Abstract
Фибробласты / миофибробласты (МФС) были набирает все большее внимание на их роли в патогенезе и их вклад в обоих заживления ран и продвижения микросреды опухоли. В то время как в настоящее время существует много методов для выделения МП от желудочно-кишечных (GI) тканей, этот протокол вводит новый элемент изоляции этих стромальных клеток из замороженной ткани. Замораживание И. образцов тканей не только позволяет исследователю получить образцы из мира сотрудников, биобанках и коммерческих поставщиков, это также позволяет задержки обработки свежих образцов. Описанный протокол будет последовательно дают характерные веретенообразные клетки с фенотипом MF, которые выражают маркеры CD90, α-SMA и Виментин. Поскольку эти клетки получают из клинических образцов, использование первичных клеток также дает преимущество в тесном имитирующих МЖ от болезненных состояний, а именно рака и воспалительных заболеваний кишечника. Этот метод имеет пчелап утверждена в желудка, тонкой кишки, толстой и MF поколения основной культуры. Первичные культуры MF могут быть использованы в широкий спектр экспериментов в течение нескольких прохода и их чистота оценена как иммуногистохимии и проточной цитометрии анализа.
Introduction
Миофибробласты / фибробласты (МЖ) представляют собой обильные популяции клеток в желудочно-кишечном (GI) слизистой оболочки. Эти клетки стромы расположены непосредственно под эпителием и образуют взаимосвязанную сеть в собственной пластинке слизистой оболочки в кишечнике. МЖ не отвечает только за осаждения внеклеточного матрикса, а через паракринной регулирования могут влиять на транспорт электролита, реституции, и барьерную функцию прилегающей эпителия 1, 2. Кроме того, МЖ, как было показано, играют ключевую роль в воспалении и ткани реконструкции 3, 4. Миофибробласты являются важной частью микросреды опухоли, где они также известный как рак, связанный фибробластов, и способствовать росту опухолевых клеток и служить нишей для раковых стволовых клеток 3. Новые данные свидетельствуют о том, что МЖ может также служить в качестве местных антиген-представляющих клеток. Кроме того, функция МЖ, как важные регуляторы врожденной и адаптивной иммунных реакций, произвоCing различные цитокины и факторы роста 5.
У здоровых лиц, MFS клетки, как полагают, отличить от мезенхимальных стволовых клеток и выразить их клеточной поверхности, мезенхимной маркера, CD90 3, 5. Эти клетки также положительно для виментина, но отрицательный для эпителиальных и гемопоэтических маркера клеток, ЕрСАМ и CD45 соответственно. Миофибробласты предложены, чтобы быть активированной формы фибробластов и можно отличить от неактивированных фибробластов по экспрессии a-SMA 5.
За последние десять лет, множественные подходы к изоляции миофибробластов из слизистой оболочки толстой кишки человека были опубликованы в основном-на основе метода, впервые описанной Mahida др. 5-8. Хотя отдельные исследования сообщают процедуры изоляции из различных слизистой кишечника, не универсальный протокол для изоляции МЖ из нескольких областей желудочно-кишечного тракта (например, желудка, малого и лАРГЕ слизистая оболочка кишечника) была опубликована. Протокол, представленные здесь, была испытана и успешно использован для всех трех типов ткани, упомянутых выше. , Кроме того, не сообщалось процедуры выделения МЖ из замороженных слизистой оболочки ЖКТ.
Здесь мы представляем оптимизированную метод, который основан на ферментативной пищеварения и одновременно позволяет для выделения человеческого слизистой кишечника МЖ для культуры и проточной цитометрии анализа свежих переваривается, одноклеточных, слизистых препаратов. Этот метод дает надежно первичных культур с фенотипа MF. Кроме того, одни и те же методы могут быть использованы для выделения МЖ из замороженных образцов желудочного и тонкого кишечника, а также тканей. Выделение миофибробластами из свежих GI ткани было описано ранее; Однако, использование замороженные образцы представляет множество преимуществ. А именно, исследователи смогут собирать и хранить ткани из любого количества сотрудников по всему миру, которые имеют capabiмируемости грузить образцы замороженной ткани. Кроме того, исследователи могут найти коллекцию отбрасываются ткани от операционной и / или эндоскопического кабинета и немедленной обработки ткани для изоляции к конфликту с их нынешним графиком экспериментов. Кроме того, из-за непредсказуемого характера операции, закупки ткани может произойти в самом конце дня, который будет ограничивать время, оставшееся для обработки ткани. Замораживание ткани для последующей обработки будет улучшить эти проблемы.
