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Immunology and Infection

के उच्च संकल्प इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी Published: November 21, 2014 doi: 10.3791/52122
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Medicine - Division of Infectious Diseases, Vanderbilt University School of Medicine, 2Tennessee Valley Healthcare Systems, U. S. Dept. of Veterans Affairs

Protocol

1. एच मानव गैस्ट्रिक उपकला कोशिकाओं के साथ आयरन उपलब्धता और सह-संस्कृति की विभिन्न स्थितियों में पाइलोरी ग्रोथ

  1. एच चुनें इन अध्ययनों के लिए पाइलोरी तनाव PMSS1 यह एक अक्षुण्ण कैग pathogenicity द्वीप है और एक कार्य प्रकार चतुर्थ स्राव प्रणाली व्यक्त करता है. इसके अलावा एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक isogenic पिंजरे उत्परिवर्ती (PMSSI Δ पिंजरे) का उपयोग. 5% सीओ 2 की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 5% भेड़ खून (रक्त अगर प्लेटों) के साथ पूरक टीएसए प्लेटों पर बैक्टीरिया बढ़ने.
    नोट: अभिकर्मकों तैयार करें और सामग्री और उपकरण तालिका में उल्लिखित के रूप में सामग्री इकट्ठा. प्रत्येक अभिकर्मक के लिए अंतिम सांद्रता कोष्ठकों में सूचीबद्ध है.
  2. एक बाँझ कपास इत्तला दे दी applicator का उपयोग कर थाली से बैक्टीरिया परिमार्जन और घटकों से तैयार संशोधित ब्रूसिला शोरबा में टीका लगाना (सामग्री और उपकरण तालिका देखें) और कोलेस्ट्रॉल के साथ पूरक. 37 में रात भर संस्कृतियों सेतेमिनट (आरपीएम) प्रति 200 घुमाव पर झटकों के साथ 5% सीओ 2 के साथ पूरक कमरे में हवा में सी °.
    नोट: कोलेस्ट्रॉल के कारण सीरम जटिल तथ्य यह है कि भ्रूण गोजातीय सीरम के स्थान पर प्रयोग किया जाता है; इस तरह के परिणामों में परिवर्तनशीलता का कारण बनता है जो हीम के रूप में पोषक तत्व लोहे के कई स्रोतों से युक्त.
  3. जीवाणु संवर्धन के दिन, एजीएस मानव गैस्ट्रिक उपकला कोशिकाओं बीज (ATCC सीआरएल-1739) 12 अच्छी तरह प्लेटें (अच्छी तरह से प्रति लगभग 1 x 10 5 कोशिकाओं) में पाली-डी lysine इलाज किया coverslips पर.
  4. अगले दिन, संशोधित ब्रूसिला शोरबा अकेले या 100 माइक्रोन FeCl 3, 200 माइक्रोन dipyridyl (एक सिंथेटिक लोहा chelator), या 200 माइक्रोन dipyridyl प्लस 250 माइक्रोन FeCl 3 के साथ पूरक में 0.3 की एक OD600 को बैक्टीरियल संस्कृतियों पतला. 200 rpm पर झटकों के साथ 5% सीओ 2 के साथ पूरक कमरे में हवा में 37 डिग्री सेल्सियस से कम 4 घंटे के लिए इन संस्कृतियों सेते हैं.
  5. 1000 XG पर अपकेंद्रित्र बैक्टीरिया कोशिकाओं को इकट्ठा और मैं resuspending पहले supernatants हटाने के लिएएन ताजा संशोधित ब्रूसिला शोरबा के एक बराबर मात्रा में कोलेस्ट्रॉल के साथ पूरक. संस्कृति (OD600 = 1.0 = 5.5 एक्स 10 8 कोशिकाओं / एमएल) के उपाय OD600 और संक्रमण 20 के (MOI) की बहुलता में उपकला कोशिकाओं को बैक्टीरिया जोड़ें: 1. बैक्टीरियल सेल व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए रक्त अगर प्लेटों पर धारावाहिक dilutions और प्लेट बैक्टीरियल कोशिकाओं को पूरा करें.
  6. एच सेते स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) नमूना तैयार करने से पहले स्थिर स्थितियों में 5% सीओ 2 की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस से कम 4 घंटे के लिए पाइलोरी और AGS मानव गैस्ट्रिक उपकला कोशिकाओं सह संस्कृतियों.

