Summary
미생물 planktonic 커뮤니티에서 신진 대사 추출을위한 방법을 설명하고있다. 전체 지역 사회의 샘플링 특별히 준비 필터로 여과에 의해 이루어진다. lyophilization 후 수성 - 용해 metabolites가 추출됩니다. 이 접근법은 자연이나 실험적인 미생물 커뮤니티의 횡단 omics 조사에 환경 metabolomics의 적용을 허용합니다.
Abstract
환경 metabolomics는 유기체가 반응 및 생화 학적 수준 1의 환경과 서로 상호 작용하는 방법에 새로운 이해를 추진하고 신흥 분야이다. 핵 자기 공명 (NMR) 분광법은 공부에 대한 상당한 약속과 함께, 가스 크로마 토그래피 - 질량 분석계 (GC-MS) 등 여러 기술 중 하나입니다. NMR의 장점은, 타겟이 분명하지 않은 분석에 적합한 구조 정보를 제공하며 스펙트럼은 각각의 신진 대사 스펙트럼 2,3 최근에 사용 가능한 데이터베이스에 대한 양적 및 통계 매너에 쿼리할 수 있습니다. 또한, NMR 분광 데이터는 서로 taxa의 생리적 반응과 환경 4,5,6의보다 포괄적인 이해를 제공하기 위해 다른 omics 수준 (예 : transcriptomics, 유전체학)의 데이터와 조합하여 사용할 수 있습니다. 그러나 NMR은 어려운에게주고, 다른 metabolomic 기법 미만 구분 AP샘플 인구가 낮은 잘 정의와 같은 전체 조직, biofluids 또는 셀 - 문화 등 쉽게 추출물 소스.에서 metabolites에 비해 낮은 밀도와 신진 대사 농도가 될 수있는 천연 미생물 시스템에 플라이 따라서 날짜에 수행된 미생물의 몇 가지 직접적인 환경 metabolomic 연구는 이러한 호스트 symbiont 시스템과 같은 문화 기반 또는 쉽게 정의 고밀도 생태계, 안정 동위 원소 라벨이 될 수 직감 환경의 공동 문화 또는 조작 구축으로 제한되었습니다 또한 NMR 신호에게 7,8,9,10,11,12을 향상시키기 위해 사용됩니다. NMR에 적합한 농도로 환경 metabolites의 농도와 컬렉션을 촉진 방법은 부족합니다. 최근 관심이 많은 에너지와 물질의 흐름은 planktonic 커뮤니티 13,14에 의해 매개되는 수생 환경 내에서 생물의 환경 metabolomics 부여 되었기 때문에, 우리는 집중하는 방법을 개발했습니다기 및 여과에 의한 planktonic의 미생물 시스템과 전체 - 커뮤니티 metabolites의 추출. 상용 친수성 폴리-1 ,1-difluoroethene (PVDF) 필터는 특별히 완전히 달리 후속 분석에서 오염 물질이 나타날 수 extractables를 제거하는 처리됩니다. 이러한 처리 필터는 다음 관심있는 환경 또는 실험용 샘플을 필터링하는 데 사용됩니다. 젖은 샘플 자료가있는 필터는 동결 건조된이며 수성 - 용해 metabolites는 표준화된 칼륨 인산 추출 버퍼 2를 사용하여 기존의 NMR 분광법에 대해 직접적으로 압축이 풀립니다. 이러한 방법에서 파생된 데이터는 통계적으로 의미있는 패턴을 식별하는 분석, 또는 지역 사회와 생태계 기능의 포괄적인 이해를위한 다른 omics 수준과 통합 할 수 있습니다.
Protocol
1. Extractables를 제거하는 필터 준비
- 25-mm 직경 0.22 μm의 기공 크기 Durapore PVDF 친수성 필터 (Millipore)를 사용합니다. 깨끗한 500 ML Pyrex의 비커에 장소 필터 핀셋을 사용합니다. 증류수로 세 번 사전 린스. 당신은 서로 고집에서 필터를 방지하기 위해 린스로서 소용돌이. 300 ML 밀리 Q (Millipore) 또는 이에 상응하는 양질의 물을 추가합니다. 필터에서 extractables의 완전한 제거를 용이하게하기 위해 압력솥.
- 밀리 Q를 붓고 다시 트리플 밀리 Q와 함께, 이번에는 필터를 린스. 깨끗하고 건조한 표면 (예 : 알루미늄 호일 같은)과 합당한 온도 (예, 37는 ° C) 또는 공기 건조시 건조 중의 족집게 장소 개별 필터를 사용합니다. 필터를 사용할 수 있습니다.
