Summary
受体运输调节信号传导和细胞反应的配体和是，本身，响应于细胞的条件，包括配体诱导的信号传导。在这里，我们描述了一个强大而灵活的技术评估定量使用免疫标记和colocalizational分析药物诱导的受体贩卖。
Introduction
受体，尤其是G蛋白偶联受体（GPCR），例行贩卖细胞内，并从细胞表面1。这些复杂地策划和严格控制的流程决定细胞的受体提供补充和调节受体活性的时间，脱敏和复敏2 - 4。重要的是，这些方法是响应于蜂窝环境中，包括药物诱导的受体活性或不活动。也就是说，配体在受体的行动可以改变这些受体的细胞内转运，从而改变细胞的反应。以这种方式，外部的配体在细胞功能的更多的效果发挥的是，甚至超出古典信使到效应器级联5,6。
审视这种变化引起的受体运输是困难的。所有可用的技术包括限制。生物素保护测定法已被用于MONI器表面受体的人群。这些受体的生物素化和免疫沉淀的时间过程被执行以量化在一段时间内的生物素化的受体的减少。这种技术基本上是监视一个初始的，标记的人口受体7的逐渐退化，并且是在构建这个过程的时间进程非常有用的。不幸的是，该测定是无法监测任何比受体如内化，回收或新受体的原始池的劣化等过程。此外，除了在150kDa范围在的50kDa范围内的受体的抗体的可改变该受体的贩卖8,9，并且该技术可能难以与低表达级别受体使用。
其他程序使用各种方法来确定细胞内运输隔室（ 例如，内体等），并且评估其共定位与感兴趣的受体。这包括了我们Ë异源表达系统的荧光蛋白标记的受体和隔间的标记（ 如 RAB-GTP酶家族）的嵌合结构。这潜在地允许使用活细胞成像，去除与固定和透化的问题。虽然功能强大，这样的策略，从异源系统中一般的相同的限制患有：标记和表达水平的影响对贩卖行为和不兼容的多种生理代表性的细胞类型。更普遍，染料用于轻松标记细胞内间隔（ 如溶酶体，表面上）10。染料，但是，可以缺乏特异性（染料溶酶体的情况下，所有的酸性细胞器），不要通过其他车厢评估贩卖。尽管如此，这些技术允许相当大的控制系统和实验条件，并且可以从这里提出，下面的共定位的分析方法中受益。
该方法W¯¯E存在这里由共存提炼受体贩卖的跟踪。使用免疫细胞化学（ICC）来标记适当的标记，可以识别多个不同的细胞内隔室中。这也允许在代替异源系统的使用生理学上相关的原代细胞培养的。这ICC协议涉及到固定之前标记感兴趣的细胞;这允许标签在下列药物治疗（多个）特定时间点。这将产生全球性受体室协会“快照”在那个时间点。随着多个时间点，贩运变化也时间过程可以构造。
简言之，将细胞是药物处理，标记对受体和感兴趣胞内区室，共焦成像，并且显微照片进行分析，以数学量化受体和隔室11的共定位。在我们的使用中，我们研究了与镭受体的共定位B5，Rab11，和溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）。这些标记识别早期内涵体，回收内涵体，和溶酶体，分别。这些措施共存作为代理人的内化，再利用和降解12的总体进程。
如同所有的技术，一些限制应该被考虑。由于需要将图像的每一个个体的神经元分析，该技术会变得非常劳动密集取决于所涉及的条件和时间点的数量。所有免疫标记也必须与所造成的固定和通透13细胞超微结构，蛋白定位和表位的辅助作用。
虽然用于与初级感觉神经元的原代培养用原本优化，这种方法与其他单层镀培养模型广泛兼容。
使用数学量化测量电Ë共定位是，值得注意的是，更严格的方法上比用来评估受体转运的变化，这往往依赖于模糊的，主观的措施，如视觉检查，多渠道覆盖14以前的技 术。
这种技术对于其与体内干预（前原代培养物代）广泛的兼容性特别有用的， 在体外的干预（培养物生长期间），以及各种标记的目标15。因此，它可以适合于许多不同的研究问题。
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Protocol
