Summary
le trafic de signalisation et module récepteur cellulaire réactivité aux ligands et est, elle-même, répondant à des conditions cellulaires, y compris la signalisation induite par le ligand. Ici, nous décrivons une technique puissante et flexible pour évaluer quantitativement le trafic des récepteurs induite par le médicament en utilisant immunomarquage et analyse colocalizational.
Introduction
Les récepteurs, en particulier des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), sont couramment un trafic intracellulaire, et à partir de la surface de la cellule 1. Ces processus de façon complexe orchestrées et étroitement contrôlées dictent disponibles compléments de récepteurs de cellules et régulent l'activité du récepteur temporelle, la désensibilisation, et resensibilisation 2-4. Fait important, ces processus sont sensibles à des environnements cellulaires, y compris l'activité ou de l'inactivité récepteur induite par le médicament. Autrement dit, l'action des ligands au niveau des récepteurs peuvent modifier trafic intracellulaire de ces récepteurs, en modifiant ainsi la sensibilité des cellules. De cette manière, les ligands externes exercent encore plus d'effets sur la fonction de la cellule, au-delà même messager à effecteur cascades classiques 5,6.
Examen de tels changements dans le trafic des récepteurs induite est difficile. Toutes les techniques disponibles comportent des limitations. des essais de protection de la biotine ont été utilisés pour moniTor récepteurs de surface populations. Ces récepteurs sont biotinylés et un timecourse des immunoprécipitations sont effectuées afin de quantifier la réduction des récepteurs biotinylés au fil du temps. Cette technique surveille essentiellement la dégradation progressive d'une première, étiqueté, population de récepteurs 7, et est très utile dans la construction des cours à temps de ce processus. Malheureusement, cet essai est incapable de surveiller tout autre procédé que la dégradation de la piscine d'origine de récepteurs, tels que l'internalisation, le recyclage ou de nouveaux récepteurs. En outre, l'addition d'un anticorps dans la plage de 150 kDa à un récepteur dans la plage de 50 kDa peut modifier le trafic du récepteur 8,9, et cette technique peut être difficile à utiliser avec des récepteurs de faible niveau de l'expression.
D'autres procédures utilisent diverses méthodes pour identifier les compartiments de trafic intracellulaire (par exemple, les endosomes, etc.) et d'évaluer leur colocalisation avec les récepteurs d'intérêt. Cela inclut la nouse des systèmes hétérologues exprimant la protéine fluorescente-étiqueté constructions chimériques des récepteurs et des marqueurs du compartiment (GTPases par exemple, Rab-famille). Cela permet potentiellement l'utilisation de l'imagerie des cellules vivantes, en supprimant les questions relatives à la fixation et perméabilisation. Bien que puissant, une telle stratégie souffre des mêmes limitations des systèmes hétérologues en général: tag et le niveau d'expression des effets sur la traite des comportements et incompatibilité avec les types de cellules physiologiquement plus représentatifs. Plus populairement, les colorants sont utilisés pour étiqueter facilement compartiments intracellulaires (par exemple, les lysosomes, ostensiblement) 10. Colorants, cependant, peuvent manquer de spécificité (tous les organites acides dans le cas de colorants pour les lysosomes) et ne pas évaluer le trafic par d'autres compartiments. Pourtant, ces techniques permettent un contrôle considérable sur le système et les conditions expérimentales et peuvent bénéficier des méthodes d'analyse de colocalisation présentés ici, ci-dessous.
Procédé we présente ici affine le suivi du trafic des récepteurs par colocalisation. Utilisation immunocytochimie (ICC) pour étiqueter les marqueurs appropriés, il est possible d'identifier plusieurs compartiments intracellulaires distinctes. Ceci permet également l'utilisation de cultures de cellules primaires physiologiquement pertinentes en place des systèmes hétérologues. Ce protocole de la CPI consiste à fixer les cellules d'intérêt avant l'étiquetage; ce qui permet à un étiquetage spécifique timepoint après le traitement (s) de drogue. Cela produit un «instantané» des associations mondiales récepteur compartiments à ce point de temps. Avec de multiples points dans le temps, un timecourse des changements de trafic peut également être construit.
