Protocol
1. H. pylori crescita in condizioni particolari di ferro Disponibilità e co-coltura con cellule umane epiteliali gastriche
- Seleziona H. pylori ceppo PMSS1 per questi studi perché ha un intatto patogenicità cag isola ed esprime un tipo di funzionamento del sistema di secrezione IV. Utilizzare anche una gabbia mutante isogenico (PMSSI Δ Cage) come controllo negativo. Grow batteri su piastre di TSA addizionato con 5% di sangue di pecora (piastre di agar sangue) per 24 ore a 37 ° C in presenza del 5% di CO 2.
NOTA: Preparare i reagenti e assemblare materiali come indicato in materiali e attrezzature della tabella. Le concentrazioni finali per ciascun reagente è elencato tra parentesi. - Raschiare i batteri dalla piastra utilizzando un applicatore con punta di cotone sterili e inoculare in brodo di Brucella modificato preparata dai componenti (vedi Materiali e attrezzature Table) e integrato con il colesterolo. Incubare le culture per una notte a 37° C in aria ambiente integrato con il 5% di CO 2 con agitazione a 200 giri al minuto (rpm).
NOTA: colesterolo viene utilizzato al posto di siero fetale bovino a causa del fatto che il siero è complesso; contenente numerose fonti di ferro nutrienti come eme che provoca variabilità nei risultati. - Il giorno della coltura batterica, seminare le cellule epiteliali gastriche umane AGS (ATCC CRL-1739) su poli-D-lisina coprioggetto trattati in piastre da 12 pozzetti (circa 1 x 10 5 cellule per pozzetto).
- Il giorno seguente, diluire colture batteriche ad una OD600 di 0,3 in solo o integrato con 100 mM FeCl 3, 200 mM dipiridile (un chelante del ferro sintetico), o 200 micron dipiridile più 250 micron FeCl 3 brodo brucella modificato. Incubare le colture per 4 ore a 37 ° C in aria ambiente supplementato con 5% di CO 2 con agitazione a 200 rpm.
- Batteri centrifugare a 1000 xg per raccogliere le cellule e rimuovere surnatanti prima di risospendere in un volume uguale di fresco Brucella modificato brodo integrata con colesterolo. Misura OD600 della cultura (OD600 = 1,0 = 5,5 x 10 8 cellule / ml) e aggiungere batteri alle cellule epiteliali in una molteplicità di infezione (MOI) di 20: 1. Effettuare diluizioni seriali e le cellule batteriche piastra su piastre di agar sangue per valutare la vitalità cellulare batterica.
- Incubare H. cellule epiteliali gastriche umane pylori e AGS co-coltura per 4 ore a 37 ° C in presenza del 5% di CO 2 in condizioni statiche prima di eseguire la microscopia elettronica a scansione (SEM) preparazione del campione.
2. SEM Preparazione del campione per visualizzare H. pylori Cag-T4SS Pili
- Rimuovere H. pylori e co-colture AGS dal surnatante incubatore e decantare la cultura (salvo per IL-8 ELISA). Lavare delicatamente tre volte con sodio 0,05 M tampone cacodilato (pH 7,4). Fix campioni per 2-4 ore a temperatura ambiente in una soluzione di 2,0% paraformaldeide, 2.5% Glutaraldeide, e tampone cacodilato di sodio 0,05 M. Dopo fissazione primaria, lavare campioni tre volte con tampone cacodilato di sodio 0,05 M.
- Eseguire ancoraggio secondario utilizzando 0,1% tetrossido di osmio in 0,05 M di sodio tampone cacodilato in due fasi sequenziali 10 min di fissaggio. Dopo la fissazione secondaria, lavare campioni tre volte con tampone cacodilato di sodio 0,05 M.
- Dopo fissazione primaria e secondaria, disidratano campioni di lavaggio sequenziale con concentrazioni crescenti di etanolo come da Tabella 1.
- Dopo etanolo disidratazione, effettuare tre lavaggi sequenziali di anidride carbonica liquida. Poi i campioni a secco in un punto critico con una macchina asciugatrice punto critico ad una temperatura di 31,1 ° C e pressione di 1073 PSI.
- Monte coprioggetto sul stub campione alluminio SEM e dipingere con una linea sottile di argento colloidale sul bordo del campione per ottenere adeguata messa a terra ed evitare di ricarica durante l'imaging SEM.
