Abstract
Fibroblasten / Myofibroblasten (MFS) wurden immer mehr an Aufmerksamkeit für ihre Rolle in der Pathogenese und ihre Beiträge sowohl für die Wundheilung und die Förderung der Tumor-Mikroumgebung. Zwar gibt es derzeit viele Techniken zur Isolierung von Marktfaktoren von gastrointestinalen (GI) Gewebe, dieses Protokoll ein neues Element der Isolierung dieser Stromazellen aus gefrorenem Gewebe. Einfrieren GI Gewebeproben nicht erlaubt nur dem Forscher Proben aus weltweit Mitarbeiter, Biobanken und kommerziellen Anbietern zu erwerben, es erlaubt auch die verzögerte Bearbeitung von frischen Proben. Die beschriebenen Protokoll konsequent liefern charakteristische spindelförmige Zellen mit dem MF-Phänotyp, der die Marker CD90, α-SMA und Vimentin auszudrücken. Da diese Zellen aus Patientenproben abgeleitet ist, verleiht die Verwendung von primären Zellen auch den Vorteil der eng nachahmt MFs an Krankheitszuständen, nämlich Krebs und entzündlichen Darmerkrankungen. Diese Technik hat been im Magen, Dünndarm und Dickdarm-MF Primärkulturerzeugung validiert. Primär MF Kulturen können in einer Vielzahl von Experimenten, über eine Anzahl von Durchgangs verwendet werden, und ihre Reinheit sowohl durch Immunzytochemie beurteilt und Durchflusszytometrie-Analyse.
Introduction
Myofibroblasten / Fibroblasten (MFS) stellen eine reiche Population von Zellen in der gastrointestinalen (GI) Schleimhaut. Diese Stromazellen gerade unterhalb von Epithel und bilden ein miteinander verbundenes Netzwerk innerhalb Schleimhaut Lamina propria im Darm. MFs sind nicht nur für die Ablagerung der extrazellulären Matrix verantwortlich, sondern durch parakrine Regulation kann Elektrolyttransport, Rückgabe und Barrierefunktion der benachbarten Epithel 1, 2 beeinflussen. Weiterhin haben MFs gezeigt, dass eine zentrale Rolle bei der Entzündung und Gewebe spielen Umbau 3, 4. Myofibroblasten sind ein kritischer Teil der Tumor-Mikroumgebung, wo sie auch als Krebs assoziierten Fibroblasten bekannt, und dazu beitragen, die das Tumorzellwachstum und dienen als Nische für Krebsstammzellen 3. Schwellen Daten legt nahe, dass Marktfaktoren können auch als lokale Antigen-präsentierende Zellen zu dienen. Zusätzlich MFs Funktion als wichtige Regulatoren der angeborenen und adaptiven Immunantwort, producing eine Vielzahl von Cytokinen und Wachstumsfaktoren. 5
Bei gesunden Menschen werden MFs Zellen vermutlich aus mesenchymalen Stammzellen zu differenzieren und Express auf ihrer Zelloberfläche, die mesenchymalen Marker CD90 3, 5. Diese Zellen sind auch positiv für Vimentin, aber negativ für Epithelzellen und hämatopoetischen Zellmarker EpCAM und CD45 , beziehungsweise. Myofibroblasten werden vorgeschlagen, um eine aktivierte Form von Fibroblasten und kann aus nicht-aktivierten Fibroblasten durch die Expression von α-SMA 5 unterscheiden.
Im Laufe des letzten Jahrzehnts mehrere Ansätze zur Isolierung von Myofibroblasten aus menschlichen Darmschleimhaut wurden veröffentlicht, meist auf der ursprünglich von Mahida et al. 5-8 beschrieben berechnet. Während einzelne Studien berichten Isolierungsverfahren aus verschiedenen Darmschleimhaut, kein universelles Protokoll für die Isolierung von Marktfaktoren aus mehreren Bereichen des GI-Trakts (dh Magen, kleine und large Darmschleimhaut) ist erschienen. Die hierin enthaltenen Protokoll wurde getestet und für alle drei Gewebetyp oben erwähnt erfolgreich eingesetzt. . Darüber hinaus wurden Verfahren zur Isolierung von Marktfaktoren aus gefrorenen GI-Schleimhaut nicht berichtet worden.