注：此协议是与各种单层镀细胞/组织培养模型，药物治疗方案，并标注大致目标兼容。因此，在实际使用中，许多具体的参数将根据实验设计而有所不同。这里，引用这些用户定义的参数都是通用的。实施例的条件下，作为用于获得代表性的结果，被包括在斜体。
1.解决方案
- 制备洗涤缓冲液通过混合0.1M Tris缓冲高渗（300毫摩尔）盐水和0.05％的吐温20; pH为7.4，在室温。
- 准备封闭液。到的0.05M Tris缓冲高渗（300毫）盐水加0.05％的吐温20,3％牛血清白蛋白（BSA）和0.1％冷的鱼明胶的皮肤和将pH调节至7.4，在室温。
- 制备抗体稀释液中加入0.05％的吐温20,1％BSA，0.1％冷的鱼明胶的皮肤到0.05M的Tris缓冲高渗（300毫摩尔）盐水和将pH调节至7.4，在4℃。
注意：Tris缓冲液的pH值是温度依赖性的。即，在温度变化将改变溶液的pH。为了保持一致性，这些缓冲器应该总是pH调节在它们将被用在其中温度。
2.细胞培养
注意：根据所用细胞类型合适的细胞培养协议将变化。这些程序必须单独优化。详细的细胞培养方法都一应俱全，其中包括16个 。类似的方法用于获得代表性的结果，与显着的差异：
- 从成年动物文化背根神经节的神经元所描述的12。使用成人神经细胞生长培养基来培养细胞。减少神经胶质细胞密度由预镀，而不是谷氨酸。这导致生长在12轮的玻璃盖玻片每板至少有30-60元和相应的神经胶质细胞的混合神经元 - 胶质细胞培养中生长到approximat伊利40％汇合。应当指出的是，在原代培养的神经元将不会复制并通过共培养的神经胶质细胞被推离该板的，如果神经胶质允许过度生长。为了避免影响的神经元，神经胶质数量的物理还原优选化学/药理学方法。
注：在本协议的目的，我们假设感兴趣的细胞生长到他们的实验，理想状态和单层镀。我们发现，在24孔板上镀敷12轮的玻璃盖玻片是最方便的。所有卷和程序描述了适合于在24孔板的一个孔1盖玻片。
培养细胞3.药物治疗
注意：多个顺序的，或重叠，药物治疗是可能的。的药物，剂量/浓度，并用于将依赖于特定的实验曝光的持续时间。
- 取出原有的生长培养基16 注意：重要的是，每个独立的复制（一般为单24孔板培养物）含有相同的公共控制条件。这将允许数据在重复正常化，这对于纠正审间的差异。
- 孵育在原生长条件为48小时16细胞。
- 对于后续药物治疗，重复步骤3.1和3.2与δ啡肽1微米，SNC80 1微米，或车辆，并培育60分钟12。溶解δ啡肽II在水和在40μM的HCl和超声，在水中稀释至1mM溶解SNC80以10mM。
注意：此协议假定药物（多个）已被溶解，使得它们可在在所选择的生长培养基中的所需浓度（多个）中溶解。适当程序这种增溶将取决于所讨论的药物而变化，并且必须单独优化。 - 轻轻洗细胞三次，以约1毫升每次洗涤的洗涤缓冲液。通过从井轻轻抽吸液体，然后迅速，并轻轻地，再填充井用新鲜溶液中，根据需要（在这种情况下，用洗涤缓冲液）进行每次洗涤。
4.固定和免疫组化
注意：特定标记目标将通过实验而变化。在我们的使用中，我们标记三角洲阿片受体（DOR）和Rab5的，拉布11，和LAMP1，为讨论。所述特异性抗体用于将取决于具体的实验。最佳标记条件是依赖于特定的抗体使用（多个）。这个话题的更全面的讨论如下。
- 固定在〜细胞通过浸没在0.1M磷酸盐缓冲盐水将300μl的4％多聚甲醛在37ºC10分钟。
注意：重要的是，在4％的对甲醛被新鲜由于因使用先前冷冻的多聚甲醛的自体荧光制备。 - 轻轻洗细胞3次，以约1毫升每洗清洗缓冲液，如在3.3中描述。
- 孵育细胞中加入300微升封闭缓冲液中进行2小时，在室温。
- 孵育细胞在300μl的抗体稀释液进行48小时的初级抗体在4ºC。在我们的使用中，对DOR初级抗体（兔抗DOR），并之一：Rab5的（小鼠抗Rab5的），拉布11（鼠抗Rab11），和LAMP1（羊抗LAMP1）。
- 轻轻洗细胞三次，以约1毫升每洗清洗缓冲液，如在3.3中描述。
