Summary
수용체는 리간드 매매 시그널링 및 세포 반응성을 조절하고, 그 자체의 리간드 - 유도 된 세포 신호 전달을 포함한 조건에 응답한다. 여기, 우리는 양적 immunolabeling 및 colocalizational 분석을 사용하여 약물 유발 수용체 인신 매매를 평가하기위한 강력하고 유연한 기술을 설명합니다.
Introduction
수용체 특히, G 단백질 결합 수용체 (GPCR에)는, 정기적으로 및 세포 표면 (1)로부터, 세포 내에서 팔려. 이 복잡하게 조율하고 엄격하게 제어 과정은 세포의 가능한 수용체 보완을 지시하고 수용체 시간 활동, 탈감작 및 resensitization 2 조절 - 4. 중요한 것은, 이들 방법은 약물 유발 수용체 활성 또는 비활성을 포함한 셀룰러 환경에 응답한다. 즉, 수용체에 리간드의 행동함으로써 세포 응답을 변경, 그 수용체의 세포 내 인신 매매를 변경할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 외부 리간드에도 고전 메신저 투 이펙터 캐스케이드 5,6- 넘어 더 효과 세포 기능에 아직 발휘.
유도 수용체 인신 매매에 이러한 변화를 검토하는 것은 어렵다. 사용 가능한 모든 기술은 한계를 포함한다. 비오틴 보호 분석법 모니하는데 사용되어왔다토르 표면 수용체 집단. 이들 수용체는 바이오틴 화되어 면역 침전의 timecourse은 시간이 지남에 따라 바이오틴 수용체의 감소를 정량화하기 위해 수행된다. 이러한 기술은 본질적으로 수용체 (7)의 초기 레이블, 인구의 점진적인 열화를 모니터링하고,이 공정의 시간 코스를 구성하는데 매우 유용하다. 불행하게도,이 분석은 내재화, 재활용, 또는 새로운 수용체 등의 수용체, 원래 풀 저하 이외의 프로세스를 모니터링 할 수 없다. 또한, 50kDa 범위 수용체 150kDa 범위의 항체의 첨가는 수용체의 매매 8,9 변경할 수 있으며,이 기술은 낮은 발현 수준의 수용체로 사용하기 어려울 수있다.
다른 절차는 세포 내 인신 매매 구획 (예를 들면, 엔도 좀 등)을 확인하고 관심있는 수용체와 그들의 colocalization을 평가하기 위해 다양한 방법을 사용합니다. 이것은 우리를 포함표현 이종 시스템의 전자 수용체 및 구획 마커 (예를 들면, 랩 - 가족 GTP 아제)의 키메라 구조를 형광 단백질은 태그가. 이로 인해 고정 및 투과성으로 관련된 문제를 제거하는, 살아있는 세포 이미징의 사용을 가능하게한다. 더 생리 학적으로 대표 세포 유형과 행동과 호환성을 인신 매매에 태그와 발현 정도 효과 : 강력한 있지만, 이러한 전략은 이종 일반적으로 시스템의 동일한 제한을 앓고. 더 널리, 염료가 쉽게 세포 내 구획 레이블을하는 데 사용됩니다 (예를 들어, 리소좀, 표면 상) 10. 염료는, 그러나, 특이성 (리소좀에 대한 염료의 경우 모든 산성 세포 소기관을)이 부족하고 다른 구획을 통해 인신 매매를 평가하지 않습니다. 또, 이들 기술은 시스템 및 실험 조건 위에 상당한 제어를 허용 이하, 여기에 제시된 colocalization을 분석 방법 이점있다.
방법 승여기에 현재 전자는 colocalization을하여 수용체 인신 매매의 추적을 정제. 적당한 표식 라벨을 면역 세포 화학 (ICC)를 사용하면, 여러 별개의 세포 내 구획을 식별 할 수있다. 이는 또한 이종 시스템 대신에 생리 학적으로 관련 일차 세포 배양의 사용을 허용한다. 이러한 ICC 프로토콜 라벨 이전 관심 세포를 정착시키는 것을 포함한다; 이 약물 치료 (들) 다음과 같은 특정 평가시기에 표시를 허용합니다. 이것은 그 평가시기에 글로벌 수용체 구획 협회의 '스냅 샷'을 생산하고 있습니다. 여러 시점들로, 인신 매매 변경 timecourse도 구성 할 수있다.