2. SEM के एच कल्पना करने के लिए नमूना तैयार पाइलोरी कैग-T4SS Pili

  1. एच निकालें पाइलोरी और इनक्यूबेटर और निथारना संस्कृति सतह पर तैरनेवाला से AGS के सह संस्कृतियों (आईएल -8 एलिसा के लिए बचाने के लिए). 0.05 एम सोडियम cacodylate बफर (7.4 पीएच) के साथ धीरे तीन बार धोएं. , 2.0% paraformaldehyde के समाधान में 2.5 कमरे के तापमान पर 2-4 घंटे के लिए नमूने फिक्स% Gluteraldehyde, और 0.05 एम सोडियम cacodylate बफर. प्राथमिक निर्धारण के बाद, नमूने 0.05 एम सोडियम cacodylate बफर के साथ तीन बार धोएं.
  2. दो अनुक्रमिक 10 मिनट निर्धारण चरणों में 0.05 एम सोडियम cacodylate बफर में 0.1% आज़मियम tetroxide का उपयोग माध्यमिक निर्धारण प्रदर्शन करना. माध्यमिक निर्धारण के बाद, नमूने 0.05 एम सोडियम cacodylate बफर के साथ तीन बार धोएं.
  3. प्राथमिक और माध्यमिक निर्धारण के बाद, 1 टेबल के अनुसार इथेनॉल की सांद्रता बढ़ाने के साथ अनुक्रमिक धोने से नमूने निर्जलीकरण.
  4. इथेनॉल निर्जलीकरण के बाद, तरल कार्बन डाइऑक्साइड की तीन अनुक्रमिक washes के प्रदर्शन. 1073 साई के 31.1 डिग्री सेल्सियस के तापमान और दबाव में एक महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर मशीन का उपयोग कर एक महत्वपूर्ण बिंदु पर तो सूखी नमूने.
  5. माउंट एल्यूमिनियम SEM के नमूना आधार पर coverslips और उचित ग्राउंडिंग प्राप्त और SEM इमेजिंग के दौरान चार्ज से बचने के लिए नमूना किनारे पर कोलाइडयन चांदी की एक पतली रेखा के साथ रंग.
  6. कोट नमूने के 5 एनएम साथनमूना माध्यमिक इलेक्ट्रॉन संकेत और बढ़त प्रभाव को बढ़ाने के लिए एक धूम कोट मशीन का उपयोग कर सोने-पैलेडियम.

उच्च संकल्प SEM के विश्लेषण के लिए 3. इमेजिंग पैरामीटर

  1. एक क्षेत्र उत्सर्जन गन स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (FEG-SEM) के साथ नमूने देखें.
  2. 5-10 मिमी की एक काम दूरी पर एक उच्च वैक्यूम मोड में छवि.
  3. 5 केवी को तेज वोल्टेज सेट.
  4. 2-2.5 को स्थान आकार निर्धारित करें.
  5. मेजबान रोगज़नक़ इंटरफ़ेस का एक बेहतर विचार प्राप्त करने के लिए 15-25 डिग्री के बीच नमूना झुकाएँ.
  6. मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के इन क्षेत्रों पिली बनाने बैक्टीरिया के लिए समृद्ध कर रहे हैं, के रूप में उच्च बढ़ाई देखने के लिए उपकला कोशिकाओं के किनारों को पक्षपाती बैक्टीरिया इमेजिंग प्राथमिकता.