- 孵育细胞与缀合到不同的荧光第二抗体（见下面的讨论）在300微升抗体稀释剂进行1小时，在室温。在此，所有的后续步骤，保护细胞免受光。以获得的代表性结果，使用绿色发光荧光团缀合的抗兔和eith呃发射红色光的荧光团缀合的抗 - 小鼠或红色发光荧光团缀合的抗山羊。
- 轻轻洗细胞3次，以约1毫升每洗清洗缓冲液，如在3.3中描述。
- 留下约1毫升洗涤液，每孔，端着盘子在45°〜取下24孔板12轮的盖玻片，并撬动盖玻片关井地面用细镊子。盖玻片会靠在孔壁，从那里它可以容易地使用镊子除去。
- 安装盖玻片，细胞面朝下，在显微镜载玻片与抗褪色封固剂。
5.显微镜设置
- 使用高放大倍数的物镜（100X），首先找到一个代表性的细胞，以萤光使用成像。
- 配置图像采集设置，记录每一个标记通道8位未压缩的TIFF图像（用于检测每个例如荧光团，488 nm和594纳米），将图像的每一个通道顺序地（或者通过线或帧），并以平均4至6的扫描为最终的图像。最佳的图像分辨率将显微镜专用高，但1024×1024通常会产生很好的效果。
- 切换到共焦成像路径，并通过单元的中心聚焦到Z-平面。
- 优化针孔（通常为1艾里单位），激光功率和光电倍增管电压（增益），并为每个频道偏移。记录这些设置保存/。使用相同的显微镜设置用于成像的所有标记的针对任何给定目标对在同一复制的细胞。
注意：此过程通常会导致足够漂白该单元不应该被成像进行分析。
6.成像
- 使用高倍率的目标（ 如 100X），首先定位一个小区使用萤光成像。
- 切换到共焦成像路径，并通过单元的中心聚焦到Z-平面。一世˚F可用，使用软件缩放/作物以限制扫描区域对感兴趣的细胞。
- 拍摄图像使用的设置每个通道标记以前建立的。重复步骤6.1至6.3，以图像每复制条件15个或更多的细胞，以确保有足够的样本。
7.共定位分析
- 打开对图像（ 例如 ，“绿色”和“红”）中的ImageJ一个细胞。使用图像>颜色>合并通道...命令生成一个RGB图像。
- 绘制所述感兴趣的细胞周围的选择。使用ImageJ的插件“PSC共定位”（11;可从https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/），以量化的指标共存的选定单元格中。
- 录制所需共存措施（通常皮尔森R 17）。重复步骤7.1至7.3的每个细胞成像。 8.数据标准化
- 计算的每个公共控制条件的记录，共定位值的平均值复制的每个标记条件。
注意：例如，神经元中的共定位值的平均值“48小时车辆，60分钟车”中的每一个在每3个标记条件（受体和每3个隔间）3次独立的重复药物条件。 - 相乘的装置由（-1），得到的偏移为每个复制在每个标记条件。添加偏移每个复制在每个标签的条件，在每个重复值共存。
注意：这将正常化的数据，使得平均共定位措施的共同控制条件是0中的每一个标记条件的每个复制。 - 从每个标签条件的所有重复池中的数据。
注：在共存现在可以在重复进行分析。统计肛门ysis将取决于实验设计，但将典型地涉及分析-的方差（ANOVA），随后进行适当的事后测试（ 例如 ，图基）。对于统计资源， 如见，18。
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Representative Results
使用这种技术，有可能对量化以下二者慢性/长期和急性药物治疗在受体后的内化贩卖的变化。后的药物治疗，固定，和标签，高分辨率双通道显微照片被捕获的每个感兴趣细胞。代表图像可与假色共定位组合以生成所说明的图（ 图1）。随后colocalizational分析，如上所述，得到目标靶共定位（ 例如，受体隔室标志物）的定量分数。这些数据然后可用于比较的变化，在这种情况下，受体运输引起的药物治疗（多个）（ 图2）。