- Campioni cappotto con 5 nm dioro-palladio utilizzando una macchina cappotto polverizzazione di aumentare campione di segnale degli elettroni secondari e l'effetto bordo.
3. I parametri di imaging per analisi ad alta risoluzione SEM
- Vedi i campioni con un campo-Emission Gun microscopio elettronico a scansione (SEM-FEG).
- Immagine in una modalità di aspirazione ad alta ad una distanza di lavoro di 5-10 mm.
- Impostare la tensione di accelerazione di 5 kV.
- Impostare dimensione del punto di 2-2,5.
- Inclinare il campione tra i 15-25 ° per ottenere una migliore visualizzazione dell'interfaccia ospite-patogeno.
- Priorità di imaging batteri aderenti ai bordi delle cellule epiteliali per la visualizzazione ad alto ingrandimento, in quanto queste aree di interazione ospite-patogeno sono arricchiti per i batteri-Pili formando.
4. Analisi statistica per valutare Pili Quantificazione
- Analizzare H. pylori Cag-T4SS pili utilizzando il software ImageJ per quantificare il numero di pili / cellule e per cento delle cellule esibendo il piliated phenotype secondo le istruzioni riportate di seguito.
- Aprire i file microfotografia nel software ImageJ. Identificare pili come strutture formate tra la cellula batterica e cellula ospite, con larghezza uniforme (10-13 nm) e la lunghezza (60-150 nm).
NOTA: La struttura pilus è presente su ceppi batterici WT, ma assente in ceppi isogeni quali Δ Cage ceppi mutanti, che ospitano l'inattivazione del gene che codifica per il principale ATPasi che l'assemblaggio tipo poteri secrezione IV pilus. - Calibrare lo strumento di misurazione tracciando una linea con lo strumento linea retta e quindi facendo clic sulla scheda "Analizza". Selezionare "Imposta Scala" dal menu a discesa e immettere il valore bar di ingrandimento nella casella "Noto Distanza" e impostare l'unità di misura per l'impostazione appropriata (nm). Fare clic su "OK".
- Misurare Cag-T4SS pili utilizzando lo strumento linea retta per disegnare su tutta la lunghezza o la larghezza del pilus e poi premere "Ctrl-M" per misurare ogni pilus. Osservare una finestra di dialogo con i valori misurati. Registrare questi valori o copiare e incollare in un programma di foglio di calcolo.
- Utilizzare la lunghezza e la larghezza dei parametri stabiliti in precedenza 24, caratteristiche non tengono conto che non si adattano al profilo di Cag-T4SS. Poi quantificare il numero di pili in base ai valori che rientrano nelle cut-off 10-13 nm di larghezza e 60-150 nm di lunghezza.
- Analizzare la quantificazione dei pili statisticamente con il test t di Student a due code utilizzando il software GraphPad Prism.
5. Opzionale: Valutazione della secrezione di IL-8 in correlazione con Pilus produzione
- Utilizzando surnatanti dal punto 2.1, eseguire un IL-8 ELISA secondo le istruzioni del produttore con il kit (vedi Materiali e attrezzature Tabella).
- Analizzare l'IL-8 secreto dalle cellule ospiti e calcolare la percentuale di IL-8 induzione rispetto al WT PMSS1 coltivate in terreno da solo. Eseguire l'analisi statistica con due code il test t di Student con GraphPad Prism cosìftware.