간단히, 세포가 약물 처리, 수용체와 관심의 세포 내 구획 표지이며, 공 초점 이미징 및 현미경은 수학적 수용체와 실 (11)의 colocalization을 정량화 분석된다. 우리의 사용에서, 우리는 류마티스 관절염 수용체의 colocalization을을 조사B5, Rab11 및 막 단백질 1 (램프 1)를 리소좀은 관련. 이 마커는 각각 초기 엔도 좀, 재활용 엔도 좀과 리소좀을 식별합니다. 이 colocalization을 조치 국제화, 재활용, 분해 (12)의 무엇보다 중요한 프로세스에 대한 프록시 역할을합니다.
모든 기술에서와 같이, 몇 가지 제한을 고려해야한다. 인해 모든 개별 뉴런 분석 이미지 필요성이 기법 시점들과 관련된 조건의 수에 따라 상당히 노동 집약적이 될 수있다. 모든 immunolabeling는 고정과 투과성으로 (13)에 의해 발생하는 세포의 미세 구조, 단백질의 현지화 및 에피토프 접근성에 미치는 영향에 맞설해야합니다.
원래 기본 감각 뉴런의 차 문화와 함께 사용하기에 최적화 있지만,이 방법은 다른 단층 도금 문화 모델과 광범위하게 호환됩니다.
수학적 정량 지표 성과의 사용colocalization을의 전자는 특히, 훨씬 더 많은 방법 론적으로, 종종 시각적으로 검사 멀티 채널 오버레이 (14)와 같은 모호한, 주관적 조치에 의존 수용체 인신 매매의 변화를 평가하는 데 사용 이전 기술보다 엄격한입니다.
이 기술은 생체 개입 (이전에 차 문화 세대)과의 폭 넓은 호환성을 위해 특히 유용, 체외 개입 (문화 성장 중), 각종 라벨 (15)을 목표로하고있다. 이와 같이, 많은 다른 연구 질문하도록 구성 될 수있다.
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Protocol
참고 :이 프로토콜은 다양한 단층 도금 세포 / 조직 문화 모델, 약물 치료 요법, 및 라벨 대상으로 광범위하게 호환됩니다. 따라서 실제 사용에서, 많은 특정 매개 변수는 실험 설계에 따라 달라질 수 있습니다. 여기에, 이러한 사용자 정의 매개 변수에 대한 참조는 일반적인 있습니다. 대표적인 결과를 얻기 위해 사용되는 예 조건은, 이탤릭체에 포함되어 있습니다.
1. 솔루션
- 0.1 M 트리스 버퍼 고장 성 (300 mM)을 식염수와 0.05 % 폴리 솔 베이트 20을 혼합하여 세척 버퍼를 준비; 실온에서 pH가 7.4.
- 버퍼를 차단 준비합니다. 0.05 M 트리스 버퍼 고장 성까지 (300 mM)을 식염수는 0.05 % 폴리 소르 베이트 20, 3 % 소 혈청 알부민 (BSA) 0.1 % 차가운 물고기 피부 젤라틴을 추가하고 실온에서 7.4로 pH를 조정합니다.
- 0.05 M 트리스 - 완충 고장 성 (300 mM)을 식염수로 0.05 % 폴리 소르 베이트 20, 1 % BSA, 0.1 % 냉 물고기 껍질 젤라틴을 첨가하여 항체 희석액을 준비하고 4 O ℃에서 7.4로 pH를 조정
참고 : 트리스 버퍼의 pH는 온도에 따라 달라집니다. 즉, 온도 변화는 용액의 pH를 변경되고있다. 일관성을 위해,이 버퍼는 항상이 사용될 때의 온도에서, pH가 조정되어야한다.
