Summary
Reseptör ticareti ligandlarına sinyal ve hücre yanıt modüle ve kendisi ligand bağlı sinyal dahil olmak üzere hücre koşulları, yanıt verici olmaktadır. Burada, biz kantitatif immün ve colocalizational analizi kullanılarak ilaca bağlı reseptör ticaretini değerlendirmek için güçlü ve esnek bir teknik açıklar.
Introduction
Reseptörler, özellikle de G protein bağlı reseptörler (GPCR'ler), rutin ve hücre yüzeyi 1, hücre içi kaçırılan. Bunlar karmaşık bir orkestra ve sıkı kontrol süreçleri hücrelerin mevcut reseptör tamamlar dikte ve reseptör zamansal aktivite, duyarsızlaştırma ve resensitization 2 düzenleyen - 4. Önemli olarak, bu işlemler, ilaca bağlı reseptör aktivitesi veya işlem de dahil olmak üzere, hücresel ortama duyarlı. Diğer bir deyişle, reseptörlerindeki ligandlannın etkimeleri ve böylece hücre yanıt değiştirmeden, bu reseptörlerin hücre içi değiştirebilir. Bu şekilde, bu dış ligandlar da klasik haberciye-to-efektör kaskadları 5,6 ötesinde, daha fazla etkiler, hücre fonksiyonu üzerinde yapılmamış gösterirler.
Uyarılmış reseptör kaçakçılığı gibi değişiklikler incelenmesi zordur. Mevcut tüm teknikler sınırlamaları içerir. Biyotin koruma deneyleri moni için kullanılmıştırtor yüzeyi reseptörleri popülasyonları. Bu reseptörler, biyotinile edilmiş ve İmmüno bir timecourse zamanla biyotinile reseptörleri azalmayı ölçmek için gerçekleştirilir. Bu teknik, esas olarak reseptör 7 arasında bir başlangıç, etiketlenmiş, popülasyonda bozunmasını takip eder ve bu işlem zaman içerisinde inşa çok yararlıdır. Ne yazık ki, bu deney gibi içselleştirilmesi, geri dönüşüm, ya da yeni reseptörler olarak reseptörlerin, orijinal havuzun bozulması dışında herhangi bir işlem izlemek için değiştiremiyor. Ayrıca, 50kDa aralığında bir reseptöre 150kDa aralığında bir antikorunun ilavesi reseptörün kaçakçılığı 8,9 değiştirebilir ve bu teknik, düşük ekspresyon düzeyi reseptörleri ile kullanmak için zor olabilir.
Diğer işlemler hücre içi ticareti bölmeleri (örneğin, endozomlar, vs.) belirlemek ve ilgi reseptörleri ile ko değerlendirmek için çeşitli yöntemler kullanırlar. Bu bizi içeririfade heterolog sistemlerde e reseptörleri ve bölme belirteçleri (örneğin, Rab-aile GTPases) kimerik yapıları floresan proteini etiketli. Bu potansiyel fiksasyon ve permeabilization ile ilgili konuları kaldırarak, canlı hücre görüntüleme kullanımını sağlar. Daha fizyolojik temsilci hücre tipleri ile davranış ve uyumsuzluk ticareti üzerindeki etiketi ve ifade seviyesi etkileri: Güçlü iken, böyle bir strateji heterolog genel sistemlerin aynı sınırlamalara muzdarip. Daha halk, boyalar kolaylıkla hücre içi bölmeleri etiketlemek için kullanılır (örneğin, lizozomlar, görünürde) 10. Boyalar, ancak özgüllüğü (lizozomlar için boyalar durumunda bütün asidik organeller) eksikliği ve diğer bölmeleri sayesinde ticaretini değerlendirmek yok. Yine de, bu teknikler, sistem ve deneysel koşullar üzerinde önemli bir kontrole olanak aşağıdaki burada sunulan ko analiz yöntemleri yararlanabilir.
