Summary
Rezeptor-moduliert Signalisierung und Zellen gegenüber Liganden und ist selbst in Reaktion auf Zellbedingungen, einschließlich Liganden-induzierte Signalisierung. Hier beschreiben wir eine leistungsfähige und flexible Methode zur quantitativen Beurteilung der Arzneimittel-induzierte Rezeptor-Verwendung von Immunmarkierung und colocalizational Analyse.
Introduction
Rezeptoren, insbesondere G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), werden routine intrazellulär gehandelt, zu und von der Zelloberfläche 1. Diese aufwändig orchestrierte und streng kontrollierte Prozesse diktieren verfügbar Rezeptor Ergänzungen Zellen und regulieren Rezeptor zeitliche Aktivität, Desensibilisierung und Resensibilisierung 2-4. Wichtig ist, dass diese Verfahren, die auf zelluläre Umgebungen, einschließlich Arzneimittel-induzierte Rezeptor-Aktivität oder Inaktivität. Das heißt, die Aktionen der Liganden an Rezeptoren intrazellulären Transport von diesen Rezeptoren verändern, wodurch Zellreaktionsfähigkeit zu verändern. Auf diese Weise üben externe Liganden noch weitere Auswirkungen auf die Zellfunktion, auch jenseits der klassischen Messenger-zu-Effektor-Kaskaden 5,6.
Prüfung solcher Änderungen induzierte Rezeptor-ist schwierig. Alle verfügbaren Techniken beinhalten Einschränkungen. Biotin-Schutzassays wurden benutzt, um monitor Oberflächenrezeptoren Populationen. Diese Rezeptoren werden biotinyliert und einen Zeitverlauf von Immunpräzipitationen durchgeführt, um die Verringerung der biotinylierte Rezeptoren über die Zeit quantifiziert. Diese Technik überwacht im Wesentlichen den allmählichen Abbau von einer anfänglichen, beschriftet, Bevölkerung von Rezeptoren 7 und ist sehr nützlich bei der Konstruktion von Zeitkurse dieses Prozesses. Leider ist dieser Test nicht imstande, jede andere als Verschlechterung des ursprünglichen Pool von Rezeptoren, wie die Internalisierung, Recycling oder neue Rezeptoren zu überwachen. Auch kann die Zugabe eines Antikörpers in dem 150kDa Bereich auf einen Rezeptor in der 50kDa Bereich des Rezeptors Handel 8,9 verändern, und diese Technik kann nur schwer mit niedrigen Expressionsebene Rezeptoren verwenden.
Andere Verfahren verwenden verschiedene Methoden, um intrazellulären Transport Fächer (zB Endosomen, etc.) identifizieren und bewerten ihre Kolokalisation mit den Rezeptoren von Interesse. Dies beinhaltet die unse von heterologen Systemen zum Ausdruck Fluoreszenzprotein-markierten chimären Konstrukten der Rezeptoren und Fach-Marker (zB Rab-GTPasen). Dies ermöglicht potentiell die Verwendung von Live-Cell-Imaging, das Entfernen Fragen Fixierung und Permeabilisierung zusammen. Während mächtig, leidet eine solche Strategie aus den gleichen Einschränkungen der heterologen Systemen im Allgemeinen: tag und Expressionsniveau Auswirkungen auf den Menschenhandel Verhalten und Unvereinbarkeit mit mehreren physiologisch repräsentativen Zelltypen. Besser bekannt werden Farbstoffe verwendet werden, um leicht zu beschriften intrazellulären Kompartimenten (zB Lysosomen, angeblich) 10. Farbstoffe, können jedoch die Spezifität (alle sauren Organellen im Falle von Farbstoffen für die Lysosomen) fehlt und nicht Handels durch andere Kompartimente beurteilen. Dennoch, diese Techniken ermöglichen erhebliche Kontrolle über das System und die experimentellen Bedingungen und können von den Kolokalisationsanalyse hier vorgestellten Methoden, unten zu profitieren.