2. 세포 배양
주 : 적절한 세포 배양 프로토콜이 사용될 세포 유형 (들)에 따라 달라질 것이다. 이러한 절차는 별도로 최적화되어야한다. 자세한 세포 배양 방법은 (16)을 포함하여, 쉽게 사용할 수 있습니다. 유사한 절차는 현저한 차이 대표적인 결과를 수득 하였다 :
- 성인 동물 문화 등의 루트 신경 뉴런은 12 설명 된대로. 문화에 세포를 성인 신경 세포 성장 매체를 사용합니다. 오히려 글루타민산보다, 예비 도금하여 아교 세포 밀도를 줄일 수 있습니다. 이 approximat에 성장 적어도 30 ~ 60 판마다 신경과 동반 아교 세포와 12 라운드 커버 글라스에 성장 혼합 신경 세포 아교 문화 결과엘리 40 % 포화 상태. 또한 신경교 과도 성장시키고있는 경우 일차 배양 신경 세포에서 복제되지 않으며, 신경교 공 배양하여 플레이트 밀려된다는 것을 주목해야한다. 신경에 영향을 미치는 것을 방지하기 위해, 신경교 번호 물리적 환원 화학 / 약학 적 방법에 바람직하다.
주 :이 프로토콜의 목적을 위해, 우리가 관심있는 세포가 성장하고있는 것으로 가정들이 실험적 원하는 상태 및 단층 도금. 우리는 24 웰 플레이트에서 12 라운드 커버 글라스에 도금하는 것이 가장 편리 할 것을 찾을 수 있습니다. 설명 모든 볼륨 및 절차는 24 웰 플레이트 잘 하나에 하나의 coverslip에 적합합니다.
배양 된 세포 3. 약물 치료
참고 : 여러 순차적 또는 중복은, 약물 치료가 가능하다. 특정 실험에 따라 달라집니다 사용하는 노출의 약물, 용량 / 농도 및 지속 시간.
- 원래의 성장 배지를 제거 16 참고 : 각각의 독립적 인 복제 (일반적으로 하나의 24 웰 플레이트 문화) 같은 공통 제어 조건을 포함하는 것이 중요합니다. 이 간 재판 변동을 보정 복제에서 데이터의 정상화를 허용합니다.
- 48 시간 16 원래의 성장 조건에서 세포를 품어.
- 이후 약물 치료의 경우, 반복 3.1 단계 및 Deltorphin 1 μm의 3.2, SNC80 1 ㎛, 또는 차량을 60 분 12 품어. 물에 deltorphin II를 용해하고 물에 1 mm로 희석하여 40 μm의 HCl 및 초음파 처리, 10mm의에서 SNC80를 용해.
주 :이 프로토콜들이 선택 성장 배지에서 원하는 농도 (들)에 용해 될 수 있다는 약물 (들)을 가용화 한 가정한다. 에 대한 적절한 절차이러한 가용화 문제의 약물에 따라 달라집니다 개별적으로 최적화해야합니다. - 세척 당 세척 버퍼의 1 ~ ㎖로, 부드럽게 세 번 세포를 씻으십시오. (세척 버퍼이 경우) 원하는대로 부드럽게, 신선한 용액을 잘 보충, 우물에서 액체를 흡입 한 후 신속하게, 부드럽게 각 세척을 수행합니다.
4. 고정 및 면역 세포 화학
참고 : 특정 표시 대상이 실험에 의해 달라질 수 있습니다. 논의 된 바와 같이 우리의 사용에서, 우리는, 델타 오피오이드 수용체 (DOR) 및 Rab5, 랩 (11), 및 램프 1 레이블. 특정 항체는 특정 실험에 따라 달라집니다 사용. 최적의 라벨 조건은 특정 항체를 사용 (들)에 따라 달라집니다. 이 주제의 많은 풀러 논의는 다음과 같습니다.
- 37 ºC에서 10 분 동안 ~ 0.1 M 인산염 완충 생리 식염수 300 μL 4 % 파라 포름 알데히드를 침지하여 세포를 고정합니다.
참고 :이 중요하다 4 % 파라포름 알데히드 갓 인해 이전에 냉동 파라 포름 알데히드를 사용함으로써 발생되는 형광도에 제조 될 수있다. - 3.3에 기술 된 바와 같이, 세척 당 세척 완충액 중 ~ 1 ㎖로, 부드럽게 3 번 세포를 씻어.
- 실온에서 2 시간 동안 버퍼를 차단 μL (300)에있는 세포를 품어.