Metot WBurada mevcut e ko reseptör ticareti izleme geliştirir. Uygun belirteçleri etiket immünsitokimya (ICC) kullanarak, birden fazla farklı hücre içi bölmeleri tespit etmek mümkündür. Bu, aynı zamanda, heterolog sistemlerde yerine fizyolojik olarak-ilgili primer hücre kültürlerinde kullanımına izin verir. Bu ICC protokol etiketleme öncesi ilgi hücreleri tespit kapsar; Bu ilaç tedavisi (ler) itibaren belirli bir timepoint etiketleme izin verir. Bu, o zaman noktasında küresel reseptör bölmesi dernekleri bir 'anlık' üretiyor. Birden timepoints ile kaçakçılık değişikliklerin bir timecourse da inşa edilebilir.
Kısaca, hücreler, ilaç ile muamele edilmiş, reseptör ve ilgi duyulan hücre içi bölüm için etiketli, odaksal olarak görüntülü ve fotomikrografları matematiksel reseptör ve bölme 11 arasında ko ölçmek için analiz edilir. Bizim kullanımı, biz Ra ile bir reseptörün ko incelendiğindeb5, Rab11 ve membran protein 1 (LAMP1) Lizozomal ilişkili. Bu belirteçler, sırasıyla erken endozomlar, geri dönüşüm endozomlar ve lizozomları belirlemek. Bu ko önlemler içselleştirilmesi, geri dönüşüm ve yıkımı 12 kapsayıcı süreçler için vekiller olarak hareket ederler.
Tüm teknikler ile olduğu gibi, bazı sınırlamalar dikkate alınmalıdır. Nedeniyle her bireyin nöron analiz görüntüye ihtiyacı, bu tekniğin ilgili koşullar ve timepoints sayısına bağlı olarak oldukça emek-yoğun hale gelebilir. Tüm immün da fiksasyon ve permeabilization 13 neden hücresel ultrastrüktürün, protein lokalizasyonu ve epitop erişilebilirlik üzerindeki etkileri ile uğraşmak gerekir.
Başlangıçta birincil duyu nöronlarının birincil kültürlerinde kullanılmak için optimize edilmiş olsa da, bu yöntem diğer tek tabaka kaplama kültürü modelleri genel olarak uyumludur.
Bir matematiksel sayısal MEASUR kullanımıko e özellikle, çok daha metodolojik, genellikle bu tür görsel-kontrol çok kanallı bindirmeleri 14 olarak belirsiz, öznel ölçütlere yararlanmıştır reseptör kaçakçılığı değişiklikleri değerlendirmek için kullanılan önceki tekniklere göre daha titiz olduğunu.
Bu teknik, in vivo girişimler (önce primer kültür üretimi) ile geniş uyumluluk için özellikle yararlıdır, in vitro müdahaleler (kültür büyüme sırasında) ve çeşitli etiketleme 15 hedefler. Bu nedenle, çok sayıda farklı araştırma sorulara uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Bu protokol, çeşitli tek tabaka kaplama hücre / doku kültürü modelleri, ilaç tedavisi rejimleri ve etiketleme hedefleri ile geniş uyumludur. Böylece gerçek kullanımda, birçok özel parametreler deneysel tasarım göre değişir. Burada, bu kullanıcı tanımlı parametrelere başvurular genel bulunmaktadır. Örnek sonuçlar elde etmek için kullanıldığı haliyle örnek koşullar, italik olarak dahil edilmiştir.
1. Çözümler
- 0.1 M Tris-tamponlu hipertonik (300 mM), tuzlu su ve% 0.05 Polisorbat 20 karıştırarak yıkama tamponu hazırlayın; oda sıcaklığında, pH 7.4 ile yıkanır.
- Bloklama tamponu hazırlayın. 0.05 M Tris-tamponlu hipertonik (300 mM) Salin% 0.05 polisorbat 20,% 3 bovin serum albumin (BSA) ve% 0.1 soğuk balık derisi jelatini ekleyin ve oda sıcaklığında pH'ı 7.4'e ayarlayın.
- 0.05 M Tris-tamponlu hipertonik (300 mM) Saline% 0.05 Polisorbat 20,% 1 BSA,% 0.1, soğuk balık derisi jelatini ekleyerek antikor seyreltici hazırlamak ve o 4 ° C'de 7.4 pH ayarlamak
Not: Tris tampon pH sıcaklığa bağlıdır. Bu sıcaklıkta bir değişiklik, solüsyonun pH değerinin, değişecektir. Tutarlılık için, bu tamponlar her zaman kullanılacak ısıda, pH ayarlı olmalıdır.