4. सांख्यिकीय विश्लेषण Pili quantifications का मूल्यांकन करने के लिए

  1. एच विश्लेषण ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर पाइलोरी कैग-T4SS पिली piliated Phe प्रदर्शन कोशिकाओं की पिली / सेल की संख्या के साथ ही प्रतिशत योंनीचे दिए गए निर्देशों के अनुसार notype.
  2. ImageJ सॉफ्टवेयर में ओपन माइक्रोग्राफ फ़ाइलें. वर्दी चौड़ाई (10-13 एनएम) और लंबाई (60-150) एनएम के साथ बैक्टीरिया कोशिका और मेजबान सेल, बीच का गठन संरचनाओं के रूप में पिली पहचानें.
    नोट: pilus संरचना प्रमुख ATPase कि शक्तियों प्रकार चतुर्थ स्राव pilus विधानसभा एन्कोडिंग जीन में एक निष्क्रियता बंदरगाह जो ऐसे Δ पिंजरे उत्परिवर्ती उपभेदों के रूप में isogenic उपभेदों, पर गुम्मट जीवाणु उपभेदों पर मौजूद है, लेकिन अनुपस्थित है.
  3. "विश्लेषण" टैब पर क्लिक करके फिर सीधे लाइन उपकरण के साथ एक लाइन ड्राइंग और द्वारा माप उपकरण जांचना. लटकती मेनू से "सेट स्केल" का चयन करें और बॉक्स लेबल "ज्ञात दूरी" में बढ़ाई बार मूल्य भरिये और उपयुक्त सेटिंग (एनएम) के लिए लंबाई की इकाई की स्थापना की. "ठीक है" पर क्लिक करें.
  4. Pilus की लंबाई या चौड़ाई पर आकर्षित करने के लिए सीधी रेखा उपकरण का उपयोग सीएजी-T4SS पिली उपाय और फिर प्रत्येक pilus को मापने के लिए "Ctrl-एम" दबाएँ. मापा मूल्यों के साथ एक संवाद बॉक्स को ध्यान से देखें. इन मूल्यों रिकॉर्ड या कॉपी और एक स्प्रेडशीट कार्यक्रम में पेस्ट करें.
  5. लंबाई का प्रयोग करें और चौड़ाई मापदंडों पहले सीएजी-T4SS की प्रोफ़ाइल फिट नहीं है कि 24, उपेक्षा सुविधाओं की स्थापना की. फिर 10-13 एनएम चौड़ाई और 60-150 एनएम लंबाई कटऑफ़ के भीतर हैं कि मूल्यों पर आधारित पिली की संख्या यों.
  6. GraphPad चश्मे सॉफ्टवेयर का उपयोग कर दो पूंछ छात्र के टी परीक्षण द्वारा सांख्यिकीय पिली की मात्रा का ठहराव का विश्लेषण करें.

5. वैकल्पिक: आईएल -8 स्राव के मूल्यांकन Pilus उत्पादन के साथ संबंध स्थापित करने के लिए

  1. 2.1 कदम से supernatants का प्रयोग, किट के साथ निर्माता के निर्देशों (सामग्री और उपकरण तालिका देखें) प्रति एक आईएल -8 एलिसा प्रदर्शन करते हैं.
  2. आईएल -8 मेजबान कोशिकाओं द्वारा स्रावित विश्लेषण और अकेले मध्यम में उगाई गुम्मट PMSS1 के संबंध में प्रतिशत आईएल -8 प्रेरण गणना. इसलिए GraphPad चश्मे का उपयोग कर दो पूंछ छात्र के टी परीक्षण का उपयोग सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शनftware.

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Representative Results

इस रिपोर्ट में, हम लोहा उपलब्धता बदलती की शर्तों एच मिलाना क्षमता है कि प्रदर्शन किया है मेजबान रोगज़नक़ इंटरफेस में पाइलोरी कैग-T4SS pilus जीवजनन. , एच अकेले माध्यम में सुसंस्कृत जब पाइलोरी 3 पिली / सेल के एक औसत रूपों. जब एच पाइलोरी लोहे में उगाया जाता है खलाना बैक्टीरिया विकास (चित्रा 1) के लिए उप निरोधात्मक हैं कि (सिंथेटिक chelator dipyridyl का उपयोग) की स्थिति, बैक्टीरिया का उत्पादन कई सीएजी-T4SS पिली (~ 7 पिली / सेल) जब मानव गैस्ट्रिक कोशिकाओं के साथ सह-सुसंस्कृत (चित्रा 2). पोषक तत्व लोहे की एक बहिर्जात स्रोत मौजूद है जब इसके विपरीत, कैग-T4SS पिली के गठन दमित है (Fe नमूने में कम से कम 1 pilus / सेल, कम से कम 1 pilus / एफई + डुबकी नमूने में सेल) (चित्रा 2). मेजबान रोगज़नक़ इंटरफेस में पिली की मात्रा का पता चलता है कि लोहे प्रतिबंध, एच की शर्तों में पाइलोरी कैग-T4SS पिली (पी में एक 2 गुना वृद्धि <0.000 दर्शाती 1) और अकेले माध्यम में विकसित कोशिकाओं की तुलना में 11% (पी <0.05) द्वारा प्रतिशत piliated कोशिकाओं बढ़ जाती है (चित्रा 3). दिलचस्प है, मेजबान आईएल -8 स्राव द्वारा मापा के रूप में कैग-T4SS की गतिविधि, लोहे के प्रतिबंध की शर्तों के तहत 107% बढ़ाया और अकेले मध्यम (पी = 0.03, और पी की तुलना में अतिरिक्त लौह उपलब्धता की शर्तों के तहत 49% दमित है < SEM के डेटा का समर्थन करता है कि 0.001, क्रमशः) एक परिणाम. हालांकि, पिली आयाम (चित्रा 4) लोहे की उपलब्धता की सभी शर्तों के बीच में लगातार बने हुए हैं. इसके अलावा, लोहे की उपलब्धता एक पिंजरे उत्परिवर्ती की सतह पर पिली की जीवजनन नहीं बदलता है, और न ही यह वास्तव में, प्रदर्शन संरचनाओं हैं कि परिकल्पना का समर्थन करते हुए मेजबान कोशिकाओं से एक आईएल -8 प्रतिक्रिया उत्पन्न करने के लिए इस isogenic व्युत्पन्न की क्षमता परिवर्तन करता है, कैग-T4SS और नहीं एक अतिरिक्त असंबंधित सतह सुविधा.

