Summary
En metode for metabolitten utvinning fra mikrobielle planktoniske samfunn blir presentert. Hele samfunnet prøvetaking oppnås ved filtrering på spesielt forberedt filtre. Etter lyophilization, blir vandig vannløselige metabolitter ut. Denne tilnærmingen gjør det mulig for anvendelse av miljø metabolomics til trans-omics undersøkelser av natur-eller eksperimentelt mikrobielle samfunn.
Abstract
Environmental metabolomics er et voksende felt som er fremme ny forståelse i hvordan organismer reagerer på og samhandle med omgivelsene og hverandre på den biokjemiske nivå 1. Nukleær magnetisk resonans (NMR) spektroskopi er en av flere teknologier, blant annet gasskromatografi-massespektrometri (GC-MS), med betydelige løftet for slike studier. Fordeler med NMR er at det er egnet for vilkårlige analyser, gir strukturell informasjon og spektra kan spørres i kvantitative og statistiske oppførsel mot nylig tilgjengelige databaser av individuell metabolitten spektra 2,3. I tillegg kan NMR spektrale data kombineres med data fra andre omics nivåer (f.eks transcriptomics, genomikk) for å gi en mer helhetlig forståelse av de fysiologiske responser taxa på hverandre og miljøet 4,5,6. Imidlertid er NMR mindre følsom enn andre metabolomic teknikker, noe som gjør det vanskelig å apply til naturlige mikrobielle systemer der utvalg bestander kan være lav tetthet og metabolitt konsentrasjoner lavt i forhold til metabolitter fra veldefinerte og lett utvinnbare kilder som hele vev, biofluids eller celle-kulturer. Følgelig har de få direkte miljømessige metabolomic studier av mikrober utført hittil vært begrenset til kultur-baserte eller lett definert med høy tetthet økosystemer som host-symbiont systemer, konstruerte co-kulturer eller manipulasjoner av tarmen miljø hvor stabile isotop merking kan være i tillegg brukes til å forbedre NMR signaler 7,8,9,10,11,12. Metoder som fremmer konsentrasjonen og innsamling av miljø metabolitter ved konsentrasjoner egnet for NMR mangler. Siden siste oppmerksomhet har blitt gitt til de miljømessige metabolomics av organismer i vannmiljøet, hvor mye av energien og materialflyt er mediert av det planktoniske samfunnet 13,14, har vi utviklet en metode for konsentrasjonsjon og uttak av hel-samfunnet metabolitter fra planktoniske mikrobielle systemer ved filtrering. Kommersielt tilgjengelige hydrofile poly-1 ,1-difluoroethene (PVDF) filtre er spesielt behandlet for å fjerne ekstraherbare, som ellers kan synes som forurensninger i påfølgende analyser. Disse behandles filtrene blir så brukt til å filtrere miljømessige eller eksperimentelle prøver av interesse. Filtre som inneholder den våte prøvematerialet er lyofilisert og vandig-løselige metabolitter er hentet direkte for konvensjonell NMR-spektroskopi ved hjelp av et standardisert kaliumfosfat utvinning buffer to. Dataene fra disse metodene kan analyseres statistisk for å identifisere meningsfulle mønstre, eller integreres med andre omics nivåer for helhetlig forståelse av samfunnet og økosystem funksjon.
Protocol
1. Filter Forberedelse til Fjern Ekstraherbare
- Bruk 25 mm diameter 0,22 mikrometer pore-size Durapore PVDF hydrofile filtre (Millipore). Plasser filtrene i en ren 500 ml Pyrex begerglass med pinsett. Pre-skyll tre ganger med destillert vann. Swirl vel som du skyller å hindre at filtrene kleber seg til hverandre. Legg 300 ml Milli-Q (Millipore) eller tilsvarende høy kvalitet vann. Autoklaver til rette for fullstendig fjerning av ekstraherbare fra filtrene.