Наконец, эти методы были успешно использованы в изоляции толстой, желудка и тонкого кишечника миофибробластами в болезненных состояний, таких как карциномы и колоректального воспалительных заболеваний кишечника.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол для получения отбрасываются человеческую ткань из хирургических больных и создание первичных культурах был утвержден в университете Техаса медицинского отделения и Университет Нью-Мексико институциональный обзор советов. Общие требования к закупке образцов тканей человека описано ниже. Отметим, что поскольку МЖ могут быть выделены из замороженной ткани, биобанках и коммерческих поставщиков также жизнеспособные варианты.
1. Получить тканей человека
- Разместить протокол для получения человеческого ткани толстой кишки в институциональной наблюдательный совет для утверждения.
- Установление сотрудничества с общими хирургами и / или колоректальных хирургов, чтобы получить человеческую ткань для исследования. Сотрудничество с отделом патологии также является обязательным, как они будут определении ткань, которая не требуется для диагностики и может быть предназначенный для исследования.
- Посоветуйте патологоанатом, чтобы обеспечить ткани из опухоли, а затем grosslу нормальной слизистой, по крайней мере в 5 см от опухоли. Сразу поместите образцы в ледяной мыть массовой информации и разместить на льду. Патологоанатом будет определять количество ткани, которые можно безопасно данной для исследований. Минимальный ткани требуется для изоляции MF 1,5 мм 2.
- Использование полученной ткани или непосредственно установить первичных культур или заморозить и место при -80 ° С для последующего выделения.
- Если замораживание для последующего выделения, вырезать ткань в приблизительно 1 - 2 мм 2 части, поместить в криогенной трубки с 1 мл замораживания средств массовой информации (см ниже), и хранить при температуре -80 ° C. Примечание: Используя этот протокол, успешное выделение МЖ из ткани, замороженные более 4 лет наблюдается.
2. Подготовка реагентов
- Для раствора коллагеназы: Подготовка 100 ед / мл коллагеназы I, II и IV в сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS) с Са 2+ / Mg 2+ (см табл материалы
- Готовят на водной основе ДНКазы маточного раствора с концентрацией 10 мг / мл (3,55 UA / мг).
- Подготовка Wash СМИ: (MEM: 89 мл, к антибиотикам противогрибковые, 100x: 1 мл; термоинактивировали ФТС: 10 мл)
- Подготовьте роста фибробластов СМИ: MEM: 500 мл бутылка; L-глутамин (200 мМ): 5 мл; MEM несущественные аминокислоты, 100x решение: 5 мл; ципрофлоксацин НСl (10 мг / мл): 570 мкл; Антибиотик-противогрибкового, 100x решение: 10 мл; пирувата натрия (100 мМ): 5 мл; инактивированной нагреванием ФТС: 50 мл
- Подготовка Заморозить СМИ: фибробластов СМИ роста (реагент 2.4) с добавлением 10% диметилсульфоксида (ДМСО), затем отфильтровать-СТЕРЕОilize с 0,22 мкм фильтр.
3. Ферментативно Дайджест тканей человека
- Если ткань была заморожена в сублимационной СМИ, место криопробирку в теплой (~ 37 ° C) водой до ткани и СМИ не оттаивают.
- Для 4 - 5 2 мм 2 штук ткани, мыть ткани в два раза с 10 мл HBSS без Ca 2+ / Mg 2+.
- После того, как ткань урегулирован тяжести, тщательно отбросить супернатант, не спиннинг образца.
- Добавить 10 мл раствора коллагеназы в пробе и переносят смесь ткани раствора в стерильной ДНКазы / РНКазы трубки со встроенным роторов для образца диссоциации. Использование коллагеназы отделить внеклеточный матрикс, который окружает базальную сторону эпителиальных клеток и образует непористые фракцию слизистой собственной пластинки.
- Плотно закрыть трубу и прикрепите его с ног на голову на рукав диссоциатора (например, GentleMACs). Если лаборатория не имеет доступа к тон вышеупомянутого оборудования, увеличить время каждого шага пищеварения, чтобы получить сопоставимые результаты.
- Запустите h_tumor_01 программы, предварительно настроенного профиля в комплекте с машиной (общей продолжительностью 36 сек, с прерывистыми импульсами в диапазоне от 1000 - 4000 оборотов в минуту, с 268 выстрелов в перспективе).