2. 샘플 재질의 여과
- 유리가 지원과 함께 25 mm microanalysis 필터 컬럼으로이 프로토콜, Millipore 스테인리스 3 곳 필터 매니폴드를 입증할그리고 기계식 펌프가 사용됩니다. 무균 기술을 사용하여 필터를 열베이스에 단일 25-mm 필터를 추가, 컬럼을 적용하고 함께 클램프.
- , 컬럼에 시료의 15 ML을 로드할 필터 매니폴드에 정지 밸브를 열고 펌프를 켜십시오. 세포 파손 (<5 kPa)을 최소화하기 위해 부드러운 압력을 받고 필터링합니다. 그러한 손 또는 연동 펌프와 같은 다른 펌프는,이 프로토콜에 적용할 수 있습니다. 낮은 밀도의 샘플의 경우 물을 연속적으로 추가가 필요할 수 있습니다, 필터가 물을 첨가 사이의 오랜 기간 동안 건조한 놓지 않습니다.
- 당신의 시료를 여과 후 해양 샘플 들어, 선택적 담수가 샘플과 필터에 잔류 상자 성체의 이온을 줄이기 위해 린스 수행할 수 있습니다. 이것은 분광계 자석보다 정확한 튜닝에 도움이 될 수 있습니다. 간단히 부드럽게 물을 작은 볼륨을 추가하고 마지막 부분에서 수집된 샘플을 통해 필터링합니다.
- 일단 필터링이 완료되면 펌프를 끄고 밸브 ope를 떠나N 그래서 필터 부정적인 압력은 여전히있다. 클램프 및 필터 열을 제거합니다.
- 한손으로, 필터의 보류를 데리고 깨끗한 핀셋을 사용합니다. 그 자체를 통해 필터를 접어하지만 포복 절도하지. 다른 손으로 필터를 누르고 멸균 2-ML microcentrifuge 튜브의 입술을 사용합니다. 필터의 양쪽 가장자리를 다시 놓치 않으이를 사용 후 족집게를 놓습니다. 접이식으로 45 ° 각도에서 Regrip.
- 그것이 안쪽을 향하게 샘플 측면과 함께 열립니다 있도록 2-ML 관과 버전에 필터를 놓습니다. 당신은 멸균이 ML의 microcentrifuge 튜브 이렇게 둘이 필터를 넣을 수 있습니다. 이 필터를 사용하는 경우, 그들은 가능한 한 조금은 중복 보장합니다. 즉시 (최소 -30 ° C)에 고정.
3. 수성 - 수용성 Metabolites의 추출
- 샘플의 하룻밤 혹은 적어도 10 시간을 Lyophilize.
- lyophilization 후, 각 튜브 (Tokken)에 스테인레스 스틸 분쇄기를 추가합니다. 750 μl 표준화된 칼륨 추가2,2 - 디메틸 -2 - silapentane-5-산염 (DSS) 표준 (KPI와 중수소 산화 (2 H> 90 %)의 인산염 NMR 버퍼, 38.3 MM KH 2 PO 4, 61.7 MM K 2 HPO 4, DSS 0.1 MM, 산도 7.0, 90 % D 2 O) 2.
- 물 sonicator에서 ° C (Bioruptor, Diagenode)이 필터에서 세포 물질을 제거하려면 4에서 5 분 샘플을 Sonicate. 깨끗한 핀셋으로 필터를 제거합니다.
- 5 분 밀 분쇄기 (1600 RPM)를 사용하여 세포를 중단.
- 15 분 동안 벤치 위로 흔드는 (Eppendorf)에 (1,400 RPM) 흔들림으로 65 ° C에서 품어.
- 깨끗한 핀셋으로 금속 돼지를 제거하고 5 분 13,000그램에서 샘플을 원심 분리기.
- NMR 분광법을위한 NMR 튜브에 직접 뜨는을 분산.
4. NMR 분광학 및 데이터 분석
- (여기서, Bruker DRX-500 분광계가 장착된 NMR 분광계로 샘플을로드XWIN-NMR을 실행하는 컴퓨터)에 의해 제어 트리플 축 기울기와 TXI 프로브.