- 4 ºC에서 48 시간 동안 항체 희석액 300 μL에서 일차 항체와 세포를 품어. 우리의 사용에서, 차 DOR에 대한 항체 (토끼 반 DOR)과 중 하나 Rab5 (마우스 항 - Rab5), 랩 11 (마우스 항 - Rab11), 및 램프 1 (염소 항 - 램프 1).
- 3.3에 기술 된 바와 같이, 세척 당 세척 완충액 중 ~ 1 ㎖로, 가볍게 세 번 세포를 씻어.
- 상이한 형광 물질에 접합 된 이차 항체와 세포를 부화 RT에서 1 시간 동안 항체 희석액 300 μL의 (아래 설명 참조). 이, 이후의 모든 단계에서 빛으로부터 세포를 보호합니다. 대표적인 결과를 얻으려면, 녹색 발광 형광 접합 된 항 - 토끼와 eith을 사용어 적색 발광 형광 접합 된 항 - 마우스 또는 적색 발광 형광 접합 된 항 염소.
- 3.3에 기술 된 바와 같이, 세척 당 세척 완충액 중 ~ 1 ㎖로, 부드럽게 3 번 세포를 씻어.
- ~에 접시를 들고, 잘 각각 45 °를 세척 버퍼 ~ 1ml를 떠나 24 웰 플레이트에서 12 라운드 된 커버를 제거하고 미세 집게를 사용 고타 떨어져 커버 슬립을 올립니다. 커버 슬립은 용이하게 집게를 사용하여 제거 할 수있는 곳에서, 웰 벽에 닿 올 것이다.
- 현미경, 커버 슬립, 세포 측 다운 마운트 장착 매체를 방지 페이딩 슬라이드.
5. 현미경 설정
- 고배율 대물 렌즈 (100X)를 사용하여, 표면 형광 제를 사용하여 묘화 될 수있는 대표적인 셀을 찾은.
- 예를 들어, 사용되는 각 형광 물질의 검출, 488 nm 내지 59 (각 분류 채널의 8 비트 압축 TIFF 화상을 기록하는 촬상 설정 구성4 ㎚), (중 라인 또는 프레임에 의해), 최종 이미지에 대한 평균 4 ~ 6 스캔 이미지에 각 채널을 순차적으로. 최적의 이미지 해상도는 현미경 별 수 있지만 X 1024 (1024)는 일반적으로 좋은 결과를 얻을 수 있습니다.
- 공 초점 이미징 경로로 전환 세포의 중심을 Z-면에 초점을 맞 춥니 다.
- 핀홀 (전형적 에어리 1 부), 레이저 전력, 광전자 증 배관 전압 (게인)를 최적화하고, 각 채널에 대한 오프셋. 이러한 설정을 기록 / 저장합니다. 같은 복제에 특정 대상 쌍에 대해 표시된 모든 세포 이미징에 대해 같은 현미경 설정을 사용합니다.
참고 :이 프로세스는 일반적으로이 세포 분석을 위해 몇 군데되지 않도록 충분한 광표백 발생합니다.
6. 이미징
- 고배율 대물 렌즈 (예를 들어, 100X)를 사용하여, 표면 형광 제를 사용하여 묘화 될 수있는 세포를 찾아.
- 공 초점 이미징 경로로 전환 세포의 중심을 Z-면에 초점을 맞 춥니 다. 나는F 가능한 소프트웨어를 사용 크게 / 작물의 관심 셀로의 스캔 영역을 제한한다.
- 설정을 사용하여 레이블이있는 각 채널에 대한 이미지를 캡처 이전에 설립했다. 반복 충분한 샘플을 보장하기 위해 이미지에 복제 당 조건 당 15 이상의 셀을 6.3에 6.1 단계를 반복합니다.
7. colocalization을 분석
- 이미지의 쌍을 엽니 다 (예를 들어, '녹색'과 '빨간색') ImageJ에있는 셀의. > 컬러> RGB 이미지를 생성하는 명령 ... 채널 병합 이미지를 사용합니다.
- 관심의 세포 주위에 선택을 그립니다. 선택한 셀에 대상의 colocalization을 정량화 (https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/에서 사용할 수 11) "PSC colocalization을을"플러그인 ImageJ에 사용합니다.