2. Hücre Kültürü
Not: Uygun hücre kültürü protokolleri olarak kullanılan hücre tipi (lerine) dayalı olarak değişiklik gösterecektir. Bu prosedürler ayrı olarak optimize edilmelidir. Detaylı hücre kültürü yöntemleri 16 de dahil olmak üzere, kolaylıkla temin edilebilir. Benzer bir prosedür, önemli farklılıklar ile temsili sonuçlar elde etmek için kullanıldı:
- Yetişkin hayvanların Kültür arka kök gangliyon nöronları 12 tarif edildiği gibi. Kültür hücreleri yetişkin sinir büyüme ortamı kullanın. Yerine glutamat daha preplating ile glial hücre yoğunluğunu azaltın. Bu approximat büyüdü en az 30-60 plaka başına nöronların ve beraberindeki glial hücreler 12-yuvarlak cam lamelleri üzerinde yetiştirilen karışık nöron glial kültürü sonuçlarıely% 40 konflüansa. Bu glia aşırı büyümesi izin verilmesi halinde, birincil kültür nöronları çoğaltma olmayacak ve ko-kültive glia yardımıyla baskı plakasının itildiği olacağı unutulmamalıdır. Nöronlarını etkileyenler önlemek için, gliyal sayı fiziksel indirgeme kimyasal / farmakolojik yöntemler tercih edilir.
Not: Bu protokolün amaçları için, ilgi hücreleri yetiştirilmektedir varsayalım onların deneysel-istenen devlet ve tek tabaka kaplama. Biz 24 yuvalı plakalar içinde 12 yuvarlak cam lameller üzerine kaplama en uygun olduğu fark. Tarif edilen tüm miktarlar ve prosedürleri, bir 24 yuvalı plakanın bir oyuk bir lamel için uygundur.
Kültür Hücrelerinin 3. İlaç Tedavisi
Not: Birden çok sıralı veya üst üste, ilaç tedavileri mümkündür. Belirli deney bağlıdır kullanılan maruziyet ilaçlar, dozları / konsantrasyonları ve süreleri.
- Orijinal büyüme ortamı çıkarın 16 Not: her bir bağımsız tekrarlanan (genellikle tek bir 24-çukurlu plaka kültür) aynı ortak kontrol koşulu içermesi önemlidir. Bu arası deneme değişkenlik düzeltir çoğaltır arasında veri normalleşmesini, izin verecektir.
- 48 saat süre ile 16 orijinal büyüme koşulları hücreleri inkübe edin.
- Daha sonra ilaç tedavileri için, tekrar 3.1 adımları ve Deltorphin 1 uM ile 3.2 SNC80 1 uM ya da araç ve 60 dakika 12 boyunca inkübe edin. Su içinde Deltorphin II çözünmezler ve su içinde 1 mM'ye seyreltilmiş 40 uM HCI ve sonikasyon, 10 mM'de SNC80 çözünür.
Not: Bu protokol, seçtikleri büyüme ortamı içinde arzu edilen konsantrasyona (ler) eritilebilir olduğu ilaç (lar) gibi çözünebilir edilmiştir varsayar. Için uygun prosedürlerbu çözündürme, söz konusu ilacın bağlı olarak değişecektir ve ayrı olarak optimize edilmelidir. - Yıkama başına yıkama tamponu ~ 1 ml, yavaşça üç defa hücreleri yıkayın. (Yıkama tamponu ile bu durumda) arzu edildiği gibi hafifçe taze çözelti ile iyi bir doldurma, kuyudan sıvının aspire, daha sonra derhal, yavaşça her yıkama yapın.
4. Tespit ve İmmünositokimya
Not: Belirli etiketleme hedefleri deney ile değişecektir. Tartışıldığı gibi bizim kullanmak, biz, delta opioid reseptörleri (DOR) ve Rab5, Rab 11 ve LAMP1 etiketli. spesifik antikorlar, belirli bir deney bağlıdır kullanılır. Optimum etiketleme koşulları spesifik antikor kullanılır (ler) bağlıdır. Bu konunun bir çok dolgun bir tartışma altındadır.
- 37 ° C 'de 10 dakika boyunca ~ 0.1 M fosfat tamponlu salin içinde 300 ul% 4 paraformaldehid daldırma hücreleri saptamak.