Brièvement, les cellules sont traités avec le médicament, pour le récepteur marqué et le compartiment intracellulaire d'intérêt, confocale imagé, et les microphotographies sont analysés pour quantifier mathématiquement colocalisation du récepteur 11 et le compartiment. Dans notre utilisation, nous avons examiné la colocalisation d'un récepteur avec Rab5, Rab11 et lysosomales-associated membrane protein 1 (LAMP1). Ces marqueurs identifient les endosomes précoces, les endosomes de recyclage, et les lysosomes, respectivement. Ces mesures de colocalisation agissent comme des procurations pour les processus généraux de l'internalisation, le recyclage, et la dégradation 12.
Comme avec toutes les techniques, certaines limites doivent être considérées. En raison de la nécessité d'image à chaque neurone individuel analysé, cette technique peut devenir assez de main-d'œuvre en fonction du nombre de conditions et de timepoints impliqués. Tous immunomarquage doit aussi composer avec les effets sur ultrastructure cellulaire, la localisation des protéines, et épitope accessibilité causés par la fixation et perméabilisation 13.
Bien que l'origine optimisé pour une utilisation avec des cultures primaires de neurones sensoriels primaires, cette méthode est largement compatible avec d'autres modèles de culture monocouche plaqué.
L'utilisation d'un mesur mathématiquement quantifiése de la colocalisation est, notamment, beaucoup plus rigoureuse au plan méthodologique que les techniques utilisées précédemment pour évaluer les changements de trafic de récepteurs, qui ont souvent compté sur des mesures subjectives vagues tels que visuellement inspectés superpositions multi-canal 14.
Cette technique est particulièrement utile pour sa large compatibilité avec les interventions in vivo (avant la génération de la culture primaire), interventions in vitro (pendant la croissance de la culture), et divers systèmes de marquage cible les 15. En tant que tel, il peut être adapté à de nombreux sujets de recherche différents.
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Protocol
Remarque: Ce protocole est largement compatible avec différents modèles monocouches plaqué cellules / tissus culture, les schémas de traitement de la toxicomanie, et les objectifs en matière d'étiquetage. Ainsi, en utilisation réelle, de nombreux paramètres spécifiques varient en fonction de la conception expérimentale. Ici, les références à ces paramètres définis par l'utilisateur sont génériques. conditions d'exemple, tel qu'il est utilisé pour obtenir les résultats représentatifs, sont inclus en italique.
1. Solutions
- Préparer du tampon de lavage en mélangeant du tampon Tris 0,1 M hypertonique (300 mM) de solution saline et 0,05% de polysorbate 20; pH 7,4 à température ambiante.
- Préparer un tampon de blocage. À 0,05 M Tris-Buffered hypertonique (300 mM) Saline ajouter 0,05% polysorbate 20, 3% de sérum albumine bovine (BSA) et 0,1% de gélatine de poisson froid de la peau et ajuster le pH à 7,4 à température ambiante.
- Préparer le diluant d'anticorps en ajoutant 0,05% polysorbate 20, 1% de BSA, 0,1% poisson froid gélatine de peau à 0,05 M Tris-Buffered hypertonique (300 mM) Saline et ajuster le pH à 7,4 à 4 o C.
Remarque: le pH du tampon Tris est dépendant de la température. Autrement dit, un changement de température va changer le pH de la solution. Par souci de cohérence, ces tampons doivent toujours être pH ajusté à la température à laquelle ils seront utilisés.