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चित्रा 1:. लोहे उपलब्धता की विभिन्न स्थितियों में निर्धारित बैक्टीरियल व्यवहार्यता एच पाइलोरी (मध्यम अकेले) अकेले संशोधित ब्रूसिला शोरबा में सुसंस्कृत, या 100 माइक्रोन FeCl 3 (Fe), 200 माइक्रोन dipyridyl (डुबकी), या 200 माइक्रोन dipyridyl प्लस 250 माइक्रोन FeCl 3 (Fe + डुबकी) के साथ पूरक था. जीवाणु 5% सीओ 2 की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए ऊष्मायन से पहले जीवाणु माध्यम पर क्रमानुसार पतला और चढ़ाया गया. कालोनियों में गिना गया और कॉलोनी बनाने इकाइयों / एमएल (CFU / एमएल) की गणना की गई. बार्स तीन स्वतंत्र प्रयोगों का मतलब संकेत मिलता +/- सेम. डुबकी, Fe, या एफई + गिरावट के साथ उपचार में काफी बैक्टीरियल व्यवहार्यता को बदल नहीं है.

चित्रा 2
चित्रा 2: उच्च अनुसंधानesolution स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी एच का विश्लेषण करती है पाइलोरी कैग-T4SS पिली. जीवाणु अकेले मध्यम) एक में बड़े हो रहे थे, बी) मध्यम 100 माइक्रोन FeCl 3 के साथ पूरक, सी) मध्यम 200 माइक्रोन dipyridyl के साथ पूरक 200 माइक्रोन dipyridyl, या डी) मध्यम के साथ पूरक प्लस 250 माइक्रोन FeCl 3 पूर्व AGS के मानव के साथ सह संस्कृति को गैस्ट्रिक कोशिकाओं. तीर मेजबान रोगज़नक़ इंटरफेस में गठित कैग-T4SS पिली संकेत मिलता है. नमूने कैग-T4SS जीवजनन मूल्यांकन करने के लिए उच्च संकल्प स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया गया. अतिरिक्त उपलब्ध पोषक तत्व लोहे की शर्तों कैग-T4SS pilus गठन को दबाने जबकि कम लोहे की उपलब्धता की स्थिति, कैग-T4SS pilus गठन के प्रसार में वृद्धि.

चित्रा 3
चित्रा 3: विभिन्न में सुसंस्कृत पिली / सेल और प्रतिशत की मात्रा piliated कोशिकाओंलोहे की उपलब्धता की स्थिति. जीवाणु अकेले (मध्यम अकेले) संशोधित ब्रूसिला शोरबा में बड़े हो रहे थे, या मध्यम 100 माइक्रोन FeCl 3 (Fe), 200 माइक्रोन dipyridyl (डुबकी), या 200 माइक्रोन dipyridyl प्लस 250 माइक्रोन FeCl 3 (Fe + डुबकी) सह करने से पहले साथ पूरक मानव गैस्ट्रिक उपकला कोशिकाओं के साथ संस्कृति. नमूने उच्च संकल्प स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और पिली ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रगणित थे द्वारा विश्लेषण किया गया. सेल (* पी <0.0001 अकेले मध्यम की तुलना में प्रति पिली की ए) scatterplot) और हालत 3 अलग से ली गई संस्कृति प्रति 60-112 कोशिकाओं से व्युत्पन्न piliated कोशिकाओं (* पी <0.05 अकेले मध्यम की तुलना में) के बी) बार ग्राफ चित्रण प्रतिशत जैविक प्रयोगों.