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Representative Results
In questa relazione, abbiamo dimostrato che le condizioni di diversa disponibilità di ferro hanno la capacità di modulare H. pylori Cag-T4SS pilus biogenesi all'interfaccia patogeno host. Quando coltivate in terreno da solo, H. pylori fa una media di 3 pili / cell. Quando H. pylori è coltivato in ferro esaurire condizioni (utilizzando il chelante dipiridile sintetico) che sono sub-inibitorio per la crescita batterica (Figura 1), i batteri producono numerosi Cag-T4SS pili (~ 7 pili / cell) quando co-coltura con cellule gastriche umane (Figura 2). Al contrario, quando una fonte esogena di ferro nutriente è presente, la formazione di Cag-T4SS pili è represso (meno di 1 pilus / cella campione FE, meno di 1 pilus / cella campione DIP FE +) (Figura 2). Quantificazione del pili all'interfaccia ospite-patogeno rivela che in condizioni di restrizione ferro, H. pylori presenta un aumento di 2 volte in Cag-T4SS pili (p <0.000 1) e la percentuale delle cellule piliated aumenta del 11% (p <0.05) rispetto alle cellule coltivate in terreno da solo (figura 3). È interessante notare che l'attività del Cag-T4SS, misurata come ospitante la secrezione di IL-8, si arricchisce 107% in condizioni di restrizione di ferro e repressa 49% in condizioni di disponibilità ferro in eccesso rispetto al mezzo da solo (p = 0,03 e p < 0,001, rispettivamente) un risultato che supporta i dati SEM. Tuttavia, le dimensioni pili rimangono costanti tra tutte le condizioni di disponibilità di ferro (Figura 4). Inoltre, la disponibilità di ferro non cambia la biogenesi della pili sulla superficie di un mutante gabbia, e non cambia la capacità di questo derivato isogenico di indurre una risposta di IL-8 da cellule ospiti, supportando l'ipotesi che le strutture dimostrate sono, infatti, cag-T4SS e non una feature di superficie non correlato aggiuntiva.
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Figura 1:. La vitalità batterica determinata in varie condizioni di disponibilità di ferro H. pylori è stato coltivato in brodo brucella modificata da solo (solo terreno), o integrato con 100 mM FeCl 3 (FE), 200 mM dipiridile (DIP), o 200 micron dipiridile più 250 mM FeCl 3 (FE + DIP). I batteri sono stati diluiti serialmente e piastrate su terreno batteriologica prima dell'incubazione per 2 giorni a 37 ° C in presenza del 5% di CO 2. Le colonie sono state contate e unità formanti colonie / ml (CFU / ml) sono stati calcolati. Barre indicano la media di tre esperimenti indipendenti +/- SEM. Il trattamento con DIP, FE, o FE + DIP non altera in modo significativo la vitalità batterica.
Figura 2: alta rLa microscopia elettronica a scansione isoluzione analisi di H. pylori Cag-T4SS pili. I batteri sono stati coltivati in A) solo terreno, B) medie integrate con 100 mM FeCl 3, C) medio integrato con 200 mM dipiridile, o D) mezzo supplementato con 200 mM dipiridile più 250 pM FeCl 3 prima della co-coltura con AGS umana cellule gastriche. Le frecce indicano Cag-T4SS pili formata all'interfaccia ospite-patogeno. I campioni sono stati analizzati mediante alta risoluzione microscopia elettronica a scansione per valutare Cag-T4SS biogenesi. Condizioni di Bassa disponibilità di ferro aumentano la prevalenza di Cag-T4SS formazione pilus, mentre le condizioni di eccesso di nutrienti disponibili ferro reprimono Cag-T4SS formazione pilus.
Figura 3: Quantificazione dei pili / cellulare e cento piliated cellule coltivate in varicondizioni di disponibilità di ferro. I batteri sono stati coltivati in brodo brucella modificata da solo (solo terreno), o media integrati con 100 mM FeCl 3 (FE), 200 mM dipiridile (DIP), o 200 micron dipiridile più 250 mM FeCl 3 (FE + DIP) prima di co coltura con cellule epiteliali gastriche umane. I campioni sono stati analizzati mediante alta risoluzione microscopia elettronica a scansione e pili stati enumerati utilizzando il software ImageJ. A) dispersione di pili per cella (* p <0,0001 rispetto al solo terreno) e B) Istogramma raffigurante percentuale di cellule piliated (* p <0,05 rispetto al solo terreno) derivate 60-112 cellule per coltura condizione derivato da 3 separata esperimenti biologici.
Figura 4: dimensioni pilus misurate da cellule coltivate in diverse condizioni di disponibilità di ferro. Bacteria sono state coltivate in brodo brucella modificata da solo (solo terreno), o media integrato con 100 mM FeCl 3 (FE), 200 mM dipiridile (DIP), o 200 micron dipiridile più 250 mM FeCl 3 (FE + DIP) prima di co coltura con cellule epiteliali gastriche umane. I campioni sono stati analizzati mediante ad alta risoluzione microscopia elettronica a scansione e le dimensioni pili sono stati misurati utilizzando il software ImageJ. A) Larghezza Pilus è una media di 13,1 +/- 2,4 nm fra tutte le condizioni. B) Lunghezza Pilus è una media di 75,8 +/- 16,0 nm fra tutte le condizioni. Nessuna significativa differenza di dimensioni pilus sono visti nelle varie condizioni di disponibilità di ferro.