Not: Önemli olan bu% 4 paraformaldehit taze nedeniyle önceden dondurulmuş paraformaldehit kullanımından kaynaklanan otofloresansı için hazırlıklı olun. - 3.3'de tarif edildiği gibi, yıkama başına yıkama tamponu ~ 1 ml, yavaşça 3 kez hücreleri yıkayın.
- Oda sıcaklığında 2 saat süre ile blokaj tamponu ul 300 hücreleri inkübe edin.
- 4 ° C 'de 48 saat süre ile, antikor seyreltici 300 ul primer antikorlar ile inkübe hücreleri. Bizim Kullanım sırasında, birincil DOR karşı antikorların (tavşan anti Dor) ve on: Rab5 (fare anti-Rab5), Rab 11 (fare anti-Rab11) ve LAMP1 (keçi anti-LAMP1).
- 3.3'de tarif edildiği gibi, yıkama başına yıkama tamponu ~ 1 ml, yavaşça üç defa hücreleri yıkayın.
- Farklı fluorophores konjüge edilmiş sekonder antikor ile inkübe hücreleri oda sıcaklığında 1 saat için antikor seyreltici 300 ul (aşağıdaki tartışmaya bakınız). Bu ve takip eden tüm adımlarda ışık hücreleri korur. Temsili sonuçlar elde etmek için, yeşil yayan fluorofor-konjuge anti-tavşan ve eith kullanmaker kırmızı yayan fluorofor konjuge edilmiş anti-fare ya da kırmızı yayan fluorofor-konjuge anti-keçi.
- 3.3'de tarif edildiği gibi, yıkama başına yıkama tamponu ~ 1 ml, yavaşça 3 kez hücreleri yıkayın.
- ~ Plakayı tutan, iyi her 45o yıkama tamponu ~ 1 ml bırakarak 24 kuyucuğu 12-yuvarlak lamelleri çıkarın ve ince forseps kullanılarak kuyu zemin kapalı lamel kolu. lamel kolayca forseps kullanılarak kaldırılabilir yerden, iyi duvara dinlenmek için gelecek.
- Mikroskop üzerinde, lamelleri, hücre tarafı aşağı monte montaj orta, anti-solma slaytlar.
5. Mikroskop Ayarları
- Yüksek büyütmeli objektif (100X) kullanarak, ilk Epifloresans kullanarak görüntülü edilecek bir temsilci hücreyi bulun.
- Örneğin kullanılan her floroforun algılama, 488 nm ve 59 için (her etiketli kanalın 8-bit sıkıştırılmamış TIFF görüntüleri kaydetmek için görüntü yakalama ayarlarını yapılandırın4 nm), (ya hat ya da çerçeve), ve son görüntü için ortalama 4 ila 6 taramalara görüntüye her kanal sıralı. Optimal görüntü çözünürlüğü mikroskop özgü olacak ama x 1024 1024 genellikle iyi sonuç verir.
- Konfokal görüntüleme yoluna geçin ve hücrenin merkezinden geçen z-düzlemine odaklanmak.
- Iğne deliği (tipik olarak 1 Airy birimi), lazer gücü ve photomultiplier tüp gerilimi (kazanç) Optimize ve her bir kanal için ofset. Bu ayarları kaydetmek / kaydedin. Aynı çoğaltmak herhangi belirli bir hedef çifti için etiketlenmiş tüm hücreleri görüntüleme için aynı mikroskop ayarları kullanın.
Not: Bu işlem, genellikle, bu hücre analizi için görüntülenmiştir gerektiğini yeterli ışıkla ağartma neden olur.
6. Görüntüleme
- Yüksek bir büyütme objektif (ör 100X) kullanarak, birinci Epifloresans kullanarak görüntülü bir hücre bulun.
- Konfokal görüntüleme yoluna geçin ve hücrenin merkezinden geçen z-düzlemine odaklanmak. Benf mevcuttur, kullanım yazılım yakınlaştırma / kırpma ilgi hücreye tarama alanını kısıtlamak için.
- Ayarları kullanarak her işaretli kanal için Yakalama görüntüleri, daha önce kurulmuş. Tekrarlayın yeterli örnek sağlamak için görüntüye çoğaltmak başına koşulu başına 15 veya daha fazla hücre 6,1-6,3 adımları.