- Hell av Milli-Q og igjen trippel skyll filtrene, denne gangen med Milli-Q. Bruk pinsett sted individuelle filtre på en ren tørr overflate (for eksempel aluminiumsfolie) og enten tørr ved en fornuftig temperatur (f.eks 37 ° C) eller lufttørke. Filtrene er nå klar til bruk.
2. Filtrering av prøvemateriale
- For å demonstrere denne protokollen, en Millipore rustfritt stål 3-plass filter manifold med 25 mm-mikroanalyse filter kolonner med glass støtterog en mekanisk pumpe er brukt. Ved hjelp av aseptisk teknikk, plassere en enkelt 25-mm filter på filteret kolonnen basen, gjelder kolonnen og klemme sammen.
- Load 15 ml av prøven til kolonnen, åpne stop-ventilen på filteret manifold, og slå på pumpen. Filter under forsiktig press for å minimere celle brudd (<5 kPa). Andre pumper, for eksempel hånd eller en peristaltiske pumpen kan tilpasses denne protokollen. For lavere tetthet prøver, kan suksessive tillegg av vann være nødvendig, ikke la filteret gå tørr for en lengre periode mellom tilførsler av vann.
- For marine prøver, etter at du har filtrert prøven din, kan du utføre en valgfri ferskvann skylling for å redusere gjenværende paramagnetisk ioner i prøven og på filteret. Dette kan bidra med mer presis tuning av spektrometeret magnet. Bare tilsett en liten mengde vann og filtrere gjennom innsamlet prøven på slutten.
- Når filtrering er ferdig, slå av pumpen, og la ventilen open så er det fortsatt negativt press under filteret. Fjern klemmen og filter kolonne.
- Med en hånd, bruk ren pinsett til å ta tak i filteret. Brett filteret over selv, men gjør ikke krøll. Med den andre hånden bruker leppe av en steril 2-ml mikrosentrifuge tube å holde nede filter. Slipp pinsett deretter bruke dem til å re-grep begge kantene av filteret. Regrip i 45 ° vinkel til folden.
- Sett filteret inn i 2-ml tube og slipp så det åpner med prøven vendt innover. Du kan plassere opptil to filtre i det sterile 2 ml mikrosentrifuge tube denne måten. Hvis du bruker to filtre, sikre at de overlapper så lite som mulig. Umiddelbart fryse (minst -30 ° C).
3. Utvinning av vannholdige-løselige Metabolitter
- Lyophilize dine prøver over natten eller i minst 10 timer.
- Etter lyophilization, legge et rustfritt stål knuser i hvert rør (Tokken). Legg 750 mL standardisert kaliumfosfat NMR buffer i deuterium oksid (2 H> 90%) med 2,2-Dimethyl-2-silapentane-5-sulfonat (DSS) standard (KPI; 38,3 mM KH 2 4 PO, 61,7 mM K 2 HPO 4, 0,1 DSS mM, 7,0 pH, 90% D 2 O) 2.
- Sonicate prøvene i 5 minutter ved 4 ° C i et vann sonicator (Bioruptor, Diagenode) for å fjerne celle materiale fra filteret. Fjern filtrene med rene pinsett.
- Forstyrre cellene ved hjelp av en mølle Crusher (1600 rpm) i 5 minutter.
- Inkuber ved 65 ° C med risting (1400 rpm) på en benk-top shaker (Eppendorf) i 15 minutter.
- Fjern metall grisen med rene pinsett, og sentrifuger prøven på 13 000 g for 5 minutter.
- Tegn av supernatanten direkte til en NMR rør for NMR-spektroskopi.
4. NMR spektroskopi og dataanalyse
- Legg prøven i en NMR spektrometer (her, en Bruker DRX-500 spektrometer utstyrt medTXI probe med trippel-aksen gradienten styres av en datamaskin som kjører XWIN-NMR).