चित्रा 4
चित्रा 4: लोहा उपलब्धता की विभिन्न स्थितियों में संवर्धित कोशिकाओं से मापा Pilus आयाम. BACTeria अकेले (मध्यम अकेले) संशोधित ब्रूसिला शोरबा में हो, या मध्यम 100 माइक्रोन FeCl 3 (Fe), 200 माइक्रोन dipyridyl (डुबकी), या 200 माइक्रोन dipyridyl प्लस 250 माइक्रोन FeCl 3 (Fe + डुबकी) सह करने से पहले साथ पूरक गया मानव गैस्ट्रिक उपकला कोशिकाओं के साथ संस्कृति. नमूने उच्च संकल्प स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया गया और पिली आयाम ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मापा गया. ए) Pilus चौड़ाई सभी स्थितियों के बीच 13.1 +/- 2.4 एनएम के एक औसत है. बी) Pilus लंबाई सब स्थितियों के बीच 75.8 +/- 16.0 एनएम के एक औसत है. Pilus आयामों में कोई महत्वपूर्ण अंतर लोहे उपलब्धता की विभिन्न स्थितियों में देखा जाता है.

पूरक चित्रा 1: उच्च संकल्प स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी एच का विश्लेषण करती है लोहे की उपलब्धता की विभिन्न स्थितियों में पाइलोरी पिंजरे उत्परिवर्ती. जीवाणु FeCl 3 100 माइक्रोन के साथ पूरक ए) मध्यम में बड़े हो रहे थे, बी) मध्यम डी 200 माइक्रोन dipyridyl (साथ पूरकआईपी) या सी) मध्यम 200 माइक्रोन dipyridyl (डुबकी) से अधिक एजीएस मानव गैस्ट्रिक कोशिकाओं के साथ 250 माइक्रोन FeCl 3 पूर्व सह संस्कृति के साथ पूरक. नमूने कैग-T4SS जीवजनन मूल्यांकन करने के लिए उच्च संकल्प स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया गया. कम या अधिक लोहे की शर्तें चित्रा 2 में कल्पना संरचनाओं कैग-T4SS पिली हैं कि परिकल्पना का समर्थन, किसी भी कैग स्वतंत्र pilus जीवजनन मिलाना नहीं है.

पूरक चित्रा 2: लोहे उपलब्धता की स्थिति बदलती में उगाई बैक्टीरिया के जवाब में मेजबान आईएल -8 स्राव की एलिसा विश्लेषण. जंगली प्रकार (सफेद सलाखों) या पिंजरे उत्परिवर्ती (धूसर बार) बैक्टीरिया अकेले (मध्यम अकेले) संशोधित ब्रूसिला शोरबा में बड़े हो रहे थे, या मध्यम 100 माइक्रोन FeCl 3 (Fe), 200 माइक्रोन dipyridyl (डुबकी), या 200 माइक्रोन dipyridyl के साथ पूरक प्लस 250 उम FeCl 3 (Fe + डुबकी) मानव गैस्ट्रिक उपकला कोशिकाओं के साथ पहले सह संस्कृति. बढ़ी हुई आईएल में आयरन प्रतिबंध परिणाम-8, कैग-T4SS गतिविधि पर निर्भर है कि एक मेजबान प्रतिक्रिया. बार्स 3 अलग जैविक प्रयोगों से निकाली गई, मतलब +/- SEM के संकेत मिलता है. (* पी <0.05 अकेले मध्यम में उगाई PMSS1 की तुलना में).

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Discussion

आयरन बैक्टीरियल रोगज़नक़ों सहित जीवन के सबसे रूपों के लिए एक आवश्यक पोषक है. सूक्ष्मजीवों पर हमले की व्यवहार्यता को प्रतिबंधित करने के प्रयास में, हड्डीवाला मेजबान "पोषण प्रतिरक्षा" 18 के रूप में जाना जाता प्रक्रिया में पोषक तत्व लोहे पृथक. इस के जवाब में, बैक्टीरियल रोगज़नक़ों अपने आसपास भावना और लौह अधिग्रहण प्रणाली, जहर, और विष स्राव मशीनरी 19,20 के रूप में डाह सुविधाओं के विस्तार को विनियमित करने के लिए एक वैश्विक संकेत अणु के रूप में लोहे के उपयोग के लिए विकसित किया है.