Supplemento Figura 1: ad alta risoluzione microscopia elettronica a scansione analisi di H. pylori gabbia mutante in varie condizioni di disponibilità di ferro. I batteri sono stati coltivati in A) media integrato con 100 mM FeCl 3, B) media integrati con 200 mM dipiridile (DIP) o C) media integrato con 200 mM dipiridile (DIP) più 250 micron FeCl 3 prima di co-coltura con cellule gastriche umane AGS. I campioni sono stati analizzati mediante alta risoluzione microscopia elettronica a scansione per valutare Cag-T4SS biogenesi. Condizioni di ferro basso o alto non modulano alcun pilus biogenesi Cag-indipendente, supportando l'ipotesi che le strutture visualizzate nella Figura 2 sono Cag-T4SS pili.
Supplemento Figura 2: analisi ELISA dell'host secrezione di IL-8 in risposta ai batteri coltivati in condizioni di diversa disponibilità di ferro. Wild-type (barre bianche) o gabbia mutante (barre grigie) batteri sono stati coltivati in brodo brucella modificata da solo (solo terreno), o media integrati con 100 mM FeCl 3 (FE), 200 mM dipiridile (DIP), o 200 micron dipiridile oltre 250 uM FeCl 3 (FE + DIP) prima di co-coltura con cellule epiteliali gastriche umane. Ferro risultati di restrizione in aumento IL-8, Una risposta dell'ospite che dipende l'attività Cag-T4SS. Barre indicano la media +/- SEM, derivato da 3 esperimenti biologici separati. (* P <0,05 rispetto al PMSS1 coltivate in terreno da solo).
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Discussion
Il ferro è un micronutriente essenziale per la maggior parte delle forme di vita, compresi i batteri patogeni. Nel tentativo di limitare la validità di microrganismi invasori, ospiti vertebrati sequestrano il ferro di nutrienti in un processo noto come "immunità nutrizionale" 18. In risposta a questo, batteri patogeni sono evoluti per utilizzare il ferro come molecola di segnalazione globale di percepire l'ambiente circostante e regolano l'elaborazione delle caratteristiche di virulenza come sistemi di acquisizione ferro, tossine e tossine secrezione macchine 19,20.
H. pylori richiede micronutrienti quali ferro, zinco e magnesio crescere 22 e può utilizzare fonti di ferro alternativi come eme, emoglobina, transferrina e lattoferrina 23. H. pylori, come la maggior parte agenti patogeni di successo, si è sviluppato un vasto repertorio di fattori di virulenza per aiutarla a pulire i nutrienti ferro dall'host 21. Un fattore di virulenza, CagA, il molecu effettorele della Cag-T4SS, è implicato nel reinstradamento transferrina dal lato basolaterale delle cellule polarizzate alla superficie apicale dove può essere facilmente utilizzato dalle cellule batteriche come fonte di ferro nutrienti e promuovere replica 15. Così, sembra una strategia evolutiva intuitivo per promuovere la secrezione di CagA in condizioni di bassa disponibilità di ferro.
Il H. pylori Cag-T4SS è un importante organello batterica, a causa delle risposte della cellula ospite proinfiammatorie che suscita. Gli effetti della Cag-T4SS sono stati studiati in entrambi co-colture e modelli animali di infezione. Tuttavia, studi sulla struttura macromolecolare e la composizione di questo sistema di secrezione della tossina sono stati ostacolati dalla mancanza di protocolli di imaging ad alta risoluzione. I nostri rapporti precedentemente pubblicati che studiano il Cag-T4SS hanno riportato una media di quattro Cag-T4SS pili per cellula batterica ad alta risoluzione microscopia elettronica analisi 24. Il nostro metodo fornisce una miglioreuna tecnica di imaging robusto per visualizzare il Cag-T4SS utilizzando una tecnica di coltura che promuove la produzione di tale funzione sulla superficie della cellula batterica. L'utilizzo di tecniche di coltura unitamente ad alta risoluzione campo di emissione gun microscopio elettronico a scansione è critico per questo protocollo di imaging. Arricchimento duplice della feature di superficie Cag-T4SS è un aumento significativo per i ricercatori interessati a svolgere analisi immunoistochimica quali le tecniche di immunofluorescenza o immunoprecipitazione per caratterizzare ulteriormente la posizione subcellulare o la composizione del Cag-T4SS. Una volta che l'alta risoluzione microscopia elettronica di imaging del Cag-T4SS è stato masterizzato, è anche possibile sviluppare altre applicazioni, come immuno-etichettatura, per determinare la posizione delle proteine batteriche rispetto al pilus Cag-T4SS 25.