Wir stellen hier ein optimiertes Verfahren, die auf enzymatische Verdauung basiert, und gleichzeitig ermöglicht die Isolierung menschlicher Darmschleimhaut MFs für Kultur und Durchflusszytometrie-Analyse in frisch gespalten, einzelne Zelle, Schleimhaut Zubereitungen. Diese Technik zuverlässig liefert Primärkulturen mit einem MF-Phänotyp. Darüber hinaus können die gleichen Methoden verwendet, um die MFS an der gefrorenen Proben von Magen und Dünndarm-Gewebe zu isolieren, als auch werden. Isolierung von Myofibroblasten aus frischem Gewebe GI zuvor beschrieben wurde; jedoch die Verwendung von gefrorenen Proben stellt viele Vorteile. Das heißt, die Forscher würden von einer beliebigen Anzahl von Mitarbeitern auf der ganzen Welt, die die Capabi müssen in der Lage, sammeln und speichern Gewebenkeit auf den eingefrorenen Gewebeproben zu versenden. Darüber hinaus können die Forscher die Sammlung von gebrauchten Gewebe aus dem Operationssaal und / oder Endoskopie-Suite und sofortige Bearbeitung des Gewebes für die Isolierung, um Konflikte mit ihren aktuellen Experimente Plan zu finden. Auch aufgrund der Unvorhersehbarkeit der Chirurgie, Gewebeentnahme kann sehr spät in den Tag kommen, was die Zeit für die Verarbeitung Gewebe links begrenzen. Einfrieren Gewebe für die spätere Verarbeitung werden diese Herausforderungen zu verbessern.
Schließlich sind diese Verfahren wurden erfolgreich bei der Isolierung von Kolon, Magen und Dünndarm Myofibroblasten bei Krankheitszuständen, wie beispielsweise Dickdarmkrebs und entzündlichen Darmerkrankungen eingesetzt.
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Protocol
Das Protokoll für den Erhalt verworfen menschlichem Gewebe von chirurgischen Patienten und die Einrichtung von Primärkulturen wurde von der University of Texas Medical Branch and University of New Mexico Institutional Review Boards genehmigt. Die allgemeinen Anforderungen an die Beschaffung menschlicher Gewebeproben ist unten beschrieben. Beachten Sie, dass seit dem Marktfaktoren können von gefrorenem Gewebe, Biobanken und kommerziellen Anbietern isoliert werden auch praktikable Möglichkeiten.
1. Besorgen Menschliches Gewebe
- Ein Protokoll zum menschlichen Dickdarmgewebe in die Ethikkommission für die Zulassung zu erhalten.
- Stellen Sie die Zusammenarbeit mit allgemeine Chirurgen und / oder kolorektalen Chirurgen, um menschliches Gewebe für die Forschung zu erhalten. Die Zusammenarbeit mit der Pathologie-Abteilung ist ebenfalls obligatorisch, da sie wird die Bestimmung der Gewebe, die nicht für die Diagnose erforderlich ist, und kann für die Forschung bezeichnet werden.
- Dabei muss der Pathologe die Gewebe aus der Neubildung bereitzustellen und dann Grossly normale Schleimhaut von mindestens 5 cm von dem Tumor. Ab sofort legen Sie die Proben in eiskaltem Waschmedien und auf Eis. Der Pathologe die Menge des Gewebes, die sicher für die Forschung gegeben werden kann, zu bestimmen. Die für die MF Isolierung benötigt minimale Gewebe ist 1,5 mm 2.
- Verwenden Sie die erhaltenen Gewebe entweder sofort, um die Primärkulturen oder gefrier Ort und bei -80 ° C für die zukünftige Trennung zu etablieren.
- Wenn das Einfrieren für spätere Trennung, schneiden das Gewebe in etwa 1-2 mm 2 Stück, legen Sie in eine Tieftemperatur-Schlauch mit 1 ml Gefriermedium (siehe unten), und bei -80 ° C. Hinweis: Unter Verwendung dieses Protokolls hat erfolgreiche Isolierung von Marktfaktoren aus Gewebe seit über 4 Jahren eingefroren wurde beobachtet.