7. ko Analizi
- Görüntülerin çifti açın (örneğin, 'yeşil' ve 'kırmızı'), ImageJ bir hücrenin. > Renk> RGB görüntü oluşturmak için komut ... Kanallar Birleştirme Görüntü kullanın.
- Ilgi hücrenin etrafında bir seçim çizin. Seçilen hücredeki hedeflerin ko ölçmek için (https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/ edinilebilir 11) "PSC ko" eklentisi ImageJ kullanın.
- İstenilen ko önlem (genellikle Pearson r 17) kaydedin. Tekrarlayın, her görüntülü hücre için 7,1-7,3 adımları. 8. Veri Normalleştirme
- Her ortak denetim koşullarının kayıtlı ko değerlerinin ortalamasını hesaplayın her etiketleme durumunun çoğaltırlar.
Not: Örneğin, nöronların ko değerlerinin ortalama "48 saatlik bir araç, 60 dakikalık bir araç" 3 etiketleme koşullarında (reseptör ve 3 bölmelerin her biri) her 3 bağımsız Her bir replika ilaç durumu. - (-1) Her biri, her etiketleme durumda çoğaltmak için mahsup verim ile araçları çarpın. Her o çoğaltmak her ko değeri her etiketleme durumda çoğaltmak için ofset ekleyin.
Not: Bu ortak kontrol durumu için ortalama ko ölçüsü her etiketleme durumunun her tekrarında 0 olacak şekilde veriyi normalleştirmek edecektir. - Her etiketleme durumunun her çoğaltır verileri Havuz.
Not: ko değişiklikler artık çoğaltır genelinde analiz edilebilir. İstatistiksel analYsis deney tasarımı bağlı olacaktır ancak tipik bir analiz arasında varyans içerecektir (ANOVA) (örneğin, Tukey) uygun post-hoc testler takip etmektedir. İstatistiksel kaynakları için, 18, örneğin bkz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu tekniği kullanarak, bu uzun süreli / kronik ve akut ilaç tedavileri hem Aşağıdaki reseptör sonrası içselleştirme kaçakçılığı değişiklikleri ölçmek mümkündür. İlaç tedavileri, fiksasyon ve etiketleme sonrasında, yüksek çözünürlüklü iki kanallı fotomikrografları ilgi her hücrenin yakalanır. Örnek görüntüler şekillere (Şekil 1) üretilmesi için, yanlış renk ko ile kombine edilebilir. Daha sonra colocalizational analizi, tarif edildiği gibi, hedef, hedef ko (örneğin, reseptör bölmeli belirteç) kantitatif skorları elde edilmiştir. Bu veriler daha sonra bu durumda, değişiklik karşılaştırmak için kullanılabilir, ilaç tedavisi (lar) (Şekil 2) ile uyarılan reseptör ticareti.
Fal ile reseptörü ve bölme-işaretleyici etiketleme Şekil 1. Temsilcisi fotomikrografiklerSE renkli ko haritaları. arka kök gangliyon duyu nöronlarının birincil kültürleri uzun süreli (48 saat) ve akut (1 saat) ilaç tedavileri (sol eksen etiketleri) maruz bırakıldı. Sadece bir uzun süreli koşul temsilcisi sonuçları olarak gösterilir. Hücreler daha sonra delta opioid reseptörleri (DOR) ve (konjuge fluorofor) farklı birincil-ikincil ile geri dönüşüm endozomlara belirteci (Rab 11) antikor çiftleri (üst eksen etiketleri) için immunolabeled bulundu. Hücreler iki kanallı sıralı konfokal mikroskopi (sol sütunda, orta sütun) tarafından görüntülendi. Temsilcisi görüntüleri İki nöron iki etiketli hedef gösteriyor. Bir nöron akut araç (üst) ve ardından uzun süreli morfin ile muamele edilmiştir. Diğer sinir akut Deltorphin II (; Alt DELT, Dor