2. Culture cellulaire
Remarque: les protocoles de culture de cellules appropriées seront varier en fonction du type de cellule (s) utilisé. Ces procédures doivent être optimisés séparément. Détaillées des méthodes de culture cellulaire sont disponibles, y compris 16. Une procédure similaire a été utilisée pour obtenir les résultats représentatifs, avec des différences notables:
- Culture dorsales neurones des ganglions de la racine à partir d'animaux adultes comme décrit 12. Utilisation du milieu de croissance des neurones adultes pour cultiver les cellules. Réduire la densité des cellules gliales par prédépôt, au lieu de glutamate. Il en résulte une culture de neurones-glie mixte cultivées sur des lamelles de verre rondes de 12 à au moins 30 à 60 par plaque neurones et les cellules gliales qui accompagnent passé à approximatEly 40% de confluence. Il convient de noter que les neurones dans une culture primaire ne reproduire et seront poussés hors de la plaque de cellules gliales par co-cultivées si la glie sont autorisés à croître de façon excessive. Afin d'éviter d'affecter les neurones, la réduction physique de nombres gliales est préférable de méthodes pharmacologiques chimiques /.
Remarque: Pour les fins de ce protocole, nous supposons que les cellules d'intérêt sont cultivées à leur expérimentalement état souhaité et monocouche plaqué. Nous constatons que le placage sur des lamelles de verre de 12 rondes dans 24 plaques à puits pour être plus pratique. Tous les volumes et les procédures décrites sont appropriées pour une lamelle dans un puits d'une plaque à 24 puits.
3. traitement de la toxicomanie de cellules cultivées
Note: séquentielle multiple, ou se chevauchent, les traitements médicamenteux sont possibles. Les médicaments, les doses / concentrations et des durées d'exposition utilisée dépendra de l'expérience spécifique.
- Supprimer le milieu de croissance d'origine 16 Remarque: Il est important que chaque répétition indépendante (généralement un seul de culture de plaque de 24 puits) contient les mêmes conditions de contrôle commun. Cela permettra à la normalisation des données à travers les répétitions, qui corrige la variabilité inter-procès.
- Incuber les cellules dans des conditions de croissance d'origine 16 pendant 48 heures.
- Pour les traitements médicamenteux ultérieurs, répétez les étapes 3.1 et 3.2 avec deltorphine 1 uM, SNC80 1 uM, ou d'un véhicule et incuber pendant 60 min 12. Deltorphine II solubiliser dans l'eau et solubiliser SNC80 à 10 mM dans du HCl à 40 uM et de traitement par ultrasons, on le dilue à 1 mM dans de l'eau.
Remarque: Ce protocole prend le médicament (s) ont été solubilisés de telle sorte qu'ils peuvent être dissous à la concentration (s) souhaitée dans le milieu de culture choisi. Des procédures appropriées pourtel solubilisation varie en fonction de la drogue en question et doit être optimisé séparément. - Laver les cellules doucement, trois fois, avec ~ 1 ml de tampon de lavage par lavage. Effectuez chaque lavage en aspirant doucement le liquide du puits, puis rapidement, et doucement, le remplissage du puits avec une solution fraîche, comme vous le souhaitez (dans ce cas avec un tampon de lavage).
4. Fixation et Immunocytochemistry
Remarque: Les objectifs en matière d'étiquetage spécifiques varieront par l'expérience. Dans notre utilisation, nous avons appelé les récepteurs opioïdes delta (DOR) et Rab5, Rab 11, et LAMP1, comme nous le verrons. Les anticorps spécifiques utilisés dépendront de l'expérience spécifique. Conditions d'étiquetage optimales dépendent de l'anticorps spécifique (s) utilisés. Une discussion beaucoup plus complète de ce thème est ci-dessous.
- Fixer les cellules par immersion dans 300 ul ~ 4% de paraformaldehyde dans 0,1 M de solution saline tamponnée au phosphate pendant 10 min à 37 ° C.
Remarque: il est important que le para 4%formaldéhyde être préparée en raison de l'auto-fluorescence résultant de l'utilisation de paraformaldéhyde préalablement congelé. - Laver les cellules avec douceur, trois fois, avec ~ 1 ml de tampon de lavage par lavage, comme décrit dans 3.3.
- Incuber les cellules dans 300 ul de tampon de blocage pendant 2 heures à température ambiante.