2. Bereiten Reagenzien
- Für Kollagenase Lösung: Bereiten Sie 100 U / ml Collagenase I, II und IV in ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS) mit Ca 2+ / Mg 2+ (siehe Materialien Tabelle
- Bereiten Sie auf Wasserbasis DNase Stammlösung bei 10 mg / ml (3,55 UA / mg).
- Bereiten Wash Medien: (MEM: 89 ml, Antibiotikum-Antimykotikum, 100x: 1 ml; hitzeinaktiviertem FCS: 10 ml)
- Bereiten Fibroblasten-Wachstumsmedium: MEM: 500 ml Flasche; L-Glutamin (200 mM): 5 ml; MEM nicht-essentiellen Aminosäuren, 100x Lösung: 5 ml; Ciprofloxacin HCl (10 mg / ml): 570 & mgr; l; Antibiotikum-Antimykotikum, 100x-Lösung: 10 ml; Natriumpyruvat (100 mM): 5 ml; hitzeinaktiviertem FCS: 50 ml
- Bereiten Freeze-Medien: Fibroblasten-Wachstumsmedium (Reagenz 2.4) mit dem Zusatz von 10% Dimethylsulfoxid (DMSO), dann filtern-sterilize mit einem 0,22 um-Filter.
3. Enzymatisch Digest Menschliches Gewebe
- Wenn das Gewebe wurde in gefrier Medien, Ort Kryoröhrchen in warmen (~ 37 ° C) Wasser eingefroren, bis Gewebe und Medien wird aufgetaut.
- Für 4-5 von 2 mm 2 Gewebestücke, Wäsche Gewebe zweimal mit 10 ml HBSS ohne Ca 2+ / Mg 2+.
- Sobald Gewebe durch die Schwerkraft angesiedelt, vorsichtig den Überstand verwerfen, ohne Spinnen Probe.
- 10 ml Kollagenase-Lösung der Probe und gibt das Gewebe-Lösungsgemisch in einen sterilen, DNase / RNase-freies Röhrchen mit eingebauten Rotoren zur Proben Dissoziation. Verwenden Kollagenase an die extrazelluläre Matrix, die die basale Aspekt Epithelzellen umgibt und bildet den nicht-zellulären Fraktion der mukosalen Lamina propria dissoziieren.
- Dicht zu schließen Rohr und befestigen Sie den Kopf auf die Hülse des Dissociator (zB gentleMACS). Wenn das Labor nicht über die Zugang zu ter erwähnte Anlage, die Dauer jedes Verdauungsschritt, um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten, zu erhöhen.
- Führen Sie das Programm h_tumor_01, enthalten eine voreingestellte Profil mit der Maschine (Gesamtlaufzeit von 36 sec, mit intermittierender Impulse im Bereich von 1.000 - 4.000 min mit 268 Schuss pro Lauf).
- Nach Beendigung des Programms, nehmen Sie Rohr aus dem Dissociator.
- Inkubieren Probe für 45 min bei 37 ° C unter ständiger Rotation auf einem Schüttler bei 140 Umdrehungen pro Minute. Anmerkung: Für verschiedene Mengen von Gewebeproben, die Zeit kann der Verdauung proportional reduziert oder erhöht werden kann (dh, größere Mengen von Gewebe können zusätzliche Zeit erfordern).
- Befestigen Rohr Oberseite nach unten auf die Hülse des Dissociator.
- Wählen Sie und führen Sie das Programm h_tumor_02 (Gesamtlaufzeit von 37 sec, mit intermittierender Impulse im Bereich von 1.000 - 4.000 min mit 235 Schuss pro Lauf).
- Nach Beendigung des Programms, nehmen Sie Rohr aus dem Dissociator.
- In 50 ul DNase-Stammlösung. Verwenden DNAse zu distanzieren / entfernen abgestorbene Zellen und DNA-Fraktion von Zelltrümmern, die Verklumpung Zelle führt.