agonist) takiben uzun süreli morfin ile muamele edilmiştir. Daha sonra kantitatif colocalizational analizine ek olarak, bu temsili görüntüler yanlış renkli ko haritaları (sağ kolon) oluşturmak için işleme tabi tutuldu. Ölçek çubukları sho10 um ağ. 3.0-NC CC BY hükümleri uyarınca 12 den uyarlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Sayısal ko puanları. Reseptör sonrası içselleştirme kaçakçılığı değişiklikleri karşılaştırmak için kullanılır dorsal kök gangliyon duyu nöronlarının birincil kültürleri uzun süreli (48 saat) ve akut (1 saat), ilaç tedavileri (x ekseni etiketleri) maruz bırakıldı. Sadece bir uzun süreli koşul temsilcisi sonuçları olarak gösterilir. Hücreler daha sonra DOR ve erken endozomlarda, geri dönüşüm endozomlarda ve lizozomlarda belirteçleri için imüno bulundu. 4 bağımsız çoğaltır - görüntüleme ko skorları belirlendi sonra, normalize ve 3 boyunca toplanmış. Veriler daha sonra varyans iki-yönlü analizi ile (analiz edildiTukey HSD post-hoc ile ANOVA). Veriler ortalama +/-% 95 güven aralığı olarak sunulmuştur. * P <0.05 ifade eder. Görüldüğü gibi bu teknik, Deltorphin II akut muamele ile uyarılan DOR sonrası içselleştirme ticareti değişikliklerin belirlenmesi izin ama SNC80 (iki farklı DOR agonistleri). 3.0-NC CC BY hükümleri uyarınca 12 den uyarlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Erişkin dorsal kök ganglion nöronlarının (birincil duyu nöronları) birincil kültürleri analizi için bu protokolü optimize ettik. Aynı zamanda, genel olarak tek tabaka kaplama kültürlenmiş hücreler için, az ya da hiç bir değişiklik, kullanılabilir. colocalizational analiz ancak ilaç tedavisi ve doku tespit / hazırlık bileşenleri uygun olmaz, aynı zamanda doku dilimleri ve benzeri hazırlıkları 11 mümkündür.
Ilgi çekici olan, burada sunulan ICC yöntemleri, aynı zamanda, doku dilimleri çift etiketli immünohistokimya gerçekleştirmek için, uygun bir sabitleme ve doku hazırlanması kullanılabilir bağımsız bir sonraki analiz için (örneğin, 19).
Bu protokol, farklı etiketleme hedeflerine büyük ölçüde uyumludur. Kaplama hücrelerinin her lamel çift etiketli olacak. Genellikle, bu, söz konusu alıcı ve ilgi bölmelerden birinin bir marker için olacaktır. Oradagenellikle çok farklı bölmeleri ile reseptör ko incelemek için birden fazla etiketleme koşullarını olacaktır.
Antikorlar doğal değişkendir. Uygun etiketleme protokolleri farklı antikorlar arasında değişecektir. Bu uygun antikor konsantrasyonları, tampon tarifleri ve zaman noktalarında bulunuyor. Ayrıca, aynı antikorun farklı bir çok iyi, farklı antikorlar olarak kabul edilir olduğu not edilmelidir. Bu nedenle, etiketleme yöntemleri ve antikor özgüllüğü kontrol edilmelidir, ve gerekirse antikoru ve hedef dokunun her kombinasyon için, optimize edilmiş. Burada kullanılan yöntemler yararlı bir başlangıç noktası vardır. Bu sekonder antikor (otofloresansı kontrol etmek için) eklenmeden ve primer antikorlar (spesifik olmayan ikinci bir işaretleme kontrol etmek için) olmadan işleme örnekleri içerir: etiketleme doğrulama, bu, uygun olan kontrol yapmak için önemlidir.