Das Verfahren whier anwesend e verfeinert die Verfolgung von Rezeptor-durch Kolokalisation. Verwendung Immuncytochemie (ICC) auf geeignete Marker kennzeichnen, ist es möglich, mehrere unterschiedliche intrazelluläre Kompartimente zu identifizieren. Dies ermöglicht auch die Verwendung von physiologisch relevanten primären Zellkulturen anstelle von heterologen Systemen. Das ICC-Protokoll beinhaltet die Festsetzung der Zellen von Interesse vor der Markierung; dies ermöglicht die Kennzeichnung bei einem bestimmten Zeitpunkt nach der Arzneimittelbehandlung (en). Dies erzeugt eine "Momentaufnahme" der globalen Rezeptor-Kammer-Verbände zu diesem Zeitpunkt. Mit mehreren Zeitpunkten kann ein Zeitverlauf des Menschenhandels Änderungen auch gebaut werden.
Kurz gesagt, Zellen werden mit Arzneimittel behandelten, für den Rezeptor und intrazellulären Kompartiment von Interesse markiert konfokal abgebildet wird und die Mikrophotographien, werden analysiert, um mathematisch quantifizieren Kolokalisation des Rezeptors und das Fach 11. In unserer Anwendung, die Co-Lokalisierung eines Rezeptors mit Ra untersuchten wirb5, Rab11 und Lysosomale-associated membrane protein 1 (LAMP1). Diese Marker identifizieren frühe Endosomen, Recycling Endosomen und Lysosomen sind. Diese Kolokalisation Maßnahmen wirken als Proxies für die übergreifenden Prozesse der Verinnerlichung, Recycling und Abbau 12.
Wie bei allen Techniken sollen einige Einschränkungen berücksichtigt werden. Aufgrund der Notwendigkeit, jede einzelne Bild Neuron analysiert, kann dieses Verfahren ziemlich arbeitsintensiv werden abhängig von der Anzahl von Bedingungen und Zeitpunkte einbezogen. Alle Immunomarkierung muss auch mit den Auswirkungen auf die zelluläre Ultrastruktur, Protein-Lokalisierung und Epitop Erreichbarkeit mit Fixierung und Permeabilisierung 13 verursacht kämpfen.
Obwohl ursprünglich für die Verwendung mit primären Kulturen von primären sensorischen Neuronen optimiert ist dieses Verfahren weitgehend mit anderen Monoschicht überzogenen Kulturmodellen.
Die Verwendung eines mathematisch quantifiziert measure der Kolokalisation ist, vor allem, viel mehr methodisch rigorosen als bisherige Techniken verwendet werden, um Rezeptor-Änderungen, die oft auf vage, subjektive Maßnahmen wie visuell inspiziert Multi-Channel-Überlagerungen 14 verlassen haben, zu beurteilen.
Diese Technik ist besonders nützlich für ihre gute Verträglichkeit mit den in-vivo-Interventionen (vor der Primärkultur Generation), In-vitro-Interventionen (während der Kulturwachstum) und verschiedene Kennzeichnungs zielt 15. Als solches kann es viele verschiedene Forschungsfragen angepasst werden.
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Protocol
Hinweis: Dieses Protokoll ist weitgehend mit verschiedenen Monoschicht überzogenen Zelle / Zellkulturmodelle, Drogenbehandlungsschemata, und Kennzeichnungs Ziele. Somit im tatsächlichen Gebrauch werden viele spezifische Parameter auf experimentelle Design variieren. Hier sind Verweise auf diese benutzerdefinierten Parametern Generika. Beispiel Bedingungen, wie verwendet, um die repräsentative Ergebnisse zu erhalten, werden in Kursivschrift enthalten.
1. Lösungen
- Vorbereitung Waschpuffer durch Mischen 0,1 M Tris-gepufferter Hypertone (300 mM) Kochsalzlösung und 0,05% Polysorbat 20; pH 7,4 bei RT.
- Bereiten Blockierungspuffer. Auf 0,05 M Tris-gepufferter Hypertone (300 mM) Saline hinzuzufügen 0,05% Polysorbat 20, 3% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% Kaltfischhautgelatine und den pH auf 7,4 bei RT.