- Inkubieren Probe für 30 min bei 37 ° C unter ständiger Rotation auf einem Schüttler mit 60 UpM.
- Befestigen Rohr Oberseite nach unten auf die Hülse des Dissociator erneut.
- Wählen Sie und führen Sie das Programm h_tumor_03 (Gesamtlaufzeit von 37 sec, mit intermittierender Impulse im Bereich von 1.000 - 4.000 min mit 168 Schuss pro Lauf).
Hinweis: Wenn das Gewebe nicht vollständig verdaut, Zentrifuge bei 250 × g für 10 min bei 20 ° C, Überstand verwerfen, resuspendieren in 2 ml Zelldissoziationslösung und Inkubation bei RT für 10 min. - Übergeben Sie die Zellsuspension durch sterile 70 um Zellsieb.
- Zentrifuge Zellsuspension bei 250 × g für 10 min bei 20 ° C. Überstand wird abgesaugt komplett.
- Wash Zellpellet zweimal mit 25 ml HBSS ohne Ca 2+ / Mg 2+ und den Überstand verwerfen.
- Vor dem letzten warh, zählen Zellzahl unter Verwendung eines automatisierten Zellzählung System zur Verfügung im Labor oder manuell mit Zählkammer. Für MF Primärkultur Generation gehen zum Schritt 3.19.1, für die Analyse und Sortierung von Marktfaktoren mittels Durchflusszytometrie gehen für Schritt 3.19.2.
- Für die Isolierung und das Wachstum der reinen MF Kultur (Abbildung 1), den Überstand verwerfen von den letzten Zentrifugation resuspendieren Zellpellet in der entsprechenden Menge an Fibroblasten-Isolationsmedien benötigt, um den 4 x 10 6 Zellen Saatgut in 3 ml des Mediums pro Vertiefung in 6 gut, Zellkultur-behandelten Platten. Fahren Sie mit Schritt 3.20.
- Für die Analyse und Sortierung von Marktfaktoren mittels Durchflusszytometrie, legen Sie bis zu 2 x 10 6 in 2 ml Fibroblasten Isolationsmedien in 24-Well, Low-Bindungsplatte und Inkubation O / N bei 37 ° C mit 5% CO 2. Dies ist auf die Zelloberfläche Epitope, die durch die enzymatische Verfahren betroffen sein können, wiederherzustellen. Dann sammeln Zellsuspension und zählen gewonnenen Zellen und fahrenfür die Immunfärbung und Durchflusszytometrie-Analyse 8.
- Wachsen Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2. Ändern Medien alle 2 - 3 Tage, bis die Bildung von ~ 80% konfluent MF Monoschicht (1D-E).
- Passage-Zellen in T25-Kolben mit 6-Well-Platte in einem Verhältnis von 1: 1 und das Wachstum für ~ 10 bis 100% Konfluenz - 14 Tagen in Fibroblastenwachstumsmedium bis 80 zu erzielen.
- Erweitern Kultur durch Passagieren Zellen von T25 bis T75 Zellen in einem Verhältnis 1: 2. Sobald Zellen Konfluenz erreichen, verwenden Sie eine Flasche für die Analyse von isolierten MF Reinheit unter Verwendung von Durchflusszytometrie, wie zuvor 5 beschrieben. Einfrieren oder einen anderen Durchgang T75-Kolben von MF Kultur bei Verhältnis 1: 3.
Hinweis: Wenn mittels Durchflusszytometrie analysiert, wird erwartet, dass Darmschleimhäute stromal MF mesenchymalen Ursprungs bei Wachstum in Kultur werden folgenden Phänotyp: EpCAM-, CD31-, CD45-, Vimentin +, α-SMA +, CD90 +.
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Representative Results
Mit diesen enzymatischen Verdau Protokoll Hintergrund haben wir in der Lage gewesen, zu isolieren und zu wachsen MF Bevölkerung gut CD90 + Schleimhaut Stromazellen aus GI chirurgischen Proben und Biopsien (Abbildung 1). 5 nach dem Aussäen mononuklearen Zellsuspensionen in 6-Well-Platten (1A-B) - Sichtbare MF Kolonie Proliferation konnte am Tag 2 beobachtet werden. Die MF Primärkulturen zu erreichen ~ 50-70% Konfluenz für Tag 7 bis 11 (1C-D).