- После окончания программы, отсоедините трубку от диссоциации.
- Инкубируйте образца в течение 45 мин при 37 ° С при непрерывном вращении на шейкере при 140 оборотах в минуту. Примечание: различные количества образцов ткани, время переваривания может быть пропорционально уменьшена или увеличена (т.е. большее количество ткани могут потребовать дополнительного времени).
- Прикрепите трубку с ног на голову на рукав диссоциатора.
- Выбрать и запустить h_tumor_02 программы (общая продолжительность 37 сек, с прерывистыми импульсами, начиная с 1000 - 4000 оборотов в минуту, 235 выстрелов в перспективе).
- После окончания программы, отсоедините трубку от диссоциации.
- Добавьте 50 мкл ДНКазы маточного раствора, Используйте ДНКазу отделить / удалить мертвые клетки и ДНК фракции клеточного мусора, что приводит к клеточной слипания.
- Инкубируйте образца в течение 30 мин при 37 ° С при непрерывном вращении на шейкере при 60 оборотах в минуту.
- Прикрепите трубку с ног на голову на рукав диссоциатора снова.
- Выбрать и запустить h_tumor_03 программы (общая продолжительность 37 сек, с прерывистыми импульсами, начиная с 1000 - 4000 оборотов в минуту, 168 выстрелов в перспективе).
Примечание: Если ткань не полностью переварили, центрифуге при 250 × г в течение 10 мин при 20 ° С, отбросить супернатант, ресуспендируют в 2 мл раствора для диссоциации клеток и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин. - Передайте клеточной суспензии через сито стерильной 70 мкм клеток.
- Центрифуга клеточной суспензии при 250 х г в течение 10 мин при 20 ° С. Аспирируйте супернатанту полностью.
- Промыть осадок клеток дважды 25 мл HBSS без Ca 2+ / Mg 2+ и отбросить супернатант.
- До последнего былоч, рассчитывать количество клеток с использованием автоматизированной системы подсчета клеток, доступные в лаборатории или вручную с помощью гемоцитометра. Для MF поколения первичной культуры проводили в течение шага 3.19.1, для анализа или сортировки МЖ с помощью проточной цитометрии проводили в течение шага 3.19.2.
- Для выделения и роста чистого MF культуры (рис 1), отбросить супернатант от последнего центрифугирования, ресуспендируют осадок клеток в соответствующем количестве изоляции фибробластов сред, необходимых для семян до 4 × 10 6 клеток в 3 мл среды на лунку в 6 хорошо, культуры клеток, обработанные пластины. Перейдите к шагу 3.20.
- Для анализа или сортировки МЖ с помощью проточной цитометрии, разместить до 2 х 10 6 в 2 мл изоляции фибробластов СМИ в 24 хорошо, с низким уровнем связывания пластины и инкубировать O / N при 37 ° С с 5% СО 2. Это восстановление клеточной поверхности эпитопы, которые могут быть затронуты ферментативной процедуры. Затем соберите клеточной суспензии и рассчитывать восстановленные клетки и приступитьдля иммуноокрашивания и проточной цитометрии анализа 8.
- Рост клеток при 37 ° С с 5% СО 2. Измените СМИ каждые 2 - 3 дня до образования ~ 80% сливной MF монослоя (рис 1D-E).
- Прохождение клетки в колбы Т25 с с 6-луночного планшета в соотношении 1: 1 и расти ~ 10 - 14 дней в ростовой среде фибробластов для достижения 80 - 100% слияния.
- Expand культуру пересева клеток из T25, чтобы T75 клеток в соотношении 1: 2. После достижения слияния клетки, используют один сосуд для анализа изолированной MF чистоты с помощью с помощью проточной цитометрии, как описано ранее 5. Замораживание или проход другой T75 колбу MF культуры в соотношении 1: 3.
Примечание: При анализе с помощью проточной цитометрии, как ожидается, слизистой ЖКТ стромальных МП мезенхимального происхождения при выращивании в культуре будет иметь следующий фенотип: EpCAM-, CD31-, CD45-, виментин +, a-SMA +, CD90 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя этот протокол ферментативной пищеварение, мы последовательно удалось изолировать и вырастить MF население кишечника CD90 + слизистой стромальных клеток из GI хирургических образцов и биопсии (Рисунок 1). Видимый MF колонии распространение можно было наблюдать на 2 день - 5 после посева одноядерные клеточные суспензии в 6-луночные планшеты (1А-В). Основными культурами MF достигать ~ 50 - 70% слияния на 7 день - 11 (рис 1С-D).
