Protocol
1. H. Crecimiento pylori en distintas situaciones de disponibilidad de hierro y co-cultivo con células gástricas epiteliales humanas
- Seleccione H. PMSS1 pylori cepa para estos estudios debido a que tiene una isla de patogenicidad cag intacta y expresa un sistema de secreción de tipo IV funcionamiento. También utilizar un mutante cagE isogénica (PMSSI Δ jaula) como un control negativo. Crecer las bacterias en placas de TSA suplementadas con 5% de sangre de oveja (placas de agar sangre) durante 24 horas a 37 ° C en presencia de 5% de CO 2.
NOTA: Preparar reactivos y ensamblar materiales como se indica en la Tabla de Materiales y Equipos. Las concentraciones finales de cada reactivo se enumeran entre paréntesis. - Raspe las bacterias de la placa utilizando un aplicador con punta de algodón estéril e inocular en caldo brucella modificado preparado a partir de los componentes (ver Materiales y Equipos tabla) y se completará con el colesterol. Incubar durante una noche a 37 culturas° C en aire ambiente, complementado con 5% de CO 2 con agitación a 200 revoluciones por minuto (rpm).
NOTA: El colesterol se utiliza en lugar de suero bovino fetal debido al hecho de que el suero es complejo; que contiene numerosas fuentes de hierro de nutrientes tales como heme que provoca variabilidad en los resultados. - En el día de cultivo bacteriano, semilla de células epiteliales gástricas humanas AGS (ATCC CRL-1739) sobre cubreobjetos tratados con poli-D-lisina en placas de 12 pocillos (alrededor de 1 x 10 5 células por pocillo).
- El día siguiente, diluir cultivos bacterianos a una DO600 de 0,3 en caldo Brucella modificado solo o suplementado con 100 mM FeCl 3, 200 dipiridilo mu M (un quelante de hierro sintético), o 200 mM dipiridilo más 250 M FeCl 3. Incubar estos cultivos durante 4 horas a 37 ° C en aire ambiente, complementado con 5% de CO 2 con agitación a 200 rpm.
- Bacterias centrifugar a 1000 xg para recoger las células y eliminar los sobrenadantes antes de resuspender in un volumen igual de caldo de Brucella modificado fresco suplementado con colesterol. Medida DO600 del cultivo (OD600 = 1,0 = 5,5 x 10 8 células / ml) y añadir las bacterias a las células epiteliales en una multiplicidad de infección (MOI) de 20: 1. Realizar diluciones en serie y las células bacterianas de la placa sobre placas de agar de sangre para evaluar la viabilidad celular bacteriana.
- Incubar H. células epiteliales gástricas humanas pylori y AGS co-cultivos de 4 horas a 37 ° C en presencia de 5% de CO 2 en condiciones estáticas antes de realizar la microscopía electrónica de barrido (SEM) de preparación de muestras.
2. Preparación de muestras para SEM Visualice H. pylori CagA-T4SS Pili
- Retire H. pylori y co-cultivos AGS de la incubadora y decantar el sobrenadante de cultivo (a ahorrar para la IL-8 ELISA). Lavar suavemente tres veces con 0,05 M tampón de cacodilato de sodio (pH 7,4). Fijar las muestras durante 2-4 horas a temperatura ambiente en una solución de 2,0% de paraformaldehído, 2.5% De glutaraldehído, y tampón de cacodilato de sodio 0,05 M. Después de la fijación primaria, lavar las muestras tres veces con tampón de cacodilato de sodio 0,05 M.
- Realizar fijación secundaria usando 0,1% de tetróxido de osmio en tampón de cacodilato de sodio 0,05 M secuencial en dos pasos 10 min de fijación. Después de la fijación secundaria, lavar las muestras tres veces con tampón de cacodilato de sodio 0,05 M.
- Después de la fijación primaria y secundaria, deshidratar muestras por lavado secuencial con concentraciones crecientes de etanol según la Tabla 1.
- Después de la deshidratación de etanol, realizar tres lavados secuenciales de dióxido de carbono líquido. A continuación, las muestras secas en un punto crítico utilizando una máquina secadora de punto crítico a una temperatura de 31,1 ° C y la presión de 1,073 psi.
- Monte cubreobjetos en aluminio SEM talones de la muestra y la pintura con una línea delgada de plata coloidal en el borde de la muestra para lograr la conexión a tierra apropiada y evitar la carga durante la proyección de imagen SEM.