- XWIN-NMR 인터페이스에서 적절한 이전에 다음 ID로 출판 방법에게 2,15를 사용하여 1D 1 H NMR의 스펙트럼을 구합니다. 현재 연구 1 H NMR 스펙트럼은 1.2 s의 반복 시간과 함께 워터 게이트 펄스 시퀀스에 의해 억압 받고 있었다 298 K. 잔여 물이 신호에서 500.03 MHz로 DRX-500 분광계 운영에 기록되었다. 128 과도는 스펙트럼 당 32,000 데이터 포인트를 얻기 위해 수집되었다.
- NMRPipe 소프트웨어 16 설치된 PC에 NMR 데이터 디렉토리를 전송합니다. 0 PPM 참조 그런 다음 수동으로 스펙트럼을 단계적으로 폐지로 원시 데이터와 설정 DSS를 처리합니다. 디지털화 통합 또는 'binning'그들을 같은 rNMR, Automics와 같은 소프트웨어와 함께, 또는 ECOMICS 웹 사이트 (에서 공개 FT2B 패키지를 사용하여 개별 값의 집합으로 스펙트럼 데이터 https://database.riken.jp/ecomics/ ) 3,17. 일 년, 스펙트럼은 0.032 PPM 통합 ECOMICS를 사용하는 지역 및 DSS 또는 전체 신호 강도 중 하나에 대한 표준을 통해 0.5 및 10.5 PPM 사이에 예를 들어 통합되었다 있습니다. 출력 데이터는 이제 이러한 연구 18 같은 무료 소프트웨어 패키지를 사용하는 주요 구성 요소 분석 (PCA)와 같은 다운 스트림 통계 분석을 위해 사용될 수 있습니다.
5. 대표 결과
1 H NMR의 스펙트럼의 예제는 위의 방법은 그림 1에 표시된 사용하여 획득하였습니다. 이러한 샘플은 소우주 실험의 두 시간이 지점에서 algal 신진 대사 활동으로 인해 명확한 차이점을 보여줍니다. 4 일 스펙트럼은 1 일 샘플에 비해 특히 3-4 PPM 범위에서 피크의 상당한 풍요로움을 보여줍니다. 이 봉우리는 소우주 내에서 규조류는을 피는 제작한 설탕에 의한 것이 있습니다. 인공 또는 자연 해수의 천연 플랑크톤 커뮤니티의 성장을 비교 유사한 실험에서 통계적 접근 방식의로딩 플롯은 스펙트럼 내에서 봉우리를 식별할 수있는 반면 binned NMR의 스펙트럼에서 파생된 주요 구성 요소 분석 (PCA) 점수 줄거리 등 uch는 두 개의 트리 트먼트 (그림 2) 사이의 명확한 대사의 차이를 표시하는 데 사용할 수있는 형상 데이터의 분포 . 이러한 결과는 같은 게놈 지문 채취 기법에서 같은 다른 omics 수준, (그림 3)에서 데이터와 비교할 수 있습니다. ; 이러한 NMR의 피크는 (BMRB에서 예 개별적으로 질의를 할수 http://www.bmrb.wisc.edu/ 19 일, 또는 전체 스펙트럼은 (시 SpinAssign있는 등 통계적으로 분석할 수) http://prime.psc.riken. JP /? 조치 = nmr_search ) 2. 이 예제에서는 트리 트먼트의 차이점은 천연 플랑크톤 커뮤니티 metabolites의 스펙트럼의 설탕 지역의 봉우리 풍부한 (3.39 PPM으로 4.04 PPM)에 의한 것이라하고, 인공 해수 사회에 특징적인 여러 봉우리가 미정 IDE 있었다락테이트 및 SpinAssign를 사용하여 편대로 ntified.
그림 1.이 절차를 사용하여 처리 표본에서 얻은 대표 1 H NMR의 스펙트럼. 소우주 샘플은 이전에 (매일 1) 및 (4 일) 강렬한 diatom의 개화 중에 찍은 사진. NMR 실험은 내부 표준 피크의 높이 (; 0 PPM DSS)으로 정규화 신호로 Bruker DRX-500에서 수행되었다.
그림 2. 자연과 함께 microcosms 재배 자연스럽게 - 파생 미생물의 planktonic 커뮤니티 (오픈 다이아몬드) 또는 인공 (블랙 서클) 해수의 metabolomes에서 binned NMR의 스펙트럼을위한 주요 구성 요소 분석 (PCA) 점수 플롯. 클리어 신진 대사의 차이는 scatterplot에서 볼 수 있습니다. 이러한 분석에서 로딩 음모 그 다음에 중요성을 별개의 봉우리를 식별하는 데 사용될 수시스템은, 필요에 따라 이들 봉우리들은 더 이상 분석할 수 있습니다.