- 원하는 colocalization을 측정 (일반적으로 피어슨의 R 17)를 기록한다. 반복 각 군데 셀에 대한 7.1-7.3 단계를 반복합니다. 8. 데이터 정규화
- 각각의 공통 제어 조건의 기록 colocalization을 값들의 평균을 계산한다 각 표시 상태의 복제.
참고 : 예를 들어, 뉴런의 colocalization을 값의 평균 "48 시간 차량 60 분 차량"3 라벨 조건 (수용체와 3 구획의 각) 각 3 독립적 인 복제 각각의 약물 상태. - (-1) 각 각 라벨 상태에서 복제에 대 한 오프셋 산출하는 기준 수단을 곱하십시오. 각각 그 복제의 각 colocalization을 값으로 각각의 라벨 상태에서 복제에 대 한 오프셋 (offset) 추가.
주의 : 이것은 공통 제어 조건에 대한 평균 측정 colocalization을 각 표시 상태의 각 복제에 0이되도록 데이터를 정규화한다. - 각 표시 상태의 모든 복제에서 데이터를 풀.
참고 : colocalization을의 변화는 지금 복제를 통해 분석 할 수 있습니다. 통계 항문이 Analysis 실험 설계에 따라 달라집니다하지만 일반적으로 분석 수준의 분산을 포함 할 것이다 (ANOVA)은 (예를 들어, Tukey에) 적절한 사후 테스트 하였다. 통계 자료를 들어, 18, 예를 참조하십시오.
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Representative Results
이 기술을 사용하면, 장기간 / 만성 및 급성 약물 치료 모두 다음 수용체 내재화 후 거래의 변화를 정량화하는 것이 가능하다. 약물 치료, 정착, 및 표지 한 후, 고해상도 2 채널 현미경은 관심의 각 셀의 포획된다. 대표적인 이미지는 예시적인 도면 (도 1)를 생성하기 위해 거짓 색 colocalization을 함께 결합 될 수있다. 후속 colocalizational 분석 한 바와 같이, 목표 대상 colocalization을 (예를 들어, 수용체 - 구획 마커)의 정량적 점수를 얻었다. 이 데이터는 그 다음,이 경우, 변화에 비교하기 위해 사용될 수있다, 약물 치료 (S) (도 2)에 의해 유도 된 수용체 매매.
FAL와 수용체 및 구획 마커 라벨의 그림 1. 대표 현미경 사진SE-컬러 colocalization을지도. 후근 신경절 감각 뉴런의 차 문화는 장시간 (48 시간) 급성 (1 시간) 약물 치료 (왼쪽 축 레이블)에 노출되었다. 하나의 연장 조건은 대표적인 결과로 표시됩니다. 세포를 델타 오피오이드 수용체 (DOR)과 (결합 형광) 별개의 차 - 차와 재활용 엔도 좀의 마커 (랩 11) 항체 쌍 (위 축 레이블)에 대한 immunolabeled했다. 세포는 2 채널 순차 공 초점 현미경 (좌측 열, 가운데 열)에 의해 촬영 하였다. 대표 이미지는 두 개의 신경 세포에 두 개의 레이블이 대상을 보여줍니다. 하나의 뉴런 급성 차량 (위) 뒤에 연장 모르핀으로 처리 하였다. 다른 신경 세포는 급성 deltorphin II (; 바닥 DELT, DOR 작용제) 다음 연장 모르핀로 처리 하였다. 후속 colocalizational 정량 분석 이외에, 이들 대표 화상이 거짓 색 colocalization을 맵 (우측 열)을 생성하기 위해 처리 하였다. 스케일 바 소10 μm의 승. 3.0 NC에 의하여 공통 평가 기준의 규정에 따라 12에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 양적 colocalization을 점수는. 수용체 후 국제화 인신 매매의 변화를 비교하는 데 사용할 수있는 등의 루트 신경 감각 뉴런의 차 문화는 장시간 (48 시간) 급성 (1 시간) 약물 치료 (x 축 라벨)에 노출되었다. 하나의 연장 조건은 대표적인 결과로 표시됩니다. 세포를 DOR 초기 엔도 좀, 재활용 엔도 좀과 리소좀의 마커 immunolabelled했다. 4 독립적 인 복제 - 이미징, colocalization을 점수가 결정되었다 후, 정규화는, 3을 통해 풀링. 데이터는 분산의 양방향 분석 (분석 하였다Tukey에의 HSD의 사후와 ANOVA). 데이터는 평균 + 95 % 신뢰 구간으로 표시하고 있습니다. * P <0.05를 의미한다. 명백한 바와 같이,이 기술은 deltorphin II 급성 치료에 의해 유도 된 후 내재화 DOR 거래 변화의 식별을 허용하지만 SNC80 (두 가지 DOR 작용제). 3.0 NC에 의하여 공통 평가 기준의 규정에 따라 12에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 성인 후근 신경절 신경 세포 (차 감각 뉴런)의 차 문화의 분석을 위해이 프로토콜을 최적화했다. 또한 광범위 단층 도금 배양 된 세포에 대해 거의 또는 수정없이 사용할 수있다. colocalizational 분석 그러나 약물 치료 및 조직 고정 / 혼합물의 구성 요소가 적절하지 않을 것입니다, 또한 조직의 조각 및 기타 준비 (11)에서 가능하다.