Рисунок 1. Основные Миофибробласты (MFS), выделенных из тканей Замороженные желудочно-кишечного тракта. 20-кратным увеличением человеческого МЖ изолированы от замороженных образца слизистой оболочки толстой кишки человека. (А) День 2. Адгезивные кластеры стромальных клеток присутствуют. (B), Дни 4. Характеристика spindle- или stellate-Морфология клеток разработала и очевидны. Плотность фибробластов продолжать расти на (С) День 7 и (D) День 10. (Е) 14 день, есть полностью сливающиеся монослой МЖ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Существует незначительное снижение жизнеспособности слизистой подготовки одного сотового на замораживание хирургических образцов (~ 10%, таблица 1). Тем не менее, с точки замерзания, существует также снижение бактериальной контаминации / грибковой ткани наблюдали и, следовательно, увеличение эффективности генерации культуры MF.
| Источник GI слизистой Миофибробласты | Жизнеспособность * слизистой Одноместный клеточной суспензии препарата (N = 11) </ TD> | MF Выделение Эффективность (п = 11) |
| Свежий | 88.32 ± 2,369 | 8 из 11 (82%) |
| Замороженные | 78.64 ± 4.174 | 11 из 11 (100%) |
| * Жизнеспособность, как определено с помощью автоматизированной счетчик клеток после 0.4% трипанового синий раствор окрашивания. | ||
Таблица 1. Жизнеспособность и эффективность миофибробластов Recovery. Свежий против замороженных тканей.
Чистота генерируемого MF культуры анализировали через клетки распространяются по крайней мере, в течение двух проходов, для того, чтобы убедиться в отсутствии загрязнения другими клетками слизистой. Использование конфокальной микроскопии, было показано, что МЖ были положительными для маркера мезенхимных клеточных клонов CD90 и виментина и ALSO α-SMA, маркер дифференцированных клеток мезенхимы (рисунок 2).
Фигура 2. Изолированные клетки имеют фибробластов Форма и выразить MF Маркеры. Иммунное окрашивание изолированной MF монослоя, пассируют, по крайней мере два раза в культуре фиксировали 1% параформальдегидом, иммунологически и анализировали с помощью конфокальной микроскопии, как описано выше 9. Изолированные клетки выразил маркер миофибробластов, а-SMA (зеленым, а обнаружены мышиного МКА клона 1A4), и мезенхимальных маркеров: виментин (в красном, а обнаружены МКА, клон RV202) и CD90 (в синем, а обнаружены мышиные мАт, клон 5E10). В объединенном изображении, оранжевый / желтый клетки представляют со-локализацию-SMA и виментина; фиолетовый представляет совместной локализации виментина и CD90. челобитной E Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенный вариант этого рисунка.
Эти данные были подтверждены проточной цитометрии (рис 3). Как сообщалось ранее, нормальные МЖ, выделенные из слизистой ЖКТ также были отрицательными для лиц, принимающих гемопоэтические CD45 и CD31, а также эпителиальных маркеров, ЕрСАМ 3, 5, 9.
Рисунок 3. Характеристика Фенотипическая первичной миофибробластов (MF) культур. Исследования проводились на первичных МЖ, выделенных из слизистой оболочки толстой кишки и пассировать, по крайней мере два времени в культуре. Иммуноокрашивание, а затем проточной цитометрии, подтвердили, что Выделенные клетки имеют фенотип MF равномерно положительный результат на виментина, α-SMA и CD90. Соответствующие контроли были изотипов, включенных в исследование.arge.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя этот протокол был разработан для исследования применения только в свете растущей критическую важность стромальных клеток в качестве потенциального рака прогностических биомаркеров и терапевтической мишени, способность заморозить "функциональные" biospecimens для последующего использования предлагает значительное преимущество. Это представляет собой уникальное преимущество для создания клинической biorepository, которые могут служить в качестве дополнительных инструментов служит для продвижения развития персонализированной медицины 10, 11. Подобно результатам, ранее сообщалось для жировой ткани мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из замороженного стромы сосудистой фракции, мы сделали не наблюдается каких-либо существенных изменений в маркеров и пролиферативных / иммунных воспалительных реакций / и метаболическая активность МП изолированных из замороженных образцов слизистой. 12 Тем не менее, мы не исключаем, что некоторые из не-тестирование ответов, таких как внеклеточным отложением маркера, и т.д. могут отличаться , Таким образом, в тех случаях, работы с неизвестным / unreпортирована события, следователи могут настроить сравнения эксперимент, в котором конкретная функция будет проверена бок о бок в МЖ изолированы от замороженных и свежих ткани того же индивидуума.