- Muestras Coat con 5 nm deoro-paladio usando una máquina de capa por pulverización catódica para aumentar la señal de electrones secundarios de la muestra y efecto de borde.
3. Los parámetros de imagen para análisis de alta resolución de SEM
- Ver muestras con una emisión de campo Pistola microscopio electrónico de barrido (FEG-SEM).
- Image en un modo de alto vacío a una distancia de trabajo de 5-10 mm.
- Ajuste el voltaje de aceleración a 5 kV.
- Establecer tamaño de punto a 2-2,5.
- Incline la muestra entre 15-25 grados para conseguir una mejor vista de la interfaz de huésped-patógeno.
- Dar prioridad a la formación de imágenes bacterias adheridas a los bordes de las células epiteliales para la visualización de gran aumento, ya que estas áreas de interacción huésped-patógeno se enriquecen para las bacterias de formación de pili.
4. Los análisis estadísticos para Evaluar Pili cuantificaciones
- Analizar H. pili pylori Cag-T4SS utilizando el software ImageJ para cuantificar número de pili / célula, así como por ciento de células que presentan el piliated phenotype según las instrucciones de abajo.
- Micrografía archivos abiertos en el software ImageJ. Identificar pili como estructuras formadas entre la célula bacteriana y la célula huésped, con anchura uniforme (10-13 nm) y la longitud (60-150 nm).
NOTA: La estructura pilus está presente en cepas bacterianas WT, pero ausente en las cepas isogénicas tales como cepas mutantes Δ jaula, que albergan una inactivación en el gen que codifica la ATPasa importante que el conjunto de la secreción de tipo IV poderes pilus. - Calibrar la herramienta de medición dibujando una línea con la herramienta de línea recta y luego hacer clic en la pestaña "Analizar". Seleccione "Escala de Ajuste" en el menú desplegable e introduzca el valor de la barra de ampliación en el cuadro denominado "distancia conocida" y establecer la unidad de longitud en el valor adecuado (nm). Haga clic en "Aceptar".
- Mida pili Cag-T4SS utilizando la herramienta de línea recta para dibujar sobre la longitud o anchura del pilus y luego presione "Ctrl-M" para medir cada pilus. Observar un cuadro de diálogo con los valores medidos. Anote estos valores o copiar y pegar en un programa de hoja de cálculo.
- Utilice la longitud y el ancho de los parámetros previamente establecidos 24, hacen caso omiso de las características que no se ajustan al perfil de Cag-T4SS. Entonces cuantificar el número de pili sobre la base de los valores que están dentro de los puntos de corte 10-13 nm de anchura y 60-150 nm de longitud.
- Analizar la cuantificación de pili estadísticamente por la prueba t de Student de dos colas utilizando el software GraphPad Prism.
5. Opcional: Evaluación de la IL-8 secreción que se correlaciona con Pilus Producción
- El uso de sobrenadantes de la Etapa 2.1, realizar una IL-8 ELISA según las instrucciones del fabricante con el kit (véase Materiales y Equipo Tabla).
- Analizar la IL-8 secretada por las células huésped y calcular el porcentaje de inducción de IL-8 con respecto a WT PMSS1 crecido en medio solo. Realizar el análisis estadístico utilizando dos colas la prueba t de Student utilizando GraphPad Prisma asíftware.