与FAL受体和车厢，标志标签图1.代表性显微照片SE-色共定位地图。背根神经节的感觉神经元的原代培养物暴露于长期（48小时）和急性（1小时）药物治疗（左轴标记）。只有一个延长的条件被示为代表性结果。然后将细胞免疫标记为增量阿片受体（DOR）和回收内涵体标志物（饶11）具有不同的初级 - 次级（荧光团共轭）抗体对（顶轴标签）。细胞由两个通道顺序共聚焦显微镜（左列，中心柱）进行成像。代表性图像显示两个标记的靶在两个神经元。一个神经元用延长吗啡接着急性车辆（顶部）处理。其他神经元与吗啡延长其次是急性δ啡肽II（;底部DELT，一个DOR激动剂）处理。除了随后定量colocalizational分析，这些代表性图像进行了处理，以产生假色共定位图（右列）。比例尺笑瓦特10微米。从12岁以下CC BY-NC 3.0的规定调整。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.定量共定位分数可以用来比较变化受体后的内化贩卖。背根神经节感觉神经元的原代培养物暴露于延长（48小时）和急性（1小时）的药物治疗（x轴标签）。只有一个延长的条件被示为代表性结果。然后将细胞immunolabelled用于DOR和早期内涵体，回收内涵体和溶酶体标记。后测定成像共存的分数，常态化，并汇集跨3 - 4个独立的重复。数据然后通过双向方差分析（分析ANOVA）与杜克的HSD事后。数据表示为平均值+/- 95％置信区间。 *表示P <0.05。很明显，该技术允许诱发急性治疗与δ啡肽II变化DOR后内化贩卖的识别，但不SNC80（两个不同的DOR激动剂）。从12岁以下CC BY-NC 3.0的规定调整。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
我们已经优化了这个协议，成人背根神经节神经元（初级感觉神经元）的原代培养的分析。它也可以使用，很少或根本没有修改，为单层镀培养细胞广泛。该colocalizational分析也有可能在组织切片和其他此类制剂11，但药物治疗和组织固定/制备组分是不恰当的。
有趣的是，这里介绍的IC卡的方法也可以使用，以适当的固定和组织准备，以便在组织切片进行双标记免疫组织化学，不论随后的分析（ 例如，19）。
此协议是与不同的标注大致目标兼容。铺板的细胞的每个盖玻片将双标。通常情况下，这将是感兴趣的受体和感兴趣的隔室之一的一个标志。那里通常将为了检查受体共定位与多个不同区室的多个标记条件。
抗体本身是可变的。适当的标签协议将不同抗体之间变化。这包括合适的抗体浓度，缓冲的食谱，以及时间点。还应当指出的是，不同批次的相同抗体最好被认为是不同的抗体。这样，标记方法和抗体特异性应验证，并在必要时进行了优化，用于抗体和靶组织的每个组合。这里使用的方法是一个很好的起点。这包括不加入二抗（以控制为自发荧光）的和无原发性抗体（以控制非特异性次生标签）处理的样本：当校验标记，它以执行适当的控制是重要的。
有哪些影响因素很多的标记方法设计。值得注意的影响这里介绍的方法的一些因素包括使用Tris缓冲液，高渗盐水，聚山梨酯，BSA和冷鱼皮明胶。磷酸盐缓冲液可能导致更高的非特异性标记，并与一些不常用的标记抗体相互作用。然而，Tris缓冲液是，如上所述，温度敏感。高渗盐的浓度通过破坏离子相互作用减少非特异性标记。有可能以进一步增加盐的浓度超出中指定的内容在这个协议中，如果需要的话。聚山梨酯20作为相对温和的表面活性剂/洗涤剂。这是优选的过度的Triton X-100，它已被报告显著破坏，或者甚至溶解，膜和由此扭曲亚细胞结构。列入低浓度的聚山梨酸酯20中的所有缓冲区是在减少非特异性标记是有用的，因为它提高洗涤的完整性。 BSA是一种常用的封闭剂意占据非特异性蛋白结合位点在靶组织中。有报道称，BSA的可聚集，并导致非特异性点状标记。如果此问题时，也能够与非脂肪干牛奶或额外冷鱼皮明胶代替BSA中。冷鱼皮明胶是一种非哺乳动物蛋白源还打算占用的非特异性蛋白结合位点，同时呈现低的反应性，以针对哺乳动物蛋白20的抗体。
虽然在这个协议没有指定，它是典型的添加，以封闭缓冲液，正常血清从在其中二次抗体升高的物种。典型浓度为1 - 3％。如下文所述，在照顾品种选择必须小心谨慎，避免交叉反应。