- Vorbereitung Antikörperverdünnung durch Zugabe von 0,05% Polysorbat 20, 1% BSA, 0,1% kaltFischHautGelatine und 0,05 M Tris-gepufferter Hypertone (300 mM) Saline und den pH auf 7,4 einzustellen bei 4ºC
Anmerkung: Der pH-Wert der Puffer Tris ist temperaturabhängig. Das heißt, eine Änderung in der Temperatur den pH-Wert der Lösung zu ändern. Aus Gründen der Einheitlichkeit sollte diese Puffer immer an der Temperatur, bei der sie verwendet werden pH-eingestellt.
2. Zellkultur
Hinweis: Geeignete Zellkulturprotokolle werden auf Basis von Zelltyp (en) variieren. Diese Verfahren müssen separat optimiert werden. Detaillierte Zellkulturmethoden sind leicht verfügbar, einschließlich 16. Ein ähnliches Verfahren wurde verwendet, um die repräsentative Ergebnisse, mit den bemerkenswerten Unterschiede zu erhalten:
- Kultur Dorsalwurzelganglien Neuronen von erwachsenen Tieren wie beschrieben 12. Verwenden Erwachsenen-Neuron-Wachstumsmedium zur Kultur der Zellen. Reduzieren Sie die Glia-Zelldichte von Vorplattieren statt Glutamat. Dies resultiert in einer gemischten Neuronen Gliazellen Kultur auf 12-Runden-Deckgläser mit mindestens 30-60 Neuronen pro Platte und die begleitenden Gliazellen gewachsen approximat gezüchtetely 40% Konfluenz. Es sei darauf hingewiesen, daß Neuronen in einer Primärkultur wird nicht replizieren und wird von der Platte durch cokultiviert Glia geschoben werden, wenn der Glia dürfen übermßig wachsen werden. Um zu vermeiden, die die Nervenzellen, ist die physische Reduktion von Gliazellen Zahlen vorzuziehen, chemische / pharmakologischen Methoden.
Hinweis: Für die Zwecke dieses Protokolls wird angenommen, dass die Zellen von Interesse sind gewachsen ihre experimentell gewünschten Zustand und Monolayer-plattiert. Wir finden, dass Plattierung auf 12-Runden-Deckgläschen in 24-Well-Platten werden am bequemsten. Alle beschriebenen Mengen und Verfahren sind für eine Deck in eine Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen geeignet.
3. Medikamentöse Behandlung von kultivierten Zellen
Hinweis: Mehrere aufeinanderfolgende oder sich überlappenden, sind medikamentöse Behandlungen möglich. Die Medikamente, Dosen / Konzentrationen und die Dauer der Belichtung verwendet werden von der besonderen Experiment ab.
- Entfernen Sie den ursprünglichen Wachstumsmedium 16 Hinweis: Es ist wichtig, dass jeder unabhängig replizieren (in der Regel eine einzige Platte mit 24 Vertiefungen Kultur) enthalten die gleichen gemeinsamen Kontrollbedingung. Dies erlaubt die Normalisierung der Daten über Replikate, die für inter-trial Variabilität korrigiert.
- Inkubieren Sie die Zellen in den ursprünglichen Wachstumsbedingungen 16 für 48 Stunden.
- Für die anschließende medikamentöse Behandlungen, wiederholen Sie die Schritte 3.1 und 3.2 mit Deltorphin 1 uM, 1 uM SNC80 oder Fahrzeug und Inkubation für 60 min 12. Solubilisieren Deltorphin II in Wasser und löslich SNC80 bei 10 mM in 40 & mgr; M HCl und beschallen, 1 mM in Wasser verdünnt.