Abbildung 1. Primäre Myofibroblasten (MFS) Isoliert von Tiefkühl Magen-Darm-Gewebe. Ein 20-facher Vergrößerung der menschlichen MFs isoliert aus gefrorenen Probe der menschlichen Darmschleimhaut. (A) 2. Tag Adherent Cluster von Stromazellen sind vorhanden. (B) Tage 4. Die charakteristischen spindel oder stellate-Zellmorphologie wurde entwickelt und ist leicht ersichtlich. Die Dichte der Fibroblasten weiterhin auf (C) Tag 7 und (D) 10. Tag (E) zu erhöhen By Day 14, gibt es eine komplett konfluenter Monolayer von Marktfaktoren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Es gibt eine leichte Abnahme der Lebensfähigkeit von Schleimhauteinzelzellpräparation auf das Einfrieren von chirurgischen Proben (~ 10%, Tabelle 1). Jedoch mit dem Gefrierpunkt, gibt es auch eine Abnahme der bakteriellen / Pilzkontamination des Gewebes beobachtet, und folglich eine Erhöhung der Effizienz des MF Kulturgeneration.
| Quelle der GI Mucosal Myofibroblasten | Lebensfähigkeit * Schleimhauteinzelzellsuspension Vorbereitung (n = 11) </ td> | MF Isolation Efficiency (n = 11) |
| Frisch | 88,32 ± 2,369 | 8 von 11 (82%) |
| Gefroren | 78,64 ± 4,174 | 11 von 11 (100%) |
| * Die Lebensfähigkeit wie von automatisierten Zellzählers nach 0,4% Trypanblau-Lösung Färbung bestimmt. | ||
Tabelle 1 Die Lebensfähigkeit und Effizienz der Myofibroblasten Rettung. Frische vs. Gefrorene Gewebe.
Die Reinheit des erzeugten MF Kultur wurde untersucht, nachdem die Zellen wurden mindestens zwei Passagen vermehrt, um keine Kontamination durch andere Schleimhautzellen zu gewährleisten. Verwendung der konfokalen Mikroskopie wurde gezeigt, daß MFs waren positiv für die Marker der mesenchymalen Zelllinie CD90 und Vimentin und ALSo α-SMA, ein Marker des differenzierten mesenchymalen Zellen (Abbildung 2).
Abbildung 2. Isolierte Zellen Fibroblasten Shape and Express MF Markers. Immunfärbung von isolierten MF Monoschicht, mindestens zweimal in Kulturagiert wurden mit 1% Paraformaldehyd fixiert, immungefärbt und durch konfokale Mikroskopie analysiert, wie zuvor 9 beschriebene. Isolierte Zellen exprimiert wird eine Markierung von Myofibroblasten, a-SMA (in grün, wie von murinen mAb Klon 1A4 erkannt) und mesenchymalen Marker: Vimentin (rot, wie von mAb, Klon RV202 erkannt) und CD90 (in blau, wie festgestellt Maus-mAb, Klon 5E10). In der fusionierten Bild, orange / gelb Zellen stellen Co-Lokalisation von a-SMA und Vimentin; lila stellt Co-Lokalisation von Vimentin und CD90. Rechtsmittelgründe e Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Diese Daten wurden mittels Durchflusszytometrie-Analyse (Abbildung 3) bestätigt. Wie bereits berichtet, waren normal MFs von GI-Schleimhaut isoliert auch negativ für hämatopoetische Trägern CD45 und CD31 sowie epithelialen Marker, EpCAM 3, 5, 9.