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Representative Results
En este informe, hemos demostrado que las condiciones de variación de la disponibilidad de hierro tienen la capacidad de modular H. pylori CagA-T4SS biogénesis pilus en la interfaz de patógenos de acogida. Cuando se cultivan en medio solo, H. pylori forma un promedio de 3 pili / célula. Cuando H. pylori se cultiva en condiciones de agotar hierro (utilizando el dipiridilo quelante sintético) que son sub-inhibidor al crecimiento bacteriano (Figura 1), las bacterias producen numerosos Cag-T4SS pili (~ 7 pili / célula) cuando se co-cultivaron con células gástricas humanas (Figura 2). A la inversa, cuando una fuente exógena de hierro nutriente está presente, la formación de Cag-T4SS pili se reprime (menos de 1 pilus / célula en la muestra FE, menos de 1 pilus / célula en la muestra DIP FE +) (Figura 2). La cuantificación de los pili en la interfase huésped-patógeno revela que en condiciones de restricción de hierro, H. pylori exhibe un aumento de 2 veces en Cag-T4SS pili (p <0,000 1) y las células ciento piliated aumenta en 11% (p <0,05) en comparación con células cultivadas en medio solo (Figura 3). Curiosamente, la actividad de la Cag-T4SS, tal como se mide por el anfitrión secreción de IL-8, se ha mejorado 107% bajo condiciones de restricción de hierro y reprimida 49% bajo condiciones de exceso de disponibilidad de hierro en comparación con el medio solo (p = 0,03 y p < 0,001, respectivamente) un resultado que apoya los datos SEM. Sin embargo, las dimensiones de pili siguen siendo coherentes entre todas las condiciones de disponibilidad de hierro (Figura 4). Además, la disponibilidad de hierro no cambia la biogénesis de pili en la superficie de un mutante de jaula, ni cambia la capacidad de este derivado isogénica para inducir una respuesta de IL-8 a partir de células anfitrionas, apoyando la hipótesis de que las estructuras demostradas son, de hecho, Cag-T4SS y no una característica superficial relacionada adicional.
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Figura 1:. Viabilidad bacteriana se determina en diversas condiciones de disponibilidad de hierro H. pylori se cultivó en caldo brucella modificado solo (medio solo), o complementado con 100 M de FeCl3 (FE), 200 M dipiridilo (DIP), o 200 dipiridil M más 250 M de FeCl3 (FE + DIP). Las bacterias se diluyeron en serie y se sembraron en medio bacteriológico antes de la incubación durante 2 días a 37 ° C en presencia de 5% de CO 2. Se contaron las colonias y las unidades formadoras de colonias se calcularon / mL (UFC / ml). Las barras indican media de tres experimentos independientes +/- SEM. El tratamiento con DIP, FE, o Fe + DIP no altera significativamente la viabilidad bacteriana.
Figura 2: Alta ranálisis de microscopía electrónica de barrido esolución de H. pili pylori CagA-T4SS. Las bacterias se cultivaron en A) medio solo, B) el medio suplementado con 100 mM FeCl 3, C) el medio suplementado con 200 dipiridilo mu M, o D) el medio suplementado con 200 mM dipiridilo más 250 M FeCl 3 antes de co-cultivo con AGS humana las células gástricas. Las flechas indican pili Cag-T4SS formado en la interfase huésped-patógeno. Las muestras se analizaron por de alta resolución microscopía electrónica de barrido para evaluar Cag-T4SS la biogénesis. Condiciones de baja disponibilidad de hierro aumentan la prevalencia de la formación del pilus Cag-T4SS, mientras que las condiciones de exceso de hierro de nutrientes disponibles reprimen la formación del pilus Cag-T4SS.
Figura 3: Cuantificación de pili / celular y ciento piliated células cultivadas en varioscondiciones de disponibilidad de hierro. Las bacterias se cultivaron en caldo Brucella modificado solo (medio solo) o medio suplementado con 100 mM FeCl 3 (FE), 200 mM dipiridilo (DIP), o 200 mM dipiridilo más 250 M FeCl 3 (FE + DIP) antes de la co- cultivo con células epiteliales gástricas humanas. Las muestras se analizaron por de alta resolución microscopía electrónica de barrido y pili se enumeraron usando el software ImageJ. A) Diagrama de dispersión de pili por célula (* p <0,0001 en comparación con medio solo) y B) Gráfico de barras que representa el porcentaje de células piliated (* p <0,05 en comparación con medio solo) derivados 60-112 células por cultivo condición de deriva de 3 separada experimentos biológicos.
Figura 4: Dimensiones de pilus medidos a partir de células cultivadas en diferentes condiciones de disponibilidad de hierro. Bacteria se cultivaron en caldo Brucella modificado solo (medio solo) o medio suplementado con 100 mM FeCl 3 (FE), 200 mM dipiridilo (DIP), o 200 mM dipiridilo más 250 M FeCl 3 (FE + DIP) antes de la co- cultivo con células epiteliales gástricas humanas. Las muestras se analizaron por de alta resolución microscopía electrónica de barrido y las dimensiones de pili se midieron utilizando el software ImageJ. A) anchura Pilus es un promedio de 13,1 +/- 2,4 nm entre todas las condiciones. B) Pilus longitud es un promedio de 75,8 +/- 16,0 nm entre todas las condiciones. No hay diferencia significativa en las dimensiones de pilus se ven en las diversas condiciones de disponibilidad de hierro.