Un limite della nostra tecnica è il fatto che il ricercatore è ancora limitata a USIng un sistema di co-coltura per la visualizzazione del Cag-T4SS. In un singolo campo, solo un sottoinsieme di H. pylori in normali condizioni di coltura formano queste strutture (circa il 50-70 per cento, vedi Figura 3 Pannello B). Così numerose cellule in un campo saranno non piliated. Non è noto il motivo per cui esistono queste sottopopolazioni nella stessa posizione, ma queste cellule sono sempre rappresentato all'interno di entrambe le quantificazioni di Pili / cellule e la percentuale di cellule con pili sulla superficie. Poiché il Cag-T4SS si osserva solo alla interfaccia host-batterica, i passaggi di fissaggio primario e secondario all'interno della preparazione del campione SEM sono critici per la conservazione di entrambe le strutture proteiche e le membrane delle cellule eucariotiche e procariotiche. Tuttavia, nel corso fissazione può verificarsi se vengono effettuate operazioni di fissaggio più a lungo di quanto delineati, o se non sono preparati al momento le soluzioni. In caso di fissazione eccessiva, i campioni avranno un aspetto di pietra se vista sotto SEM e il Cag-T4SS venga mascherato da questo. Per GUAeshoot, ripetere la preparazione del campione SEM utilizzando fissativi meno concentrati e / o in meno tempo incubati alla presenza del fissativo.
Il sistema di co-coltura rende inoltre caratterizzazione biochimica (ad esempio analisi di spettrometria di massa) ingombrante a causa della contaminazione di grandi quantità di proteine ospite. Tuttavia, la comprensione dei meccanismi molecolari che regolano la produzione di questo sistema di secrezione batterica potrebbe in ultima analisi portare a nuove tecniche che attiveranno Cag-T4SS formazione pilus in assenza di cellule ospiti. Ciò migliorerebbe notevolmente le tecniche di isolamento e purificazione per saggi biochimici.
In conclusione, si segnala che le condizioni di limitata disponibilità di ferro risultato in un aumento della produzione di H. pylori Cag-T4SS che può essere visualizzato con alta risoluzione tecniche di microscopia elettronica a scansione. Segnaliamo anche la repressione di ferro-dipendente di questa caratteristica superficie alla interfa ospite-patogenoce. Il test può essere ottimizzato e utilizzato per numerosi batteri patogeni che si formano tossine-secrezioni ferro-regolamentato ed è ampiamente applicabile ad una varietà di interazioni ospite-microbo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Modified brucella broth | |||
| Peptone from casein (10 g/L) | Sigma | 70172 | |
| Peptic digest of animal tissue (10 g/L) | Sigma | 70174 | |
| Yeast extract (2 g/L) | Sigma | 92144 | |
| Dextrose (1 g/L) | Sigma | D9434 | |
| Sodium chloride (5 g/L) | Thermo Fisher | S271-10 | |
| Cholesterol (250X) (4 ml/L) | Life Technologies | 12531018 | |
| Ferric chloride (100 or 250 uM) | Sigma | 157740-100G | |
| Dipyridyl (200 uM) | Sigma | D216305-100G | |
| Modified RPMI | |||
| RPMI+HEPES (1X) | Life Technologies | 22400-121 | |
| Fetal bovine serum (100 ml/L) | Life Technologies | 10438-026 | |
| Electron Microscopy Preparation | |||
| Paraformaldehyde (2.0% aqueous) | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Gluteraldehyde (2.5% aqueous) | Electron Microscopy Sciences | 16220 | |
| Sodium cacodylate (0.05 M) | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| Osmium tetroxide (0.1% aqueous) | Electron Microscopy Sciences | 19150 | |
| Ethanol (absolute) | Sigma | E7023 | |
| Colloidal silver paint | Electron Microscopy Sciences | 12630 | |
| SEM sample stubs | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
| Coverslips | Thermo Fisher | 08-774-383 | |
| IL-8 Secretion Evaluation | |||
| Quantikine IL-8 ELISA kit | R&D Systems | D8000C |
References
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