomics for 13C-labeled bacteria, plants, and animals. Anal. Chem. 83, 719-726 (2011).
- Delaglio, F., et al. NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR. 6, 277-293 (1995).
- Wang, T., et al. Automics: an integrated platform for NMR-based metabonomics spectral processing and data analysis. BMC Bioinformatics. 10, 83 (2009).
- The R Project for Statistical Computing. , Available from: http://www.r-project.org/ (2010).
- Eldon, L., et al.
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Profiling polar and semipolar plant metabolites throughout extraction processes using a combined solution-state and high-resolution magic angle spinning NMR approach. Anal. Chem. 82, 1643-1652 (2011).