그림 3. 멀티 omics 분석의 예제는 게놈 데이터와 NMR을 결합. 커뮤니티 조성은 denaturing 기울기 겔 18S의 전기 영동 (왼쪽)와 그림 2에서 분석하는 것과 같은 샘플에서 16 (오른쪽) rRNA의 유전자를 기반으로 또한 자연 (오픈 다이아몬드)과 인공 (검은색 원) 해수 microcosms 사이에 별개의 미생물 커뮤니티의 패턴을 보여줍니다. 자연 시스템의 metabolome과 게놈 사이의 이러한 대응은이 접근법의 유용성을 보여줍니다.
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Discussion
여기서 보여준 여과 및 신진 대사 추출 방법은 NMR의 metabolomics에 충분한 금액을 회수하기 위해 미생물 planktonic의 바이오 매스를 얻을 수 있습니다. KPI 및 1D 1 H NMR을 사용하여 수성 - 용해 metabolites만을 추출을 시연하는 동안 다른 추출 용매와 spectroscopic 방법을 사용할 수 있습니다. 하나의 유용한 예제는 이기종 샘플에서 우수한 NMR의 스펙트럼을 생산하기 위해 그림과 상자 성체의 이온에 의한 오염에 덜 민감로서 해양 시료 15 발견되었습니다 세미 극지 용매와 같은 진정제를 맞았을 메탄올의 사용이다. 이런 경우에는 위의 추출의 펠렛은 연속 extractions 보관하여야한다. 우리의 이전 작업은 배양 시간 및 온도와 NMR 분광법 15-20에 대한 직접적인 수성 추출의 적합성 아래 스펙트럼의 안정성을 보이지 않고있다. 그러나 연구자는 또한 dena를 사용하여 예를 들어, 추출 단계를 수정하는 것이 좋습니다이전 추출에 효소를 inactivate하는 튜링 단계, 또는 여기에 그림과 같이 단순히 세포를 냉동과 다를 급속한-담금질 방법을 사용하여. 여기에 제시된 방법이 최고의 원하는 경우 치료 전반에 걸쳐 metabolites에 비례 변화를 관찰하기에 적합하면서 또한, 필터는 미리 무게하실 수 있습니다 다음 건조 중량, 또는 될 수 필터링 샘플의 볼륨을 얻기 위해 시료 여과 및 lyophilization 후 다시 무게 보다 양적 신진 대사 원본 데이터를 얻기 위해 사용됩니다.
결국, planktonic 샘플에 대한 NMR의 유틸리티가 성공적으로 수집될 수있는 대량의 양에 의해 제약되며 심지어는 고밀도의 문화는 충분한 건조 바이오 매스를 얻기 위해 대량 (> 100 ML)가 필요할 수도 있습니다. 그러나, 마이크로 또는 mesocosm 실험에서 실험적인 프레임 워크, 안정 동위 원소 라벨 내에서, 2D 1 H-13 C 헤테로핵 단일 양자 결맞음 (HSQC) 접근이 가능합니다. 더 나아가, 우리는 추가로 47을 사용했습니다 -심지어 더 큰 볼륨으로, 추출을 위해 수집됩니다 바이오 매스의 양을 증가시킬 mm 필터 및 5-ML 폴리 프로필렌 튜브가 세포 밀도가 낮으로부터 천연 사회, 예를 들어 oligotrophic 바다를 위해 (즉,> 2 패) 할 수도 있습니다.