- Skaff 1D 1 H NMR spektra ved hjelp av egnede tidligere publiserte metoder 2,15 fra XWIN-NMR-grensesnitt. I den foreliggende studien 1 H NMR spektra ble spilt inn på en DRX-500 spektrometer som opererer på 500,03 MHz ved 298 K. restvann signalene ble undertrykt av Watergate puls sekvens, med en repetisjon tid på 1,2 s. 128 transienter ble samlet for å skaffe 32.000 datapunkter per spektrum.
- Overfør NMR data katalogene til en PC installert NMRPipe programvare 16. Behandle rådata og sett DSS som 0 ppm referanse deretter manuelt fase spektrene. Digitalisere de spektrale data i et sett av diskrete verdier ved å integrere eller 'Binning "dem med programvare som rNMR, Automics, eller bruke offentlig tilgjengelige FT2B pakken fra ECOMICS nettsiden ( https://database.riken.jp/ecomics/ ) 3,17. I ther eksempel ble spektre integrert mellom 0,5 og 10,5 ppm over 0,032 ppm integrerte regioner ved hjelp ECOMICS, og normalisert til enten DSS eller total signal intensitet. Utdata kan nå brukes til nedstrøms statistisk analyse som rektor komponenter analyse (PCA) med fri programvare-pakker som R 18.
5. Representative Resultater
Et eksempel på en H NMR spektra bruker metodene ovenfor er vist i figur 1. Disse prøvene, fra to tidspunkter i et mikrokosmos eksperiment viser klare forskjeller som skyldes alge metabolske aktiviteter. Dagen fire spekteret viser betydelig overflod av topper, særlig i 3-4 ppm rekkevidde i forhold til den dagen en prøve. Disse toppene kan tilskrives sukker produsert av reflekser kiselalger i mikrokosmos. I en tilsvarende eksperiment sammenligne veksten av naturlige plankton samfunn i kunstige eller naturlig sjøvann, statistiske tilnærminger sUCH som prinsipal komponent analyse (PCA) score tomten stammer fra binned NMR spektra kan brukes til å vise klare metabolske forskjeller mellom de to behandlingene (Fig. 2), mens lasting tomter kan identifisere topper i spektrene at formen fordelingen av dataene . Slike resultater kan sammenlignes med data fra andre omics nivåer, for eksempel fra genomisk fingerprinting metoder (Fig. 3). Disse NMR topper kan spørres individuelt (f.eks ved BMRB; http://www.bmrb.wisc.edu/ ) 19, eller hele spektre kan analyseres statistisk (f.eks med SpinAssign på http://prime.psc.riken. jp /? action = nmr_search ) 2. I dette eksempelet var forskjeller mellom behandlingene på grunn av en overflod av toppene i sukker regionen (3,39 ppm til 4,04 ppm) av spektra fra naturlige plankton samfunnet metabolitter, og flere topper karakteristiske til de kunstige sjøvann samfunnene var tentativt identified som laktat og formate hjelp SpinAssign.
Figur 1. Representant 1 H NMR spektra fra prøvene som ble prosessert ved hjelp av denne prosedyren. Mikrokosmos prøver ble tatt før (dag 1) og under (dag 4) en intens diatom blomst. NMR eksperimenter ble utført på en Bruker DRX-500 med signaler normalisert til intern standard topphøyde (DSS; 0 ppm).
Figur 2. Prinsipal komponent analyse (PCA) score tomt for binned NMR spektra fra metabolomes av naturlig framstilt mikrobielle planktoniske samfunn dyrket i mikrokosmos med naturlig (åpne ruter) eller kunstige (svarte sirkler) sjøvann. Klare metabolske forskjeller kan observeres i scatterplot. En lasting tomt fra en slik analyse kan deretter brukes til å identifisere forskjellige topper av betydning isystemet, og disse toppene kan bli ytterligere analysert etter behov.