- Incuber les cellules avec des anticorps primaires dans 300 ul de diluant d'anticorps pour 48 heures à 4 ºC. Dans notre utilisation, les anticorps primaires contre DOR (lapin anti-DOR) et l'un des: Rab5 (souris anti-Rab5), Rab 11 (souris anti-Rab11), et LAMP1 (chèvre anti-LAMP1).
- Laver les cellules avec douceur, trois fois, avec ~ 1 ml de tampon de lavage par lavage, comme décrit dans 3.3.
- Incuber les cellules avec des anticorps secondaires conjugués à des fluorophores différents (voir la discussion ci-dessous) dans 300 ul de diluant d'anticorps pendant 1 heure à température ambiante. En cela, et toutes les étapes ultérieures, protéger les cellules de la lumière. Pour obtenir les résultats représentatifs, utiliser émettant dans le vert fluorophore conjugué anti-lapin et either un fluorophore conjugué anti-souris émettant dans le rouge ou anti-chèvre conjugué à un fluorophore émettant dans le rouge.
- Laver les cellules avec douceur, trois fois, avec ~ 1 ml de tampon de lavage par lavage, comme décrit dans 3.3.
- Retirez les lamelles de 12 rondes de plaques à 24 puits en laissant ~ 1 ml de tampon de lavage dans chaque puits, maintenant la plaque à ~ 45 °, et le levier de la lamelle hors du sol et à l'aide de pinces fines. La lamelle viendra en appui contre la paroi du puits, d'où il peut être facilement éliminé en utilisant la pince.
- Montez le lamelles, cellulaire à l'envers, sur des lames de microscope avec anti-décoloration milieu de montage.
5. Paramètres de microscope
- L'utilisation d'un objectif à fort grossissement (100X), d'abord localiser une cellule représentant à imager utilisant épifluorescence.
- Configurez les paramètres de capture d'image pour enregistrer 8 bits non compressés images TIFF de chaque canal marqué (pour la détection de chaque fluorophore utilisé par exemple, 488 nm et 594 nm), à l'image de chaque séquence de canal (soit par ligne ou cadre), et de 4 à 6 scans moyenne pour l'image finale. Résolution d'image optimale sera spécifique au microscope, mais 1024 x 1024 donne généralement de bons résultats.
- Basculer sur la voie d'imagerie confocale et de se concentrer à un plan z à travers le centre de la cellule.
- Optimiser sténopé (typiquement 1 unité Airy), la puissance du laser, et la tension de tube photomultiplicateur (gain) et le décalage pour chaque canal. Enregistrer / enregistrer ces paramètres. Utilisez les mêmes réglages du microscope pour l'imagerie de toutes les cellules marquées pour toute paire de cible donnée dans le même répliquée.
Remarque: Ce processus se traduira généralement en photoblanchiment suffisante que cette cellule ne doit pas être reproduite pour analyse.
6. Imaging
- L'utilisation d'un objectif à fort grossissement (par exemple, 100X), localiser une première cellule à imager à l'aide épifluorescence.
- Basculer sur la voie d'imagerie confocale et de se concentrer à un plan z à travers le centre de la cellule. JEf disponibles, zoom utiliser des logiciels / culture de restreindre la zone de numérisation de la cellule d'intérêt.
- Capture d'images pour chaque canal marqué en utilisant les paramètres précédemment établis. Répétez les étapes 6.1 à 6.3 à l'image 15 ou plusieurs cellules par condition par répétition pour assurer un échantillon suffisant.
7. La colocalisation Analyse
- Ouvrez la paire d'images (par exemple, «vert» et «rouge») d'une cellule dans ImageJ. Utiliser les images> Couleur> Fusionner les couches ... commande pour générer une image RVB.
- Tracez une sélection autour de la cellule d'intérêt. Utilisez le ImageJ plugin "CFP colocalisation" (11; disponible à partir https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/) pour quantifier colocalisation des cibles dans la cellule sélectionnée.