Hinweis: Dieses Protokoll die Wirkstoff (e) wurden in Lösung, so dass sie in der gewünschten Konzentration (en) in der ausgewählten Wachstumsmedium gelöst sein. Geeignete Verfahren fürwie Solubilisierung wird in Abhängigkeit von der Droge in Frage variieren und müssen separat optimiert werden. - Waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal mit ~ 1 ml Waschpuffer pro Waschgang. Führen Sie jede Wasch durch leichtes Ansaugen der Flüssigkeit aus dem Brunnen, dann prompt, und sanft, Nachfüllen die gut mit frischer Lösung, je nach Wunsch (in diesem Fall mit Waschpuffer).
4. Fixierung und Immunocytochemistry
Hinweis: Die spezifische Markierung Ziele werden durch das Experiment variieren. In unserer Anwendung, die wir markierten delta-Opioidrezeptoren (DOR) und Rab5, Rab 11 und LAMP1, wie besprochen. Die spezifischen Antikörper verwendet, hängt von der speziellen Experiments abhängt. Optimale Markierungsbedingungen sind abhängig von den spezifischen Antikörper (n) verwendet. Eine wesentlich umfassendere Diskussion über dieses Thema ist unten.
- Fixieren der Zellen durch Immersion in ~ 300 & mgr; l 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphat gepufferter Salzlösung für 10 min bei 37 ºC.
Anmerkung: Es ist wichtig, daß die 4% paraFormaldehyd frisch durch die Autofluoreszenz durch die Verwendung von zuvor gefrorenen Para verursacht, hergestellt werden. - Waschen Sie die Zellen vorsichtig, 3 mal mit ca. 1 ml Waschpuffer pro Waschgang, wie in 3.3 beschrieben.
- Die Zellen in 300 ul Blockierungspuffer inkubieren für 2 h bei RT.
- Die Zellen mit primären Antikörpern in 300 ul Antikörperverdünnung 48 h Inkubation bei 4 ºC. In unserer Verwendung primärer Antikörper gegen DOR (Kaninchen anti-DOR) und eines der folgenden: Rab5 (Maus-anti-Rab5), Rab 11 (Maus-anti-Rab11) und LAMP1 (Ziege-anti-LAMP1).
- Waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal mit ca. 1 ml Waschpuffer pro Waschgang, wie in 3.3 beschrieben.
- Die Zellen mit Sekundärantikörper zu verschiedenen Fluorophoren konjugiert inkubieren (siehe Diskussion unten) in 300 & mgr; l Antikörperverdünnungslösung für 1 h bei RT. In diesem und allen nachfolgenden Schritten, schützen die Zellen vor Licht. Um repräsentative Ergebnisse zu erhalten, verwenden grün emittierende Fluorophor-konjugierten Anti-Kaninchen und either eine rot emittierende Fluorophor-konjugierten Anti-Maus oder rot emittierende Fluorophor-konjugierten Anti-Ziege.
- Waschen Sie die Zellen vorsichtig, 3 mal mit ca. 1 ml Waschpuffer pro Waschgang, wie in 3.3 beschrieben.
- Entfernen Sie die 12-Runden-Deckgläser von Platten mit 24 Vertiefungen, indem Sie ~ 1 ml Waschpuffer in jede Vertiefung, hält die Platte bei ~ 45 °, und hebeln Sie das Deckglas aus der gut Boden mit feinen Pinzette. Das Deckglas wird kommen, um gegen die Bohrlochwand ruhen, von wo aus sie leicht mit der Pinzette entfernt werden.
- Montieren Sie die Deckgläser, Zell-side-down, auf Objektträger mit Anti-Fading Eindeckmedium.
5. Mikroskop Einstellungen
- Unter Verwendung einer hohen Vergrößerung Ziel (100X), suchen Sie zuerst einen repräsentativen Zelle zur Verwendung Epifluoreszenz abgebildet werden.
- Konfigurieren Sie die Bildaufnahme-Einstellungen für die Aufnahme 8-bit unkomprimiertes TIFF-Bilder von jedem markierten Kanal (für den Nachweis von jedem Fluorophor verwendet, beispielsweise 488 nm und 594 nm), die dem Bild mit jeder Kanal sequentiell (entweder online oder Rahmen), und um durchschnittlich 4 bis 6 Scans für das endgültige Bild. Optimale Bildauflösung Mikroskop spezifisch sein, aber 1024 x 1024 ergibt sich in der Regel gute Ergebnisse.