Etkileyen birçok faktör vardırEtiketleme yöntemlerinin tasarımı. Burada yer alan yöntem etkileyen kayda bazı hususlar Tris tampon, hipertonik salin, polisorbat, BSA ve soğuk balık derisi jelatini kullanımını içerir. Fosfat tampon yüksek spesifik olmayan etiketleme neden olabilir ve bazı daha az kullanılan antikor konjugatları ile etkileşime girebilir. Bununla birlikte, Tris tamponları, belirtildiği gibi, sıcaklığa duyarlı. Hipertonik tuz konsantrasyonları iyonik etkileşimler bozarak non-spesifik etiketleme azaltır. Bundan başka, arzu edildiği takdirde, bu protokolde belirtilen ötesinde tuz konsantrasyonlarını arttırmak mümkündür. Polisorbat 20, nispeten yumuşak bir yüzey aktif madde / deterjan olarak kullanılır. Bu Triton X-100, böylece önemli ölçüde membranlar ve hücre içi bir yapıya deforme bozabilir ve hatta çözünmesi için rapor edilmiştir tercih edilir. Bu yıkama titizlik artırır tüm tamponlar içinde düşük konsantrasyonda dahil Polisorbat 20, spesifik olmayan etiketleme azaltılmasında yararlıdır. BSA yaygın olarak kullanılan bir bloke edici madde tasarlanmaktadırHedef dokuda spesifik olmayan protein bağlayıcı bölgelerin işgal etmek. Bazı BSA agrega ve non-spesifik noktasal etiketleme yol açabilir bildirmişlerdir. Bu sorun ortaya çıkarsa, bu yağsız kuru süt veya ek soğuk balık derisi jelatin ile BSA değiştirmek mümkündür. Soğuk balık derisi jelatini, aynı zamanda, memeli proteinlerine 20 karşı yönlendirilmiş antikorlar düşük reaktif sunarken spesifik olmayan protein bağlanma bölgelerini işgal amaçlanan bir memeli olmayan protein kaynağıdır.
Bu protokolde belirtilen olmasına karşın, ikincil antikor büyüdü hangi türe engelleme tamponu normal seruma eklemek için tipiktir. % 3 - tipik konsantrasyonları 1 vardır. Aşağıda tartışıldığı gibi, türlerin seçiminde bakım çapraz reaksiyonlarını önlemek için dikkatli olunmalıdır.
İki veya daha fazla floresan etiketli hedefin tespitine, uygun florofor kombinasyonlarının seçimi özellikle önemlidir. İyi spektral devamlı ayrı olması esastırkarışmasını önlemek amacıyla oranı. Bundan başka, florofor seçimi kullanılmak üzere mikroskop konfigürasyonda (uygun filtre, lazer hattı, vs.) bağlı olacaktır. Fluorofor-konjuge antikor tedarikçilerin ürünlerinin en iyi kombinasyonları (örneğin, 21) üzerine tavsiyelerde bulunur. Biz çift etiketleme ve colocalizational analizi için en iyi çifti olmak için 488 `/flj- ve 594 nm-heyecanlı fluorophores bulabilirsiniz.
İkincil antikorlar, tipik olarak, türe reaktif olan. Yani, hedef türler tarafından üretilen herhangi bir antikor etiketleyecektir. Çift işaretleme ICC Dolasıyla çapraz reaktivite önlemek için birincil ve ikincil antikor konak türlerinden seçiminde alınması gerekir. Primer tavşan ve keçi yetiştirilir Örneğin, kullanmak için uygun olmaz bir keçi kaldırdı ikincil. Antikor kullanılabilirliği gibi türlerin ayrılması için izin vermezse, MULTIP ile etiketleme gerçekleştirmek için mevcut protokoller vardırle aynı konak primer antikorlar (örneğin, 22), önemli ölçüde daha fazla optimizasyon ve doğrulama beklenmelidir olsa.
Bu yöntem fotomikrografilerinde ko quantifies gibi, tüm mikroskopi kaliteli, tutarlı ve görüntülü örneklerin doğru bir temsil olması temelde gereklidir. Bu, kullanılan donanım (optik kalitesi, vs) ve seçilen belirli prosedürleri ve parametreleri içerir. Colocalizational analiz 11,17,25 için özel mikroskopi dahil uygun mikroskopi 23,24 rehberlik için mevcut mükemmel kaynaklar vardır.