- Notez la mesure de colocalisation souhaitée (typiquement r de Pearson 17). Répétez les étapes 7.1 à 7.3 pour chaque cellule imagé. 8. Normalisation des données
- Calculer la moyenne des valeurs de colocalisation enregistrées des conditions de contrôle communs de chaque répétition de chaque condition d'étiquetage.
Remarque: Par exemple, la moyenne des valeurs de colocalisation des neurones dans le "véhicule de 48 h, 60 min véhicule" condition de médicament dans chacune des trois répétitions indépendants dans chacune des trois conditions d'étiquetage (récepteur et chacun des trois compartiments). - Multiplier les moyens par (-1) pour donner le décalage pour chaque répétition dans chaque état de l'étiquetage. Ajoutez le décalage pour chaque répétition dans chaque état de l'étiquetage à chaque valeur de colocalisation dans cette répétition.
Note: Ceci normaliser les données telles que la mesure de colocalisation moyen pour la condition de contrôle commun est 0 dans chaque répétition de chaque condition d'étiquetage. - Mutualiser les données de toutes les répétitions de chaque condition d'étiquetage.
Remarque: Les changements dans colocalisation peuvent maintenant être analysées à travers les répétitions. Anal statistiqueana- dépendra conception expérimentale, mais implique généralement une analyse de variance (Anova) suivie par des tests appropriés post-hoc (par exemple, Tukey). Pour les ressources statistiques, voir, par exemple, 18.
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Representative Results
En utilisant cette technique, il est possible de quantifier les changements dans le récepteur post-internalisation trafic suivantes deux traitements médicamenteux chroniques / prolongée et aiguës. Après les traitements médicamenteux, la fixation et l'étiquetage, à haute résolution photomicrographies deux canaux sont capturés de chaque cellule d'intérêt. Des images représentatives peuvent être combinés avec fausse couleur colocalisation pour générer des chiffres d'illustration (Figure 1). Analyse colocalizational ultérieure, tel que décrit, céder scores quantitatifs de colocalisation cible-cible (par exemple, un marqueur du récepteur-compartiment). Ces données peuvent ensuite être utilisées pour comparer les changements dans, dans ce cas, le trafic des récepteurs induite par le traitement de la toxicomanie (s) (Figure 2).
Figure 1. photomicrographies représentatifs de récepteur et le compartiment-marqueur étiquetage avec falcartes de colocalisation soi-couleur. cultures primaires de ganglions rachidiens neurones sensoriels ont été exposés à prolongée (48 heures) et aiguë (1 h) les traitements médicamenteux (étiquettes d'axe de gauche). Une seule condition prolongée est montrée comme des résultats représentatifs. Les cellules ont ensuite été immunomarquées pour les récepteurs opioïdes delta (DOR) et un marqueur de endosomes de recyclage (Rab 11) avec distincte primaire-secondaire (fluorophore conjugué) paires d'anticorps (top étiquettes de l'axe). Les cellules ont été imagées par microscopie à deux canaux séquentielle confocal (colonne de gauche, colonne centrale). Des images représentatives montrent les deux cibles marquées dans deux neurones. Un neurone a été traitée avec de la morphine prolongé suivi de véhicule aiguë (en haut). L'autre neurone a été traitée avec de la morphine prolongée suivie par deltorphine II aigu (DELT, un agoniste de DOR; en bas). En plus de l'analyse quantitative colocalizational ultérieure, ces images représentatives ont été traitées pour générer des cartes de colocalisation en fausses couleurs (colonne de droite). Les barres d'échelle show 10 um. Adapté de 12 en vertu des dispositions de CC BY-NC 3.0. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. scores de colocalisation quantitatives peuvent être utilisés pour comparer les changements dans le trafic des récepteurs post-internalisation. Cultures primaires de ganglions rachidiens neurones sensoriels ont été exposés à prolongée (48 heures) et aiguës (1 h) les traitements médicamenteux (étiquettes de l'axe des x). Une seule condition prolongée est montrée comme des résultats représentatifs. Les cellules ont ensuite été immunomarquées pour DOR et les marqueurs de endosomes précoces, les endosomes de recyclage, et les lysosomes. Après imagerie scores de colocalisation ont été déterminées, normalisée, et regroupées dans 3 - 4 répétitions indépendantes. Les données ont ensuite été analysées par analyse à double sens de la variance (ANOVA) avec HSD post-hoc de Tukey. Les données sont présentées sous forme de moyenne +/- intervalle de confiance de 95%. * Indique p <0,05. Comme on le voit, cette technique a permis l'identification des changements dans DOR post-internalisation trafic induits par le traitement aigu avec deltorphine II, mais pas SNC80 (deux agonistes DOR différents). Adapté de 12 en vertu des dispositions de CC BY-NC 3.0. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Nous avons optimisé ce protocole pour l'analyse des cultures primaires de neurones de ganglions de la racine dorsale adultes (neurones sensoriels primaires). Il peut également être utilisé, avec peu ou pas de modification, par des cellules en culture monocouche plaqué au sens large. L'analyse colocalizational est également possible dans des tranches de tissu et d'autres telles préparations 11, mais les composants de traitement de la toxicomanie et de la fixation des tissus / préparation ne serait pas approprié.