- Schalter zur konfokalen Abbildung Pfad und zu konzentrieren, um eine z-Ebene durch die Mitte der Zelle.
- Optimierung Pinhole (typischerweise 1 Airy-Einheit), die Laserleistung und Photovervielfacherröhre Spannung (Verstärkung) und Offset für jeden Kanal. Speichern / aufzeichnen diese Einstellungen. Verwenden Sie dieselben Einstellungen Mikroskop zur Abbildung aller Zellen für eine bestimmte Zielpaar in der gleichen Wiederholungs markiert.
Hinweis: Dieses Verfahren wird in der Regel in einer ausreichenden Photobleichung, dass diese Zelle nicht für die Analyse abzubildenden führen.
6. Imaging
- Unter Verwendung einer hohen Vergrößerung Ziel (zB 100X), suchen Sie zuerst eine Zelle, um mit Epifluoreszenz abgebildet werden.
- Schalter zur konfokalen Abbildung Pfad und zu konzentrieren, um eine z-Ebene durch die Mitte der Zelle. ICHf vorhanden, benutzerfreundliche Software-Zoom / Ernte, um den Scanbereich auf die Zelle von Interesse zu beschränken.
- Machen Sie Bilder für jeden markierten Kanal mit den Einstellungen vorher festgelegten. Wiederholen Sie die Schritte 6.1 bis 6.3 für Bild in 15 oder mehr Zellen pro Zustand pro Wiederholung, um eine ausreichende Probe zu gewährleisten.
7. Kolokalisationsanalyse
- Öffnen Sie das Paar von Bildern (zB "grüne" und "rot") einer Zelle in ImageJ. Verwenden Sie die Bild> Farbe> Merge Channels ... Befehl aus, um ein RGB-Bild zu erzeugen.
- Zeichnen Sie eine Auswahl um die Zelle von Interesse. Verwenden Sie die ImageJ Plugin "PSC Kolokalisation" (11, erhältlich von https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/) an Kolokalisation der Ziele in der ausgewählten Zelle zu quantifizieren.
- Nehmen Sie das gewünschte Maß Kolokalisation (typischerweise Pearsons r 17). Wiederholen Sie die Schritte 7.1 bis 7.3 für jede Zelle abgebildet. 8. Datennormalisierung
- Berechnen Sie den Mittelwert der aufgezeichneten Werte Kolokalisation der gemeinsamen Kontrollbedingungen der einzelnen Wiederholung jeder Etikettierung Zustand.
Hinweis: Zum Beispiel, wird der Mittelwert der Kolokalisation Werte der Neuronen in der "48-Stunden-Fahrzeug 60 min Fahrzeug" drug Zustand in jeder der 3 unabhängige Wiederholungen in jeder der 3 Markierungsbedingungen (Rezeptor und jeweils 3 Kompartimente). - Multiplizieren Sie die Mittel, mit (-1) zu ergeben den Offset für jede Wiederholung in jeder Etikettierung Zustand. Der Offset hinzufügen für jede Wiederholung in jeder Etikettierung Zustand zu jedem Kolokalisation Wert in dieser Replikation.
Hinweis: Dadurch werden die Daten zu normalisieren, so dass die Durchschnitts Kolokalisation Maß für die gemeinsame Steuerzustand 0 in jeder Wiederholung jeder Etikettierung Zustand. - Bündeln die Daten aus alle Wiederholungen jeder Etikettierung Zustand.
Hinweis: Änderungen in Kolokalisation kann nun über Replikate analysiert werden. Statistische anallyse wird nach Versuchsanordnung ab, sondern wird in der Regel umfasst die Analyse-of-Varianz (ANOVA) durch entsprechende Post-hoc-Tests (zB Tukey) gefolgt. Für statistische Ressourcen finden Sie beispielsweise 18.