Adicional Figura 1: análisis de alta resolución de la microscopía electrónica de barrido de H. cagE pylori mutante en diversas condiciones de disponibilidad de hierro. Las bacterias se cultivaron en A) el medio suplementado con 100 mM FeCl 3, B) el medio suplementado con 200 mM dipiridilo (DIP) o C) el medio suplementado con 200 mM dipiridilo (DIP), además de 250 M FeCl 3 para co-cultivo antes con células gástricas humanas AGS. Las muestras se analizaron por de alta resolución microscopía electrónica de barrido para evaluar Cag-T4SS la biogénesis. Condiciones de hierro de baja o alta no se modulan cualquier biogénesis pilus Cag-independiente, apoyando la hipótesis de que las estructuras visualizadas en la Figura 2 son pili Cag-T4SS.
Adicional Figura 2: análisis ELISA de acogida la secreción de IL-8 en respuesta a las bacterias cultivadas en condiciones de disponibilidad de hierro variable. De tipo salvaje (barras blancas) o mutante jaula (barras grises) las bacterias se cultivaron en caldo Brucella modificado solo (medio solo) o medio suplementado con 100 mM FeCl 3 (FE), 200 mM dipiridilo (DIP), o 200 mM dipiridilo más 250 uM FeCl3 (FE + DIP) para co-cultivo antes con las células epiteliales gástricas humanas. Resultados de restricción de hierro en el aumento de la IL-8, Una respuesta del huésped que depende de la actividad Cag-T4SS. Las barras indican la media +/- SEM, derivado de 3 experimentos biológicos separados. (* P <0,05 en comparación con PMSS1 crecido en medio solo).
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Discussion
El hierro es un micronutriente esencial para la mayoría de las formas de vida, incluyendo los patógenos bacterianos. En un esfuerzo para restringir la viabilidad de los microorganismos invasores, los huéspedes vertebrados secuestran hierro de nutrientes en un proceso conocido como "inmunidad nutricional" 18. En respuesta a esto, los patógenos bacterianos han evolucionado para utilizar el hierro como una molécula de señalización global para percibir su entorno y regular la elaboración de características de virulencia tales como sistemas de adquisición de hierro, toxinas, y la toxina maquinaria de secreción 19,20.
H. pylori requiere micronutrientes tales como hierro, zinc, y magnesio para crecer 22 y puede utilizar fuentes de hierro alternativos tales como hemo, hemoglobina, transferrina, lactoferrina y 23. H. pylori, como la mayoría de los patógenos de éxito, se ha desarrollado un amplio repertorio de factores de virulencia para evitarlo scavenge hierro nutrientes del huésped 21. Un factor de virulencia, CagA, el efector molecule de la Cag-T4SS, está implicada en reencaminamiento transferrina desde el lado basolateral de las células polarizadas a la superficie apical en los que puede ser utilizado fácilmente por las células bacterianas como una fuente de hierro de nutrientes y promover la replicación 15. Por lo tanto, parece una estrategia evolutiva intuitiva para promover la secreción de CagA en condiciones de baja disponibilidad de hierro.
El H. pylori Cag-T4SS es un orgánulo bacteriana importante, debido a las respuestas de las células huésped proinflamatorias que provoca. Los efectos de la Cag-T4SS han sido bien estudiadas en los dos co-culturas y modelos animales de infección. Sin embargo, los estudios de la estructura macromolecular y la composición de este sistema de secreción de la toxina se han visto obstaculizados por la falta de protocolos de imagen de alta resolución. Nuestros informes previamente publicados que estudian el Cag-T4SS han reportado un promedio de cuatro pili Cag-T4SS por célula bacteriana por microscopía electrónica de alta resolución análisis 24. Nuestro método mejorado ofreceuna técnica de imagen robusta para visualizar el Cag-T4SS mediante el uso de una técnica de cultivo que promueve la producción de esta característica en la superficie de la célula bacteriana. Utilización de técnicas de cultivo en conjunto con alta resolución de emisión de campo arma microscopio electrónico de barrido es crítico para este protocolo de formación de imágenes. Enriquecimiento de dos veces de la característica de la superficie Cag-T4SS es un aumento significativo para los investigadores interesados en la realización de análisis inmunohistoquímicos tales como técnicas de inmunofluorescencia o de inmunoprecipitación Para caracterizar adicionalmente la localización subcelular o composición de la Cag-T4SS. Una vez que la formación de imágenes de alta resolución de la microscopía electrónica de Cag-T4SS se ha dominado, también es posible desarrollar otras aplicaciones, tales como inmuno-etiquetado, para determinar la ubicación de las proteínas bacterianas con respecto a la pilus Cag-T4SS 25.