Figur 3. Et eksempel på multi-omics analyse kombinere NMR med genomisk data. Fellesskapet sammensetning basert på denaturering gradient gel elektroforese av 18S (til venstre) og 16S (høyre) rRNA gener fra de samme prøvene som er analysert i figur 2 viser også tydelige mikrobielle samfunn mønstre mellom naturlige (åpne diamanter) og kunstige (svarte sirkler) sjøvann mikrokosmos. Slik korrespondanse mellom metabolome og genomet fra naturlige systemer demonstrerer nytten av denne tilnærmingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Filtrering og metabolitten utvinning metoden demonstrert her gjør for mikrobiell planktoniske biomasse skal samles i tilstrekkelig mengde for NMR metabolomics. Mens bare utvinning av vandig-løselige metabolitter ved hjelp av KPI og 1D 1 H NMR blir demonstrert, kan andre utvinning løsemidler og spektroskopiske metoder benyttes. Et nyttig eksempel er bruken av deuterert metanol som en semi-polart løsningsmiddel, som har vist seg å produsere overlegen NMR spektra fra heterogene prøver og er mindre følsom for forurensning av paramagnetisk ioner som finnes i marine prøver 15. I slike tilfeller bør pellet fra utvinning ovenfor beholdes for etterfølgende ekstraksjon. Vårt tidligere arbeid har vist stabilitet spektrene under slike inkubasjonstider og temperaturer og egnethet direkte vandig uttrekk for NMR-spektroskopi 15,20. Men forskerne kan også foretrekke å endre utvinning trinn, for eksempel ved hjelp av en denaTuring skritt for å inaktivere enzymer før utvinning, eller ved hjelp av rask-slukkende metoder som skiller seg fra bare å fryse cellene som vist her. I tillegg, mens metodene som presenteres her er best egnet for å observere proporsjonale endringer i metabolitter over behandlinger, hvis ønskelig, kan du bruke filtre på forhånd veid og deretter veid igjen etter prøven filtrering og lyophilization å få tørrvekt, eller volumet av prøven filtrert kan være brukes for å få mer kvantitative metabolitt kildedata.
Til syvende og sist, er nytten av NMR for planktoniske prøver begrenset av mengden av masse som kan være vellykket samles; selv med høy tetthet kulturer kan kreve store mengder (> 100 ml) for å oppnå tilstrekkelig tørr biomasse. Men innenfor en eksperimentell ramme, stabil isotop merking i mikro-eller mesocosm eksperimenter, 2D 1 H-13 C heteronuclear enkle kvante sammenheng (HSQC) tilnærminger er mulig. Videre har vi i tillegg brukt 47 -mm filter og 5 ml polypropylen rør for å øke mengden av biomasse som kan samles for utvinning, som enda større mengder kan være nødvendig (dvs.> 2 L) for naturlige samfunn fra, f.eks oligotrofe vann der celle tettheter er lav.
Filtrering er en fordel om sentrifugering som det er vår observasjon at enkelte mindre mikrobiell taxa (spesielt små heterotrofe bakterier) ofte ikke pellet bra. Filtrering kan utføres manuelt i feltet, og volumene filtrerte er begrenset bare av antall filtre tilgjengelig. I tillegg kan overflødig utskriftsmateriale eller vann fjernes på denne måten, og prøvene kan skylles hvis nødvendig. Selvfølgelig, selv med filtrering, vil samfunnet samlet være begrenset til en størrelse brøkdel ned til filteret cutoff, som i dette eksemplet er 0,22 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttes delvis av Grants-i-Aid for Scientific Research for utfordrende utforskende forskning (JK), og forskning (A) (JK og SM) fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi Japan . En Riken FPR fellesskap (RCE) gitt ekstra støtte. Forfatterne uttrykke sin takknemlighet til legene. Eisuke Chikayama, Yasuyo Sekiyama og Mami Okamoto for teknisk assistanse med NMR og statistiske analyser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm hydrophilic Durapore PVDF filters, 25 mm | EMD Millipore | GVWP02500 | |
| Microanalysis Filter Holder, 25 mm, fritted glass support | EMD Millipore | XX1002500 | |
| 3-place manifold, 47 mm, stainless steel | EMD Millipore | XX2504735 | |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-04245 | |
| K2HPO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 164-04295 | |
| Deuterium oxide, 2H > 90% | Campridge Isotope Laboratoties | DLM-4 | |
| DSS | Fluka | 92754 | |
| Automill | Tokken | TK-AM4 | Stainless steel crushers included |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Vacuum evaporator | EYELA | CVE-3100 | |
| NMR | Bruker Corporation | DRX-500 with 5 mm-TXI probe | |
| Spectral binning tool | Originally developed | FT2DB | https://database.riken.jp/ecomics/ |
| Metabolite annotation tool and database | Originally developed | SpinAssign | http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search |
References
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: a critical review and future perspectives. Metabolomics. 5, 3-21 (2008).