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Representative Results
Mit dieser Technik ist es möglich, Änderungen in der Post-Rezeptor-Internalisierung Handel folgenden sowohl chronische / akute und längere medikamentöse Behandlungen zu quantifizieren. Nach medikamentöser Behandlung, Fixierung, und Kennzeichnung sind hochauflösenden Zwei-Kanal-Mikrofotografien von jeder Zelle von Interesse erfasst. Repräsentative Bilder können mit Falschfarben Kolokalisation kombiniert werden, um illustrative Zahlen (Abbildung 1) zu erzeugen. Anschließende colocalizational Analyse, wie beschrieben, Ausbeute quantitativ Stände zielZiel Kolokalisation (zB Rezeptor-Abteil Marker). Diese Daten können dann verwendet werden, um Änderungen im Vergleich, in diesem Fall durch die Rezeptor-Arzneimittelbehandlung (en) (2) induziert.
Abbildung 1. Repräsentative Mikrophotographien von Rezeptor und Fach-Markierung Markierung mit false-Farb Kolokalisation Karten. Primärkulturen Dorsalwurzelganglien sensorischen Neuronen wurden verlängert (48 hr) und akute (1 h), Medikamente (Achsenbeschriftungen links) ausgesetzt. Nur ein längerer Zustand wird als repräsentative Ergebnisse gezeigt. Die Zellen wurden dann für die Delta-Opioid-Rezeptoren (DOR) und ein Marker für das Recycling Endosomen (Rab 11) mit unterschiedlichen Primär-Sekundär (Fluorophor konjugiert) Antikörperpaare (oben Achsenbeschriftungen) immun. Die Zellen wurden durch zwei aufeinanderfolgende Kanal-Konfokalmikroskopie (linke Spalte, mittlere Spalte) abgebildet. Repräsentative Bilder zeigen die beiden markierten Ziele in zwei Neuronen. Ein Neuron mit längerer Morphin gefolgt von akuten Fahrzeug (oben) behandelt. Die anderen Neurons wurde mit längerer Morphin gefolgt von akuten Deltorphin II (; unten DELT, eine DOR-Agonist) behandelt. Neben den nachfolgenden quantitativen colocalizational Analyse wurden diese repräsentative Bilder verarbeitet werden, um Falschfarben Kolokalisation Karten (rechte Spalte) zu erzeugen. Maßstabsbalken show 10 um. 12 gemäß den Bestimmungen der CC BY-NC 3.0 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Quantitative Kolokalisation Noten verwendet werden, um Veränderungen in der Rezeptor-post-Internalisierung Handel zu vergleichen. Primärkulturen Dorsalwurzelganglien sensorischen Neuronen wurden verlängert (48 hr) und akute (1 h), Medikamente (X-Achsenbeschriftungen) ausgesetzt. Nur ein längerer Zustand wird als repräsentative Ergebnisse gezeigt. Die Zellen wurden dann für DOR und Marker der frühen Endosomen, Recycling Endosomen und Lysosomen immun. 4 unabhängige Wiederholungen - nach der Bebilderung Kolokalisation Scores ermittelt, normiert und über 3 gebündelt. Die Daten wurden dann durch Zwei-Wege-Varianzanalyse (analysiertANOVA) mit Tukey-HSD post-hoc. Daten werden als Mittelwert +/- 95% Konfidenzintervall dargestellt. * Zeigt p <0,05. Wie ersichtlich, erlaubt diese Technik die Identifizierung von Veränderungen in DOR post-Internalisierung Handels durch akute Behandlung mit Deltorphin II induzierte, jedoch nicht SNC80 (zwei verschiedene DOR Agonisten). 12 gemäß den Bestimmungen der CC BY-NC 3.0 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Wir haben dieses Protokoll für die Analyse der Primärkulturen adulter Dorsalwurzelganglionneuronen (primäre sensorische Neuronen) optimiert. Es kann auch verwendet werden, mit geringer oder keiner Modifikation, zum Monobeschichtete kultivierten Zellen breit. Die colocalizational Analyse ist auch möglich, in Gewebeschnitten und anderen solchen Zubereitungen 11, aber die Drogentherapie und Gewebefixierung / der Zubereitung Komponenten nicht angemessen wäre.