एच पाइलोरी जैसे लोहा, जस्ता, मैग्नीशियम और 22 विकसित करने के लिए और इस तरह के हीम, हीमोग्लोबिन, transferrin के रूप में वैकल्पिक लोहे स्रोतों का उपयोग कर सकते हैं, और लैक्टोफेरिन 23 के रूप में सूक्ष्म पोषक आवश्यकता है. एच पाइलोरी, सबसे सफल रोगजनक की तरह, यह मेजबान 21 से पोषक तत्व लोहे मांजना मदद करने के लिए विषैलापन कारकों की एक विस्तृत प्रदर्शनों की सूची तैयार की है. एक विषैलापन कारक, सीजीए, प्रेरक molecuकैग-T4SS के ले, यह आसानी से एक पोषक तत्व लोहे स्रोत के रूप में बैक्टीरियल कोशिकाओं द्वारा इस्तेमाल किया और प्रतिकृति 15 को बढ़ावा देने के किया जा सकता है, जहां शिखर सतह को polarized कोशिकाओं की basolateral ओर से transferrin rerouting में फंसा है. इस प्रकार, यह कम लोहे की उपलब्धता की स्थिति में सीजीए के स्राव को बढ़ावा देने के लिए एक सहज ज्ञान युक्त विकासवादी रणनीति लगता है.

एच पाइलोरी कैग-T4SS कारण यह elicits proinflammatory मेजबान सेल प्रतिक्रिया करने के लिए, एक महत्वपूर्ण बैक्टीरियल organelle है. कैग-T4SS का प्रभाव अच्छी तरह से सह संस्कृतियों और संक्रमण के पशु मॉडल दोनों में अध्ययन किया गया है. हालांकि, इस विष स्राव प्रणाली की macromolecular संरचना और संरचना के अध्ययन के उच्च संकल्प इमेजिंग प्रोटोकॉल के अभाव के कारण रुकावट किया गया है. कैग-T4SS का अध्ययन कर हमारे पहले प्रकाशित रिपोर्ट उच्च संकल्प इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा बैक्टीरिया कोशिका प्रति चार कैग-T4SS पिली के एक औसत 24 विश्लेषण की सूचना दी है. हमारे बेहतर तरीका प्रदान करता हैएक मजबूत इमेजिंग तकनीक बैक्टीरिया कोशिका की सतह पर इस सुविधा के उत्पादन को बढ़ावा देता है कि एक संस्कृति तकनीक का उपयोग करके कैग-T4SS कल्पना करने के लिए. उच्च संकल्प क्षेत्र उत्सर्जन बंदूक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ संयोजन के रूप में संस्कृति तकनीक का उपयोग इस इमेजिंग प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण है. कैग-T4SS सतह सुविधा का दो गुना संवर्धन इम्यूनोफ्लोरेसेंस या immunoprecipitation तकनीक आगे कैग-T4SS के subcellular स्थान या रचना विशेषताएँ रूप immunohistochemical प्रदर्शन में दिलचस्पी जांचकर्ताओं के लिए एक उल्लेखनीय वृद्धि ऐसे विश्लेषण करती है. कैग-T4SS के उच्च संकल्प इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग में महारत हासिल हो जाने के बाद, यह कैग-T4SS pilus 25 के संबंध में बैक्टीरियल प्रोटीन का स्थान निर्धारित करने के लिए, इस तरह के immunogold लेबलिंग के रूप में अन्य अनुप्रयोगों, विकसित करने के लिए भी संभव है.

हमारी तकनीक की एक सीमा अन्वेषक अभी भी उसी तक सीमित है कि इस तथ्य हैकैग-T4SS के दृश्य के लिए एक सह संस्कृति प्रणाली एनजी. एच के एक ही क्षेत्र में, केवल एक सबसेट पाइलोरी सामान्य संस्कृति की स्थिति इन संरचनाओं फार्म के नीचे (लगभग 50-70 प्रतिशत, चित्रा 3 पैनल बी देखें). तो एक क्षेत्र में कई कोशिकाओं गैर piliated किया जाएगा. इन उप-जनसंख्या एक ही स्थान में मौजूद क्यों यह अज्ञात है, लेकिन इन कोशिकाओं को हमेशा सतह पर पिली साथ पिली / सेल और कोशिकाओं के प्रतिशत के quantifications दोनों के भीतर जिम्मेदार हैं. कैग-T4SS केवल मेजबान बैक्टीरियल इंटरफेस में मनाया जाता है, SEM के नमूना तैयार भीतर प्राथमिक और माध्यमिक निर्धारण कदम प्रोटीन संरचनाओं और यूकेरियोटिक और प्रोकार्योटिक कोशिकाओं की झिल्ली दोनों के संरक्षण के लिए महत्वपूर्ण हैं. नियतन कदम अब से बाहर किया उल्लिखित, या समाधान हौसले से तैयार नहीं कर रहे हैं कर रहे हैं हालांकि, अगर अधिक-निर्धारण हो सकता है. से अधिक-निर्धारण होता है SEM के तहत देखा और सीएजी-T4SS इस नकाबपोश द्वारा की जाएगी, जब नमूने एक पथरीले उपस्थिति होगा. Troubl के लिएeshoot, कम केंद्रित fixatives और / या लगानेवाला की उपस्थिति में incubated कम समय का उपयोग SEM के नमूना तैयार दोहराएँ.