- Chikayama, E., et al. Statistical indices for simultaneous large-scale metabolite detections for a single NMR spectrum. Anal. Chem. 82, 1653-1658 (2010).
- Lewis, I. A., Schommer, S. C., Markley, J. L. rNMR: open source software for identifying and quantifying metabolites in NMR spectra. Magn. Reson. Chem. 47, S123-S126 (2009).
- Li, M., et al. Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2117-2122 (2008).
- Mochida, K., Furuta, T., Ebana, K., Shinozaki, K., Kikuchi, J. Correlation exploration of metabolic and genomic diversity in rice. BMC Genomics. 10, 568 (2009).
- Fukuda, S., et al. Bifidobacteria can protect from enteropathogenic infection through production of acetate. Nature. 469, 543-547 (2011).
- Kikuchi, J., Hirayama, T. Practical aspects of stable isotope labeling of higher plants for a hetero-nuclear multi-dimensional NMR-based metabolomics. Methods Mol. Biol. 358, 273-286 (2007).
- Martin, F. P., et al. A top-down systems biology view of microbiome-mammalian metabolic interactions in a mouse model. Mol. Syst. Biol. 3, 112 (2007).
- Mahrous, E. A., Lee, R. B., Lee, R. E. A rapid approach to lipid profiling of mycobacteria using 2D HSQC NMR maps. J. Lipid Res. 49, 455-463 (2008).
- Fukuda, S., et al. Evaluation and characterization of bacterial metabolic dynamics with a novel profiling technique, real-time metabolotyping. PloS ONE. 4, e4893 (2009).
- Date, Y., et al. New monitoring approach for metabolic dynamics in microbial ecosystems using stable-isotope-labeling technologies. J. Biosci. Bioeng. 110, 87-93 (2010).
- Nakanishi, Y., et al. Dynamic omics approach identifies nutrition-mediated microbial interactions. J. Proteome Res. 10, 824-836 (2011).
- Falkowski, P., Barber, R., Smetacek, V. Biogeochemical controls and feedbacks on ocean primary production. Science. 281, 200-207 (1998).
- Viant, M. R. Metabolomics of aquatic organisms: the new 'omics' on the block. Mar. Ecol. Prog. Ser. 332, 301-306 (2007).
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Evaluation of a semipolar solvent system as a step toward heteronuclear multidimensional NMR-based metabolomics for 13C-labeled bacteria, plants, and animals. Anal. Chem. 83, 719-726 (2011).
- Delaglio, F., et al. NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR. 6, 277-293 (1995).
- Wang, T., et al. Automics: an integrated platform for NMR-based metabonomics spectral processing and data analysis. BMC Bioinformatics. 10, 83 (2009).
- The R Project for Statistical Computing. , Available from: http://www.r-project.org/ (2010).
- Eldon, L., et al.
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Profiling polar and semipolar plant metabolites throughout extraction processes using a combined solution-state and high-resolution magic angle spinning NMR approach. Anal. Chem. 82, 1643-1652 (2011).