Von Interesse ist, kann die ICC hier vorgestellten Verfahren auch verwendet werden, mit geeigneten Fixierung und Gewebepräparationen zu doppelt markierten Immunhistochemie in Gewebeschnitten durchgeführt, und zwar unabhängig von nachfolgenden Analyse (beispielsweise 19).
Dieses Protokoll ist weitgehend mit unterschiedlichen Kennzeichnungs Ziele. Jede Deckglas von plattierten Zellen doppelt markierten sein. Typischerweise wird dies für den Rezeptor von Interesse und ein Marker für eine der Kammern von Interesse sein. Dortwird in der Regel mehrere Markierungsbedingungen sein, um Rezeptor-Co-Lokalisierung mit mehreren verschiedenen Fächern zu prüfen.
Antikörper sind von Natur aus variabel. Entsprechende Kennzeichnung Protokolle zwischen verschiedenen Antikörpern variieren. Dies schließt entsprechende Antikörperkonzentrationen, Puffer Rezepte und Zeitpunkten. Es sollte auch beachtet werden, dass verschiedene Chargen des gleichen Antikörper werden am besten als unterschiedliche Antikörper sein. Als solches sollte Markierungsverfahren und die Antikörperspezifität zu validieren und gegebenenfalls optimiert, für jede Kombination von Antikörper und Zielgewebe. Die hier verwendeten Methoden sind ein guter Ausgangspunkt. Beim Validieren Etikettierung ist es wichtig, geeignete Kontrollen durchzuführen: Diese umfasst verarbeiteten Proben ohne die Zugabe von sekundären Antikörpern (für Autofluoreszenz zu steuern) und ohne primären Antikörper (für unspezifische Sekundäre Markierung Kontrolle).
Es gibt viele Faktoren, die den EinflussGestaltung von Markierungsmethoden. Einige Überlegungen zur Kenntnis, die die hier vorgestellten Methoden umfassen die Verwendung von Tris-Puffer, hypertonischer Kochsalzlösung, Polysorbat, BSA, und kalte Fischhautgelatine. Phosphatpuffer kann eine höhere unspezifische Kennzeichnung führen und mit einigen weniger verbreiteten Antikörper-Konjugate zu interagieren. Jedoch sind Tris-Puffer, wie gesagt, temperaturempfindlich. Hypertone Salzkonzentrationen zu reduzieren unspezifische Kennzeichnung durch Unterbrechung ionischen Wechselwirkungen. Es ist möglich, die Salzkonzentration weiter zu erhöhen das hinaus, was in diesem Protokoll angegeben wird, falls gewünscht. Polysorbat 20 als relativ sanften Tensid / Detergens verwendet. Dies wird über Triton X-100, von dem berichtet wurde, um deutlich zu stören oder gar zu lösen, Membranen und dadurch verzerren subzellulären Struktur bevorzugt. Die Einbeziehung von niedriger Konzentration Polysorbate 20 in allen Puffern ist nützlich bei der Verringerung nicht-spezifische Markierung, wie es die Gründlichkeit Wäschen verbessert. BSA ist eine häufig verwendete Blockierungsmittel bestimmtum nicht-spezifische Proteinbindungsstellen in dem Zielgewebe zu besetzen. Einige haben berichtet, dass BSA kann zu aggregieren und zu unspezifischen punktförmige Markierung. Wenn dieses Problem auftritt, ist es möglich, BSA mit fettfreier Trockenmilch oder zusätzliche kalte Fischhautgelatine ersetzen. Kalte Fischhautgelatine ist eine Nicht-Säuger-Protein-Quelle soll auch nicht-spezifische Proteinbindungsstellen zu besetzen, während mit geringer Reaktivität auf Antikörper gegen Säugetier-Proteine 20 gerichtet.