Görsel bindirme yöntemlerine önemli metodolojik üstünlük rağmen, ko kantitatif tedbirler olarak güzel yayın için açıklayıcı rakamlar nesil kendilerini ödünç yok. Böyle açıklayıcı rakamlar okuyucuları için sık sık yararlı ve onların yokluğu reviewe tarafından eleştirilen olabilirrs. Biz yanlış renkli 'heatmaps' görselleştirme ko dahil rakamları inşasında yardımcı olmak için bulduk. ImageJ eklentisi (https://sites.google.com/site/colocalizationcolormap/ temin edilebilir) "ko Renk Haritası", bu görüntüler oluşturmak için yararlıdır. Bu görüntüler Burada anlatılan teknik bağlamında katı açıklayıcı olacaktır, bununla birlikte, dikkat etmek önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu eser CIHR (MOP394808) ve CMCEWO bir Kanada Araştırma Başkanı bir hibe ile desteklenen NSERC bir Post-Yüksek Lisans Bursu layık görüldü.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 circle Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehyde | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Rabbit anti-DOR antibody | MyBioSource | MBS316175 | Used at 1:1,500 |
| Mouse anti-Rab5 antibody | Sigma Aldrich | R7904 | Used at 1:750 |
| Mouse anti-Rab11 antibody | Millipore | 05-853 | Used at 1:500 |
| Goat anti-LAMP1 antibody | Santa Cruz | SC8098 | Used at 1:750 |
| Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody | Life Technologies | A-21206 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
| Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11005 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
| Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11058 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
References
- Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J.
- Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48, 537-568 (2008).
- Hislop, J. N., von Zastrow, M. Role of ubiquitination in endocytic trafficking of G-protein-coupled receptors. Traffic. 12 (2), 137-148 (2011).
- Nagi, K., Piñeyro, G. Regulation of opioid receptor signalling: implications for the development of analgesic tolerance. Mol. Brain. 4 (1), 25 (2011).
- Whistler, J. L., Enquist, J., et al. Modulation of postendocytic sorting of G protein-coupled receptors. Science. 297 (5581), 615-620 (2002).
- Von Zastrow, M. Regulation of opioid receptors by endocytic membrane traffic: mechanisms and translational implications. Drug Alcohol Depend. 108 (3), 166-171 (2010).
- Milan-Lobo, L., Whistler, J. L. Heteromerization of the µ- and δ-opioid receptors produces ligand-biased antagonism and alters µ-receptor trafficking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 337 (3), 868-875 (2011).
- Wang, H. -B., Guan, J. -S., Bao, L., Zhang, X. Distinct subcellular distribution of delta-opioid receptor fused with various tags in PC12 cells. Neurochem. Res. 33 (10), 2028-2034 (2008).
- Scherrer, G., Tryoen-Tóth, P., et al. Knockin mice expressing fluorescent delta-opioid receptors uncover G protein-coupled receptor dynamics in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (25), 9691-9696 (2006).
- He, S. -Q., Zhang, Z. -N., et al. Facilitation of µ-opioid receptor activity by preventing δ-opioid receptor-mediated codegradation. Neuron. 69 (1), 120-131 (2011).
- French, A. P., Mills, S., Swarup, R., Bennett, M. J., Pridmore, T. P. Colocalization of fluorescent markers in confocal microscope images of plant cells. Nat. Protoc. 3 (4), 619-628 (2008).
- Ong, E. W., Xue, L., Olmstead, M. C., Cahill, C. M. Prolonged morphine treatment alters δ opioid receptor post-internalization trafficking. Br. J. Pharmacol. 172 (2), 615-629 (2014).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. a Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Rozenfeld, R., Gupta, A., Devi, L. A. Cell surface targeting of mu-delta opioid receptor heterodimers by RTP4. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (41), 16045-16050 (2008).
- Gupta, A., Mulder, J., et al. Increased abundance of opioid receptor heteromers after chronic morphine administration. Sci. Signal. 3 (131), ra54 (2010).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. (65), 1-7 (2012).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
- Field, A., Miles, J., Field, Z. Discovering Statistics Using R. , SAGE Publications. Los Angeles, CA. (2012).
- Mattioli, T. -A. M., Milne, B., Cahill, C. M. Ultra-low dose naltrexone attenuates chronic morphine-induced gliosis in rats. Mol. Pain. 6, 22 (2010).
- Vogt, R. F., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates. J. Immunol. Methods. 101 (1), 43-50 (1987).
- The Molecular Probes Handbook. Johnson, I., Spence, M. , Life Technologies. Carlsbad, CA. (2010).
- Morris, T. J., Stanley, E. F. A simple method for immunocytochemical staining with multiple rabbit polyclonal antibodies. J. Neurosci. Methods. 127 (2), 149-155 (2003).
- Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. , Springer. New York, NY. (2006).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).