Una limitación de nuestra técnica es el hecho de que el investigador está todavía restringido a USIng un sistema de co-cultivo para la visualización de la Cag-T4SS. En un único campo, sólo un subconjunto de H. pylori en condiciones normales de cultivo forman estas estructuras (alrededor de 50-70 por ciento, véase la Figura 3 Panel B). Así que numerosas células en un campo serán no piliated. No se sabe por qué existen estas subpoblaciones en la misma ubicación, pero estas células siempre se contabilizan dentro de ambos las cuantificaciones de pili / célula y el porcentaje de células con pili en la superficie. Debido a que el CAG-T4SS sólo se observa en la interfase huésped bacteriano, los pasos primarios y secundarios de fijación dentro de la preparación de la muestra SEM son críticos para la preservación de las estructuras proteicas y las membranas de las células eucariotas y procariotas. Sin embargo, durante la fijación se puede producir si los pasos de fijación se llevan a cabo más largo que describen, o si las soluciones no se preparan. Si se produce un exceso de la fijación, las muestras tendrán una apariencia pétrea cuando se ve bajo el SEM y Cag-T4SS será enmascarado por la presente. Para Troubleshoot, repetir la preparación de la muestra SEM utilizando fijadores menos concentradas y / o menos tiempo se incubaron en presencia del fijador.
El sistema de co-cultivo también hace que la caracterización bioquímica (tales como los análisis de espectrometría de masas) engorroso debido a la contaminación de grandes cantidades de proteínas del huésped. Sin embargo, la comprensión de los mecanismos moleculares que regulan la producción de este sistema de secreción bacteriana podría, en última instancia conducir a nuevas técnicas que activarán la formación de pilus Cag-T4SS en ausencia de células huésped. Esto mejorará en gran medida las técnicas de aislamiento y purificación de los ensayos bioquímicos.
En conclusión, nos informan de que las condiciones de restringido resultado la disponibilidad de hierro en una mayor producción de H. pylori CagA-T4SS que puede ser visualizado por técnicas de microscopía electrónica de barrido de alta resolución. Nos informan también de la represión de hierro que dependen de esta característica en la superficie Interfa huésped-patógenoce. Este ensayo puede ser optimizado y utilizada para numerosos patógenos bacterianos que forman la toxina secreciones reguladas por hierro y es ampliamente aplicable a una variedad de interacciones huésped-microbio.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Modified brucella broth | |||
| Peptone from casein (10 g/L) | Sigma | 70172 | |
| Peptic digest of animal tissue (10 g/L) | Sigma | 70174 | |
| Yeast extract (2 g/L) | Sigma | 92144 | |
| Dextrose (1 g/L) | Sigma | D9434 | |
| Sodium chloride (5 g/L) | Thermo Fisher | S271-10 | |
| Cholesterol (250X) (4 ml/L) | Life Technologies | 12531018 | |
| Ferric chloride (100 or 250 uM) | Sigma | 157740-100G | |
| Dipyridyl (200 uM) | Sigma | D216305-100G | |
| Modified RPMI | |||
| RPMI+HEPES (1X) | Life Technologies | 22400-121 | |
| Fetal bovine serum (100 ml/L) | Life Technologies | 10438-026 | |
| Electron Microscopy Preparation | |||
| Paraformaldehyde (2.0% aqueous) | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Gluteraldehyde (2.5% aqueous) | Electron Microscopy Sciences | 16220 | |
| Sodium cacodylate (0.05 M) | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| Osmium tetroxide (0.1% aqueous) | Electron Microscopy Sciences | 19150 | |
| Ethanol (absolute) | Sigma | E7023 | |
| Colloidal silver paint | Electron Microscopy Sciences | 12630 | |
| SEM sample stubs | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
| Coverslips | Thermo Fisher | 08-774-383 | |
| IL-8 Secretion Evaluation | |||
| Quantikine IL-8 ELISA kit | R&D Systems | D8000C |
References
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