흥미로운 것은, 여기에 제시된 ICC 방법은 또한, 조직 슬라이스의 이중 면역 표지를 수행 할 적절한 정착 및 티슈 제조에 사용될 수에 관계없이 후속 분석 (예를 들어, 19).
이 프로토콜은 서로 다른 라벨 대상으로 광범위하게 호환됩니다. 도금 세포의 각 coverslip에 두 번 표시됩니다. 전형적으로, 이것은 관심 수용체 관심 구획 중 하나의 마커에 대한 것이다. 그곳에일반적으로 다수의 다른 구획 수용체 colocalization을 조사하기 위해 여러 조건을 표시 할 것이다.
항체는 본질적으로 다양하다. 적절한 라벨 프로토콜은 서로 다른 항체에 따라 다를 것입니다. 이것은 적절한 항체 농도, 버퍼 조리법 및 시점들이 포함되어 있습니다. 또한 동일한 항체의 다른 많은 다른 항체가 가장 잘된다는 점을 유의해야한다. 이와 같이, 표시 방법 및 항체 특이성을 확인해야하고, 필요한 경우 항체 및 표적 조직의 각 조합에 대해, 최적화. 여기에 사용 된 방법은 유용한 출발점이다. 이 이차 항체 (자가 형광에 대해 제어하기 위해) 첨가없이 일차 항체 (비 - 특이 이차 라벨링 제어하는)없이 처리 된 샘플을 포함한다 : 라벨의 유효성을 검사 할 때, 그것은 적절한 제어를 수행하는 것이 중요하다.
에 영향을 미치는 많은 요인이있다표시 방법의 디자인. 여기에 제시된 방법에 영향을 미치는 노트의 일부 고려 트리스 버퍼, 고장 성 식염수, 폴리 소르 베이트, BSA, 차가운 물고기 피부 젤라틴의 사용을 포함한다. 인산염 버퍼는 높은 비 특정 라벨을 일으킬 수 있으며, 사용 빈도가 낮은 일부 항체 접합체와 상호 작용할 수있다. 그러나, 트리스 버퍼는, 언급 한 바와 같이, 온도 감응. 고장 성 소금 농도는 이온의 상호 작용을 방해하여 비특이적 라벨을 줄일 수 있습니다. 더 나아가, 원하는 경우,이 프로토콜에 지정된 것 이상으로 염 농도를 증가시킬 수있다. 폴리 소르 베이트 20은 상대적으로 부드러운 계면 활성제 / 세제로 사용됩니다. 이 트리톤 X-100, 크게함으로써, 세포막은 세포 내 구조를 왜곡, 방해, 또는 용해하는 것으로보고 된 이상이 바람직하다. 이 세척의 완전성을 향상 모든 버퍼에 저농도의 함유 폴리 소르 베이트 20, 비특이적 라벨링을 감소 시키는데 유용하다. BSA는 일반적으로 사용되는 블로킹 제는 의도표적 조직에서의 비특이적 단백질 결합 부위를 점유한다. 일부는 BSA가 집계 및 비 특정 반점 라벨로 이어질 수 있다고보고있다. 이 문제가 발생하는 경우, 무 지방 건조 우유 또는 추가적인 냉간 물고기 껍질 젤라틴과 BSA를 대체 할 수있다. 차가운 열대어 피부 젤라틴은 또한 포유 동물 단백질에 대한 항체 (20)에 낮은 반응성을 제시하면서 비 - 특이 단백질 결합 부위를 차지하기위한 비 - 포유 동물 단백질 공급원이다.