Abbildung 3 Phänotypische Charakterisierung primärer Myofibroblasten (MF) Kulturen. Die Studien wurden auf primären MFs aus Darmschleimhaut isoliert ausgeführt und agiert mindestens zwei Mal in der Kultur. Immunfärbung, gefolgt von Durchflusszytometrie-Analyse bestätigt, dass die isolierten Zellen haben MF Phänotyp einheitlich positiv für Vimentin, α-SMA und CD90. Geeigneten Isotyp-Kontrollen wurden in die Studie eingeschlossen.arge.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Während dieses Protokoll wurde für das Forschungsanwendung nur dann entwickelt, unter Berücksichtigung der wachsenden Bedeutung der kritischen Stromazellen als potentielle Krebsprognostische Biomarker und therapeutisches Ziel, die Fähigkeit, "funktional" Gewebeproben für eine spätere Verwendung gefrier bietet einen signifikanten Vorteil. Dies stellt einen einzigartigen Vorteil für die Erstellung von klinischen Biobanken, die dazu dient, die Entwicklung der personalisierten Medizin 10, 11 voran als zusätzliches Werkzeug dienen kann. Ähnlich wie Erkenntnisse zuvor für Fettgewebe gewonnene mesenchymale Stammzellen aus gefrorenen Stroma-Kreislauf-Fraktion isoliert berichtet, haben wir keine wesentlichen Änderungen in der Marker und proliferative / Immun / entzündliche Reaktionen und Stoffwechselaktivität der Marktfaktoren isoliert aus gefrorenen Schleimhautproben nicht beobachtet. 12 Allerdings wissen wir nicht ausschließen, dass einige der nicht-geprüften Antworten wie extrazelluläre Marker Abscheidung etc. können variieren . So wird in den Fällen, in der Zusammenarbeit mit unbekannten / uneinPort-Ereignisse können die Ermittler die Einrichtung eines Vergleichsexperiment, in dem die besondere Funktion getestet Seite-an-Seite werden in MFs getrennt von Gefrier- und Frischgewebe des gleichen Individuums.
Die Mehrzahl der Verfahren zur myofibroblast Isolierungsverfahren werden entweder auf die Verwendung von mechanischen Zerkleinern des Gewebes in Verbindung mit der Behandlung entweder mit Chelatbildnern [Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), DL-Dithiothreitol (DTT)] oder kollagenolytischen und proteolytische Enzyme 13-14 basierend . Es wurde bereits berichtet, dass die Erzeugung von MF aus Magen, war Dünn- und Dickdarms effizienter durch Verwendung der Auswuchs Verfahren zunächst durch Mahida et al, das am mechanischen Zerkleinerungs- und Anwendung der Chelatbildner 5, 6 basiert, beschrieben. Hier wird ein zusätzlicher enzymatischer Verfahren, das die Erzeugung von Primärkulturen von Marktfaktoren aus gefrorenen Gewebeproben ermöglicht wird berichtet. Während beide Methoden-Auswuchs und enzymatische Verdauung-sindbei der Isolierung von primären Myofibroblasten von Magen, Dünndarm und Dickdarmgewebe ebenso wirksam, gibt es noch Debatte in Wissenschaft, ob kultivierten Zellen bewahren ihre in vivo Phänotyp. Die Technik in diesem Manuskript berichtet ermöglicht nicht nur Generierung primärer MF Kultur, sondern erlaubt auch die ex vivo Analyse von verschiedenen Zellpopulationen in der gastrointestinalen Schleimhaut 15-17 dargestellt. Dies beinhaltet die Bestimmung ihrer relativen Häufigkeit mit dem Gewebe und den Markierungen sie ausdrücken, sondern auch für die Verwendung in funktionellen Assays (zB enzymatische Aktivität oder die Cytokin-Produktion). Relative Häufigkeit MFs innerhalb des Gewebes kann unter Verwendung von FACS durch Sortieren der Zellen basierend auf Markierungen MFS (nämlich EpCAM-, CD31-, CD45-, Vimentin +, α-SMA +, CD90 +) und Quantifizierung ihrer Anwesenheit einzigartig im Vergleich zu einem beurteilen Summe aller frisch isolierten Zellen oder, wenn nötig, indem Sie Vergleichsverhältnis mit einer deutlichen Zelltypen. Trotz der Wirksamkeitder lebensfähigen Zellisolierung, ist eine bemerkenswerte Einschränkung der diese und andere Protokolle, die auf enzymatische Verdauung, daß die proteolytische Aktivität des Enzyms verwendet werden kann, Zelloberflächenepitope verändern. Um dies zu überwinden, erlauben wir Zellen, die O / N, um zu gewinnen für Epitope zu werden, ähnlich wie ihre vorverdaut Zustand wieder zum Ausdruck gebracht.