सह संस्कृति प्रणाली भी कारण मेजबान प्रोटीन की बड़ी मात्रा के प्रदूषण के लिए जैव रासायनिक (मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण करती है जैसे) लक्षण वर्णन बोझिल बना देता है. हालांकि, इस जीवाणु स्राव प्रणाली के उत्पादन को विनियमित कि आणविक तंत्र को समझने अंततः मेजबान कोशिकाओं के अभाव में सीएजी-T4SS pilus गठन ट्रिगर किया जाएगा कि नई तकनीकों को जन्म दे सकता है. यह बहुत जैव रासायनिक assays के लिए अलगाव और शोधन तकनीक में सुधार होगा.

अंत में, हम रिपोर्ट है कि एच के उत्पादन में वृद्धि में प्रतिबंधित लोहा उपलब्धता परिणाम की शर्तों उच्च संकल्प स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक से देखे जा सकते हैं कि पाइलोरी कैग-T4SS. हम भी मेजबान रोगज़नक़ interfa पर इस सतह सुविधा का लोहा निर्भर दमन रिपोर्टसीई. इस परख अनुकूलित और लोहे विनियमित विष-स्राव फार्म और मेजबान सूक्ष्म जीव बातचीत की एक किस्म के लिए मोटे तौर पर लागू है कि कई बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के लिए उपयोग किया जा सकता है.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Modified brucella broth
Peptone from casein (10 g/L) Sigma 70172
Peptic digest of animal tissue (10 g/L) Sigma 70174
Yeast extract (2 g/L) Sigma 92144
Dextrose (1 g/L) Sigma D9434
Sodium chloride (5 g/L) Thermo Fisher S271-10
Cholesterol (250X) (4 ml/L) Life Technologies 12531018
Ferric chloride (100 or 250 uM) Sigma 157740-100G
Dipyridyl (200 uM) Sigma D216305-100G
Modified RPMI
RPMI+HEPES (1X) Life Technologies 22400-121
Fetal bovine serum (100 ml/L) Life Technologies 10438-026
Electron Microscopy Preparation
Paraformaldehyde (2.0% aqueous) Electron Microscopy Sciences 15713
Gluteraldehyde (2.5% aqueous) Electron Microscopy Sciences 16220
Sodium cacodylate (0.05 M) Electron Microscopy Sciences 12300
Osmium tetroxide (0.1% aqueous) Electron Microscopy Sciences 19150
Ethanol (absolute) Sigma E7023
Colloidal silver paint Electron Microscopy Sciences 12630
SEM sample stubs Electron Microscopy Sciences 75220
Coverslips Thermo Fisher 08-774-383
IL-8 Secretion Evaluation
Quantikine IL-8 ELISA kit R&D Systems D8000C