Wenn auch nicht in diesem Protokoll angegeben wird, ist es typisch, zu addieren, die Blockierungspuffer, normales Serum aus Spezies, bei denen die sekundäre Antikörper gezüchtet wurde. Typische Konzentrationen sind 1-3%. Wie unten diskutiert wird, muss darauf in Artenwahl ausgeübt werden, um Kreuzreaktionen zu vermeiden.
Beim Erfassen von zwei oder mehr fluoreszierend markierten Targets wird die Wahl der geeigneten Fluorophor Kombinationen besonders wichtig. Es ist wichtig, eine gute spektrale SEPA habenRation um ein Übersprechen zu vermeiden. Weiterhin wird die Auswahl von Fluorophoren auf der Konfiguration des Mikroskops verwendet werden (erhältlich Filtern Laserlinien, etc.) abhängen. Fluorophor-konjugierten Antikörper Lieferanten bieten Beratung über die besten Kombinationen von ihren Produkten (zB 21). Wir finden 488 nm- und 594 nm angeregte Fluorophore auf beste Paar für doppel Kennzeichnung und colocalizational Analyse sein.
Sekundärantikörper sind typischerweise Spezies reaktiv ist. Das heißt, daß sie keine Antikörper, die durch die Zielspezies produziert etikettieren. Doppelmarkierungs ICC erfordert deshalb Sorgfalt bei der Auswahl der Wirtsspezies der Primär- und Sekundärantikörper, um Kreuzreaktivität zu vermeiden. Wenn beispielsweise die Vorwahlen in Kaninchen und Ziegen angehoben, wäre es nicht sinnvoll sein, verwenden eine Ziege-Sekundär angehoben. Wenn Antikörper Verfügbarkeit nicht für solche Arten Trennung zu ermöglichen, gibt es Protokolle zur Verfügung, um die Markierung mit multip erreichenle-host gleichen primären Antikörpern (zB 22), wenn auch wesentlich Optimierung und Validierung zu erwarten.
Da diese Methode quantifiziert Kolokalisation in Mikrophotographien ist es grundsätzlich erforderlich, daß alle Mikroskopie konsistente, hochqualitative, und genau repräsentativ für die Proben abgebildet werden. Dies umfasst sowohl die verwendete Hardware (Optik Qualität, etc.) und die besonderen Verfahren und Parameter ausgewählt. Es gibt ausgezeichnete Ressourcen auf angemessene Mikroskopie 23,24 zur Orientierung zur Verfügung, darunter speziell für die Mikroskopie colocalizational Analyse 11,17,25.
Obwohl erhebliche methodische Überlegenheit, um visuelle Überlagerung Methoden quantitative Maßnahmen der Kolokalisation nicht so schön sich dafür eignen, um die Erzeugung von veranschaulichenden Figuren für die Veröffentlichung. Solche illustrativen Figuren sind oft hilfreich für die Leser und ihre Abwesenheit kann durch reviewe kritisiert werdenrs. Wir haben gefunden, daß der Einschluß von Falschfarben 'Heat' Visualisierung Kolokalisation nützlich bei der Konstruktion von Zahlen sein. Die ImageJ Plugin "Kolokalisation Colormap" (erhältlich von https://sites.google.com/site/colocalizationcolormap/) ist nützlich bei der Erzeugung der Bilder. Es ist wichtig, zu beachten ist jedoch, dass diese Bilder würden im Zusammenhang mit der hier beschriebenen Technik ausschließlich der Veranschaulichung dienen.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von CIHR (MOP394808) und Canada Research Chair zu CMCEWO getragen war der Empfänger eines Post-Graduate Scholarship von NSERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 circle Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehyde | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Rabbit anti-DOR antibody | MyBioSource | MBS316175 | Used at 1:1,500 |
| Mouse anti-Rab5 antibody | Sigma Aldrich | R7904 | Used at 1:750 |
| Mouse anti-Rab11 antibody | Millipore | 05-853 | Used at 1:500 |
| Goat anti-LAMP1 antibody | Santa Cruz | SC8098 | Used at 1:750 |
| Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody | Life Technologies | A-21206 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
| Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11005 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
| Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11058 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
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