Wir konnten MF Kultur aus gefrorenem Gewebe konsistent zu erzeugen mit einem minimalen Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen. Die Fähigkeit, diese Kulturen aus gefrorenen Probe wiederherstellen können die Forscher zu manipulieren und chirurgische und / oder endoskopische Gewebeproben während der Nacht oder außerhalb der regulären Arbeitsstunden erhalten besser zu bewahren. Darüber hinaus dient die Verringerung der Verlust der beschafften verwendbaren Gewebe aufgrund der bakteriellen und / oder pilzlichen Verunreinigungen während des Gefrierprozesses als zusätzlicher Vorteil. Nach der Isolierung sollten den Einsatz von Antibiotika, um nur die ersten 2 beschränkt werden - 3 Passagen, nach der Kultivierung fortgesetzt werden soll unter Verwendung von Standard Aseptic Technik und antimykotischen / anti-Mycoplasma Mittel-freien Medien. Der routinemäßige Einsatz dieser Mittel in Zellkultur hat sich gezeigt, zytotoxische Effekte, nämlich das Zellwachstum, Zelldegeneration und gelegentlich Tod 18 auszuüben.
Enzymatische Verdauung werden mehrere Zellen in der Lamina propria GI einschließlich vorliegenden Populationen ergeben: Immunzellen, Epithelzellen und Marktfaktoren. Nach dem ersten Durchgang, nur MFs verbleiben und ihre einzigartigen Phänotyp (Abbildung 1) sowie durch zellspezifische Gruppe von Markeranalyse (CD90, a-SMA und Vimentin positiv identifiziert werden, aber negativ für Epithelzellen und hämopoetische Marker) 3, 5, 9. Während es allgemein anerkannt ist, dass Myofibroblasten entstehen aus mesenchymalen Stammzellen in der normalen Wirt, bei Krankheitszuständen, wie chronischer Entzündung und Krebs, eine Subpopulation MFs wurde express Epithel- oder hämatopoetischen Marker 3 gezeigt. Diese Befunde wurden vorgeschlagen, um vielleicht seinein Ergebnis der epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) oder Rekrutierung von Fibrozyten von hämatopoetischen Abstammungslinie 3, 19 abgeleitet wird. Ferner sollte zusätzliche Vorsicht verwendet werden, wenn Zellen immunhistochemisch und mittels Durchflußzytometrie für die oben diskutierten Marker analysiert werden. Wir haben zwar nicht das Epitop Verlust Nachdem man die Zellen aus frisch verdaute Gewebe nicht haftende Platten inkubiert erholen O / N festgestellt, dass ein Problem sein, kann der Verlust von Epitopen bei der Verwendung von Trypsin oder andere proteolytische Enzym während der Ablösung auftritt Zellen von der Platte. So, um dieses Problem zu vermeiden, empfehlen wir Ihnen eines Zelldissoziationslösung mit Chelatbildnern wie EDTA zu verwenden, wenn haft MF Kulturen sind für die Immunfärbung gefolgt von Durchflusszytometrie-Analyse bestimmt. Nach einer Primärkultur von Myofibroblasten hergestellt ist, können die Zellen dann in Gefriermediums eingefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert werden. 15 - diese Zellen in einer Anordnung von in vitro-Experimenten bis etwa 14 verwendet werdenPassagen, nach welcher Zeit die Zellen altern und sollte verworfen werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM, 1x | Corning | MT-10-010-CV | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100x | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacin HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Accumax cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Cell Strainer (70 µm) | Corning | 352350 | |
| PE Mouse Anti-Human Vimentin | BD Biosciences | 562337 | Clone RV202 |
| FITC Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich | F3777 | Clone 1A4 |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 559869 | Clone 5E10 |
References
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