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References

  1. Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. (6), 1863-1873 (2009).
  2. Sycuro, L. K., et al. Peptidoglycan crosslinking relaxation promotes Helicobacter pylori's helical shape and stomach colonization. Cell. 141 (5), 822-833 (2010).
  3. Kodaman, N., et al. Human and Helicobacter pylori coevolution shapes the risk of gastric disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (4), 1455-1460 (2014).
  4. Tegtmeyer, N., Wessler, S., Backert, S. Role of the cag-pathogenicity island encoded type IV secretion system in Helicobacter pylori pathogenesis. FEBS J. 278 (8), 1190-1202 (2011).
  5. Fischer, W. Assembly and molecular mode of action of the Helicobacter pylori Cag type IV secretion apparatus. FEBS J. 278 (8), 1203-1212 (2011).
  6. Odenbreit, S., Puls, J., Sedlmaier, B., Gerland, E., Fischer, W., Haas, R. Translocation of Helicobacter pylori CagA into gastric epithelial cells by type IV secretion. Science. 287 (5457), 1497-1500 (2000).
  7. Bourzac, K., Guillemin, K. Helicobacter pylori-host cell interactions mediated by type IV secretion. Cell Microbiol. 7 (7), 911-919 (2005).
  8. Bronte-Tinkew, D. M., et al. Helicobacter pylori cytoxin-associated gene A activates the signal transducer and activator of transcription 3 pathway in vitro and in vivo. Cancer Res. 69 (2), 632-639 (2009).
  9. Johnson, E. M., Gaddy, J. A., Cover, T. L. Alterations in Helicobacter pylori triggered by contact with gastric epithelial cells. Front. Cell. Infect. Microbiol. (2), 17 (2012).
  10. Rohde, M., Puls, J., Buhrdorf, R., Fischer, W., Haas, R. A novel sheathed surface organelle of the Helicobacter pylori cag type IV secretion system. Mol. Microbiol. 49 (1), 219-234 (2003).
  11. Cover, T. L., Peek, R. M. Jr Diet, microbial virulence and Helicobacter pylori induced gastric cancer. Gut Microbes. 4 (6), 482-493 (2013).
  12. Queiroz, D. M., et al. Increased gastric IL-1β concentration and iron deficiency parameters in Helicobacter pylori infected children. PLoS One. 8 (2), 57420 (2013).
  13. Harris, P. R., et al. Helicobacter pylori-associated hypochlorhydria and development of iron deficiency. J. Clin. Pathol. 66 (4), 343-347 (2013).
  14. Noto, J. M., et al. Iron deficiency accelerates Helicobacter pylori-induced carcinogenesis in rodents and humans. J. Clin. Invest. 123 (1), 479-492 (2013).
  15. Tan, S., Noto, J. M., Romero-Gallo, J., Peek, R. M. Jr, Amieva, M. R. Helicobacter pylori perturbs iron trafficking in the epithelium to grow on the cell surface. PLoS Pathog. 7 (5), (2011).
  16. Danielli, A., Roncarati, D., Delany, I., Chiarini, V., Rappouli, R., Scarlato, V. In vivo dissection of the Helicobacter pylori Fur regulatory circuit by genome-wide location analysis. J. Bacteriol. 188 (13), 4654-4662 (2006).
  17. Pich, O. Q., Carpenter, B. M., Gilbreath, J. J., Merrell, D. S. Detailed analysis of Helicobacter pylori Fur-regulated promoters reveals a Fur box core sequence and novel Fur-regulated genes. Mol. Microbiol. 84 (5), 921-941 (2012).
  18. Cassat, J. E., Skaar, E. P. Iron in infection and immunity. Cell Host Microbe. 13 (5), 509-519 (2013).
  19. Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. Host-pathogen interactions in urinary tract infection. Nat. Rev. Urol. 7 (8), 430-441 (2010).
  20. Brickman, T. J., Cummings, C. A., Liew, S. Y., Relman, D. A., Armstrong, S. K. Transcriptional profiling of the iron starvation response in Bordatella pertussis provides new insights into siderophore utilization and virulence gene expression. J. Bacteriol. 193 (18), 4798-4812 (2011).
  21. Mobley, H. L. Helicobacter pylori factors associated with disease development. Gastroenterology. 113 (6), 21-28 (1997).
  22. Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. L. Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined. J. Clin. Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).
  23. Senkovich, O., Ceaser, S., McGee, D. J., Testerman, T. L. Unique host iron utilization mechanisms of Helicobacter pylori revealed with iron-deficient chemically defined media. Infect. Immun. 78 (5), 1841-1849 (2010).
  24. Shaffer, C. L., et al. Helicobacter pylori exploits a unique repertoire of type IV secretion system components for pilus assembly at the bacteria-host cell interface. PLoS Pathog. 7 (9), (2011).
  25. Barrozo, R. M., et al. Functional plasticity in the type IV secretion system of Helicobacter pylori. PLoS Pathog. 9 (2), (2013).

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संक्रमण अंक 93, लोहे के अधिग्रहण, प्रकार चतुर्थ स्राव पिली
के उच्च संकल्प इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी<em&gt; हेलिकोबेक्टर</emआयरन उपलब्धता की बदलती परिस्थितियों में उत्पादित&gt; सीएजी प्रकार चतुर्थ स्राव सिस्टम Pili
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Haley, K. P., Blanz, E. J., Gaddy,… More

Haley, K. P., Blanz, E. J., Gaddy, J. A. High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability. J. Vis. Exp. (93), e52122, doi:10.3791/52122 (2014).

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