D'intérêt, les méthodes de la CPI présentées ici peuvent également être utilisés, avec fixation appropriée et la préparation des tissus, pour effectuer immunohistochimie doublement marquée dans des tranches de tissu, indépendamment de l'analyse ultérieure (par exemple, 19).
Ce protocole est largement compatible avec des objectifs différents en matière d'étiquetage. Chaque lamelle de cellules étalées sera doublement marquée. Typiquement, ce sera pour le récepteur d'intérêt et un marqueur de l'un des compartiments d'intérêt. Làsera typiquement de multiples conditions d'étiquetage afin d'examiner colocalisation du récepteur avec plusieurs compartiments différents.
Les anticorps sont intrinsèquement variable. Protocoles d'étiquetage appropriées varieront entre anticorps différents. Cela comprend des concentrations appropriées d'anticorps, des tampons, des recettes et des points dans le temps. Il convient également de noter que différents lots d'un même anticorps sont considérés comme étant le meilleur anticorps différents. En tant que tels, les procédés d'étiquetage et la spécificité des anticorps doivent être validées, et le cas échéant optimisés, pour chaque combinaison d'anticorps et de tissu cible. Les méthodes utilisées ici sont un point de départ utile. Lors de la validation étiquetage, il est important d'effectuer des contrôles appropriés: cela comprend les échantillons traités sans l'addition d'anticorps secondaires (pour contrôler les auto-fluorescence) et sans anticorps primaires (pour contrôler l'étiquetage secondaire non spécifique).
Il existe de nombreux facteurs qui influencent leconception de méthodes d'étiquetage. Quelques considérations de la note affectant les méthodes présentées ici comprennent l'utilisation de tampons Tris, sérum salé hypertonique, polysorbate, BSA, et le froid de la gélatine de peau de poisson. tampons de phosphate peuvent causer étiquetage supérieur non spécifiques et peuvent interagir avec certains conjugués d'anticorps moins utilisées. Cependant, tampons Tris sont, comme l'a noté, sensible à la température. Des concentrations de sel hypertoniques réduire marquage non spécifique en perturbant les interactions ioniques. Il est possible d'augmenter encore les concentrations de sel au-delà de ce qui est spécifié dans ce protocole, si on le souhaite. Polysorbate 20 est utilisé comme agent tensio-actif relativement doux / détergent. Ceci est préférable à Triton X-100, qui a été rapporté à perturber de manière significative, ou même dissoudre, membranes et de fausser ainsi la structure subcellulaire. L'inclusion de faible concentration polysorbate 20 dans tous les tampons est utile dans la réduction de marquage non spécifique, car il améliore la rigueur de lavages. BSA est un agent bloquant couramment utilisé destinépour occuper les sites de liaison protéiques non spécifiques dans le tissu cible. Certains ont rapporté que la BSA peut agréger et de conduire à l'étiquetage ponctuée non spécifique. Si cette question se pose, il est possible de remplacer la BSA avec du lait sec non gras ou supplémentaires gélatine de peau de poisson froid. Froid gélatine de peau de poisson est une source de protéine non mammifère également destiné à occuper les sites de liaison protéiques non spécifiques tout en présentant une faible réactivité des anticorps dirigés contre les protéines de mammifère 20.