当检测两个或更多个荧光标记的目标，适当的荧光团的组合的选择是特别重要的。重要的是要具有良好的光谱SEPA配给以避免串扰。此外，荧光团的选择将取决于在显微镜中使用的配置（可用的过滤器，激光线等）。荧光标记的抗体供应商将提供有关其产品的最佳组合（ 如 21）的建议。我们发现488 NM-和594 nm的激发荧光是最好的一对双标签和colocalizational分析。
次级抗体通常物种反应性的。也就是说，它们将标签由目标物种产生的任何抗体。因此，双标ICC需要小心上当，以避免交叉反应选择一级和二级抗体的宿主物种。例如，如果初选养在兔和山羊，这将不适合使用山羊起绒二次。如果抗体可用性不允许这些物种分离，有实现标记与MULTIP可用的协议乐同主机的主要抗体（ 如 22），但实质上更多的优化和验证应在意料之中。
作为该方法中的显微照片量化共定位，这是从根本上必要的所有显微镜是一致的，高质量的，并准确代表成像的样品。这既包括所用的硬件（光学质量等）和所选择的特定的程序和参数。有适当的显微镜23,24可用于指导优秀的资源，包括显微镜专为colocalizational分析11,17,25。
虽然相当方法论优势视觉叠加的方法，共定位的定量措施并没有很好地借给自己的出版说明的数字产生。这样的说明的数字是读者往往乐于助人，他们的缺席可以通过reviewe批评RS。我们已经发现，包含的假色“热图”可视化共定位是在构建数字很有帮助。的ImageJ的插件“共定位色彩映射表”（购自https://sites.google.com/site/colocalizationcolormap/）是在产生这些图像是有用的。然而，必须指出的是，这些图像将是在此处描述的技术的上下文中严格说明性是重要的。
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Acknowledgments
这项工作是由CIHR（MOP394808）和加拿大研究主席CMCEWO资助项目是由NSERC的研究生奖学金的获得者。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 circle Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehyde | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Rabbit anti-DOR antibody | MyBioSource | MBS316175 | Used at 1:1,500 |
| Mouse anti-Rab5 antibody | Sigma Aldrich | R7904 | Used at 1:750 |
| Mouse anti-Rab11 antibody | Millipore | 05-853 | Used at 1:500 |
| Goat anti-LAMP1 antibody | Santa Cruz | SC8098 | Used at 1:750 |
| Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody | Life Technologies | A-21206 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
| Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11005 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
| Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11058 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
References
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