그것이 약간 더 작은 미생물의 taxa이 (특히 소규모 heterotrophic 박테리아) 종종 잘 펠릿하지 않는 것이 우리의 관측이기 때문에 여과가 원심 분리 넘는 유리입니다. 여과는 현장에서 수동으로 수행할 수 있으며, 여과 볼륨에서만 사용할 필터의 수에 의해 제한됩니다. 또한, 초과 미디어 물이 방법으로 제거할 수 있으며, 필요한 경우 샘플은 씻어서 수 있습니다. 물론, 심지어 여과으로 수집 공동체는이 예제에서 0.22 μm의가 필터 컷오프에 크기 분율로 제한됩니다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
본 연구에 의해 부분적으로 지원되었다 보조금-원조 교육, 문화, 스포츠, 과학 기술부에서 답사의 연구 (JK) 및 학술 연구 (A) (JK 및 SM)에 도전을위한 과학 연구, 기술, 일본 . RIKEN FPR 교제 (경찰과)이 추가 지원을 제공했습니다. 저자는 Drs들에게 감사드립니다. Eisuke Chikayama, NMR 및 통계 분석과 기술 지원을 Yasuyo Sekiyama와 마미 오카모토.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm hydrophilic Durapore PVDF filters, 25 mm | EMD Millipore | GVWP02500 | |
| Microanalysis Filter Holder, 25 mm, fritted glass support | EMD Millipore | XX1002500 | |
| 3-place manifold, 47 mm, stainless steel | EMD Millipore | XX2504735 | |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-04245 | |
| K2HPO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 164-04295 | |
| Deuterium oxide, 2H > 90% | Campridge Isotope Laboratoties | DLM-4 | |
| DSS | Fluka | 92754 | |
| Automill | Tokken | TK-AM4 | Stainless steel crushers included |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Vacuum evaporator | EYELA | CVE-3100 | |
| NMR | Bruker Corporation | DRX-500 with 5 mm-TXI probe | |
| Spectral binning tool | Originally developed | FT2DB | https://database.riken.jp/ecomics/ |
| Metabolite annotation tool and database | Originally developed | SpinAssign | http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search |
References
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: a critical review and future perspectives. Metabolomics. 5, 3-21 (2008).
- Chikayama, E., et al. Statistical indices for simultaneous large-scale metabolite detections for a single NMR spectrum. Anal. Chem. 82, 1653-1658 (2010).
- Lewis, I. A., Schommer, S. C., Markley, J. L. rNMR: open source software for identifying and quantifying metabolites in NMR spectra. Magn. Reson. Chem. 47, S123-S126 (2009).
- Li, M., et al. Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2117-2122 (2008).
- Mochida, K., Furuta, T., Ebana, K., Shinozaki, K., Kikuchi, J. Correlation exploration of metabolic and genomic diversity in rice. BMC Genomics. 10, 568 (2009).
- Fukuda, S., et al. Bifidobacteria can protect from enteropathogenic infection through production of acetate. Nature. 469, 543-547 (2011).
- Kikuchi, J., Hirayama, T. Practical aspects of stable isotope labeling of higher plants for a hetero-nuclear multi-dimensional NMR-based metabolomics. Methods Mol. Biol. 358, 273-286 (2007).
- Martin, F. P., et al. A top-down systems biology view of microbiome-mammalian metabolic interactions in a mouse model. Mol. Syst. Biol. 3, 112 (2007).
- Mahrous, E. A., Lee, R. B., Lee, R. E. A rapid approach to lipid profiling of mycobacteria using 2D HSQC NMR maps. J. Lipid Res. 49, 455-463 (2008).
- Fukuda, S., et al. Evaluation and characterization of bacterial metabolic dynamics with a novel profiling technique, real-time metabolotyping. PloS ONE. 4, e4893 (2009).
- Date, Y., et al. New monitoring approach for metabolic dynamics in microbial ecosystems using stable-isotope-labeling technologies. J. Biosci. Bioeng. 110, 87-93 (2010).
- Nakanishi, Y., et al. Dynamic omics approach identifies nutrition-mediated microbial interactions. J. Proteome Res. 10, 824-836 (2011).
- Falkowski, P., Barber, R., Smetacek, V. Biogeochemical controls and feedbacks on ocean primary production. Science. 281, 200-207 (1998).
- Viant, M. R. Metabolomics of aquatic organisms: the new 'omics' on the block. Mar. Ecol. Prog. Ser. 332, 301-306 (2007).
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Evaluation of a semipolar solvent system as a step toward heteronuclear multidimensional NMR-based metabolomics for 13C-labeled bacteria, plants, and animals. Anal. Chem. 83, 719-726 (2011).
- Delaglio, F., et al. NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR. 6, 277-293 (1995).
- Wang, T., et al. Automics: an integrated platform for NMR-based metabonomics spectral processing and data analysis. BMC Bioinformatics. 10, 83 (2009).
- The R Project for Statistical Computing. , Available from: http://www.r-project.org/ (2010).
- Eldon, L., et al.
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Profiling polar and semipolar plant metabolites throughout extraction processes using a combined solution-state and high-resolution magic angle spinning NMR approach. Anal. Chem. 82, 1643-1652 (2011).