Bien que non spécifiée par ce protocole, il est typique d'ajouter, à la mémoire tampon de blocage, le sérum normal de l'espèce dans laquelle l'anticorps secondaire a été soulevée. Les concentrations typiques sont de 1 - 3%. Comme on le verra ci-dessous, les soins à la sélection des espèces doivent être prises pour éviter les réactivités croisées.
Lors de la détection de deux ou plusieurs cibles marqués par fluorescence, le choix des combinaisons de fluorophores appropriés est particulièrement important. Il est essentiel d'avoir une bonne SEPA spectraleration afin d'éviter les interférences. En outre, le choix des fluorophores dépendra de la configuration du microscope à utiliser (filtres disponibles, des lignes de laser, etc.). Fournisseurs d'anticorps fluorophores conjugué offriront des conseils sur les meilleures combinaisons de leurs produits (par exemple, 21). Nous trouvons 488 Nm et 594 nm fluorophores-excité d'être meilleure paire de double étiquetage et l'analyse colocalizational.
Anticorps secondaires sont typiquement des espèces réactives. Autrement dit, ils seront étiqueter des anticorps produits par l'espèce cible. Double-étiquetage CPI exige donc que l'on prenne soin dans le choix des espèces hôtes des anticorps primaires et secondaires afin d'éviter une réactivité croisée. Par exemple, si les primaires sont élevés chez le lapin et la chèvre, il ne serait pas approprié d'utiliser une chèvre soulevé secondaire. Si la disponibilité de l'anticorps ne permet pas une telle séparation des espèces, il existe des protocoles disponibles pour accomplir marquage avec MultipLe même anticorps primaire à l'hôte (par exemple, 22), mais devrait être prévu sensiblement plus optimisation et de validation.
Comme cette méthode quantifie colocalisation dans microphotographies, il est fondamentalement nécessaire que tous microscopie être cohérent, de haute qualité, et précisément représentatifs des échantillons imagés. Cela comprend à la fois le matériel utilisé (de la qualité de l'optique, etc.) ainsi que les procédures et les paramètres particuliers choisis. Il existe d'excellentes ressources disponibles pour des conseils sur la microscopie appropriée 23,24, y compris la microscopie spécifiquement pour l'analyse colocalizational 11,17,25.
Bien que de supériorité méthodologique considérable aux méthodes de superposition visuelle, des mesures quantitatives de colocalisation ne tant que bien se prêtent pas à la génération de chiffres d'illustration pour publication. Ces chiffres indicatifs sont souvent utiles pour les lecteurs et leur absence peuvent être critiquées par reviewers. Nous avons trouvé que l'inclusion de fausses couleurs colocalisation visualisant 'heatmaps »pour être utile dans la construction de figures. Le plugin ImageJ "colocalisation palette» (disponible à partir de https://sites.google.com/site/colocalizationcolormap/) est utile dans la production de ces images. Il est important de noter, toutefois, que ces images soient strictement illustratif, dans le cadre de la technique décrite ici.
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Acknowledgments
Ce travail a été financé par une subvention des IRSC (MOP394808) et une chaire de recherche du Canada à CMCEWO était le récipiendaire d'une bourse d'études supérieures du CRSNG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 circle Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehyde | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Rabbit anti-DOR antibody | MyBioSource | MBS316175 | Used at 1:1,500 |
| Mouse anti-Rab5 antibody | Sigma Aldrich | R7904 | Used at 1:750 |
| Mouse anti-Rab11 antibody | Millipore | 05-853 | Used at 1:500 |
| Goat anti-LAMP1 antibody | Santa Cruz | SC8098 | Used at 1:750 |
| Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody | Life Technologies | A-21206 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
| Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11005 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
| Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11058 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
References
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