이 프로토콜에서 규정하지 않지만, 그것은 차 항체가 발생시킨 종 블로킹 버퍼 정상 혈청에 추가 전형적인. 3 % - 전형적인 농도는 1이다. 후술하는 바와 같이, 종 선택에주의가 교차 반응성을 방지하기 위해 행사해야합니다.
둘 이상의 형광 표지 된 표적을 검출 할 때, 적절한 형광 물질의 조합의 선택이 특히 중요하다. 이는 좋은 스펙트럼 SEPA이 필수적이다누화를 피하기 위해 배급. 또한, 형광 물질의 선택은 사용되는 현미경의 구성 (가능한 필터, 레이저 선, 등)에 의존 할 것이다. 형광 - 복합 항체 공급 업체는 자사 제품의 최적의 조합 (예를 들어, 21)에 대한 조언을 제공 할 것입니다. 우리는 이중 라벨 및 colocalizational 분석을위한 최적의 쌍으로 488 nm- 및 594 nm의 여기 된 형광을 찾을 수 있습니다.
이차 항체는 일반적으로 종 반응이다. 즉, 그들은 타겟 종에 의해 생성 된 임의의 항체를 레이블링한다. 이중 라벨링 ICC 따라서 치료는 교차 반응을 방지하기 위해 일차 및 이차 항체의 호스트 종을 선택하는데주의해야. 예비 선거는 토끼와 염소에서 제기하는 경우 예를 들어, 그것은 사용하기 적절하지 않을 것이다 염소 제기 차. 항체는 가용성 종의 분리를 허용하지 않는 경우, multip로 라벨링을 달성하기위한 프로토콜을 사용할 수있다르 같은 호스트 차 항체 (예를 들어, 22), 실질적으로 더 많은 최적화 및 유효성을 기대할 수 있지만한다.
이 방법은, 현미경의 colocalization을 정량화 된 바와 같이, 모든 현미경 높은 품질의 일관성 및 묘화 샘플을 정확하게 대표하는 것이 근본적으로 필요하다. 이것은 사용 된 하드웨어 (광학 품질 등)을 선택하고 특정 절차 및 매개 변수를 모두 포함한다. colocalizational 분석 11,17,25 위해 특별히 현미경을 포함한 적절한 현미경 (23, 24)에 대한 지침에 사용할 우수한 자원이있다.
시각적 오버레이 방법에 상당한 방법 론적 우월성 있지만, colocalization을 정량적 측정은 잘 게시 예시 그림의 생성에 자신을 빌려하지 않습니다. 이러한 예시 그림은 독자들에게 종종 도움과 자신의 부재는 reviewe 비판 할 수있다RS. 우리는 거짓 컬러 '히트 맵'시각화, colocalization을의 포함이 수치를 구축에 도움이 될 것으로 나타났습니다. ImageJ에 플러그인 (https://sites.google.com/site/colocalizationcolormap/에서 구입 가능) "colocalization을 컬러 맵은"이러한 이미지를 생성하는 데 유용합니다. 이들 이미지는 여기 기재된 기술의 맥락에서 예시 될 것이다 엄격 점에 유의하는 것이 중요하다.
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Acknowledgments
이 작품은 CIHR (MOP394808)과 CMCEWO에 캐나다 연구 의자에서 보조금에 의해 지원되었다 NSERC에서 대학원 장학금받는 사람이었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 circle Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehyde | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Rabbit anti-DOR antibody | MyBioSource | MBS316175 | Used at 1:1,500 |
| Mouse anti-Rab5 antibody | Sigma Aldrich | R7904 | Used at 1:750 |
| Mouse anti-Rab11 antibody | Millipore | 05-853 | Used at 1:500 |
| Goat anti-LAMP1 antibody | Santa Cruz | SC8098 | Used at 1:750 |
| Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody | Life Technologies | A-21206 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
| Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11005 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
| Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11058 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
References
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