Большинство методов миофибробластного методов выделения основаны либо на использовании механической измельчения ткани в сочетании с обработкой либо с хелатирующими агентами [этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), DL-дитиотреитола (ДТТ)] или коллагенолитические и протеолитические ферменты 13-14 , Как сообщалось ранее, что генерация MF из желудка, тонкой и толстой кишки была эффективной при использовании метода нарост первоначально описанный Mahida др который основан на механической измельчения и применения хелатирующих агентов 5, 6. Здесь дополнительный ферментативная Метод, который позволяет генерировать первичных культурах МФС из образцов замороженной ткани сообщается. В то время как оба метода-продукт и ферментативного пищеварения являются-одинаково эффективными в изоляции первичных миофибробластов из желудка, тонкого кишечника, ободочной и ткани, там до сих пор спорят в научном сообществе от того культивируемые клетки сохраняют фенотип их в естественных условиях. Техника сообщили в этой рукописи позволяет не только поколения первичной культуре MF, но также позволяет экс естественных условиях анализ различных клеточных популяций, представленных в слизистой ЖКТ 15-17. Это включает в себя определение их относительного изобилия с тканью и маркеров, которые они выражают, но и для использования в функциональных анализов (например, ферментативной активности или продукции цитокинов). Относительная численность МЖ в ткани может быть оценена с помощью FACS путем сортировки элементов на основе маркеров, характерных только для МЖ (а именно, EpCAM-, CD31-, CD45-, виментина +, альфа-SMA +, CD90 +) и количественного их присутствие, когда по сравнению с сумма всех свежевыделенные клетки или, в случае необходимости, делая сравнительный соотношение с различными типами клеток. Несмотря на эффективностьизоляции жизнеспособных клеток, примечательным ограничение этой и других протоколов на основании ферментативного расщепления, что протеолитической активности фермента, используемого может изменить поверхностные клеточные эпитопы. Чтобы преодолеть это, мы допускаем клетки восстановить O / N для того, чтобы эпитопы, которые будут повторно выражена аналогично их легкоусвояемым состоянии.
Мы были в состоянии последовательно генерировать MF культуру от замороженной ткани с минимальной потерей жизнеспособности клеток. Способность к восстановлению этих культур из замороженных образцов позволяет исследователям, чтобы манипулировать и лучше сохранить хирургических и / или эндоскопических образцы тканей, полученные в течение ночи или из регулярных рабочих часов. Кроме того, уменьшение потери закупленного, используемой ткани вследствие бактериальной и / или грибковой загрязнений в процессе замораживания служит дополнительным преимуществом. После изоляции, применение антибиотиков должно ограничиваться только первые 2 - 3 проходов, после чего культивирование следует продолжать с использованием стандартного aseptiТехника с и анти-грибковые / анти-микоплазмы агент свободных СМИ. Регулярное использование этих препаратов в культуре клеток было показано, оказывают цитотоксические эффекты, а именно роста клеток, клеточного вырождения, а в отдельных случаях, смерти 18.
Переваривание ферментом даст несколько клеточных популяций, присутствующих в ЖКТ собственной пластинки в том числе: иммунных клеток, эпителиальных клеток, и МЖ. После первого прохода, только МЖ останется и могут быть идентифицированы по их уникальному фенотипа (рисунок 1), а также через клеточно-специфической панели маркера анализа (CD90, а-SMA, и виментина положительной, но отрицательной в эпителиальных и гемопоэтических маркеры) 3, 5, 9. В то время как это широко признается, что миофибробласты возникают из мезенхимальных стволовых клеток в нормальном хозяина, в болезненных состояний, таких как хроническая воспаления и рака, субпопуляции МЖ было показано экспресс эпителиальные или гемопоэтических маркеров 3. Эти данные были предложены бы бытьрезультатом эпителиальных мезенхимальных перехода (EMT) или набора фиброцитов, полученных из гемопоэтических линии 3, 19. Кроме того, дополнительная осторожность следует использовать, если клетки иммунологически и проанализированы с помощью проточной цитометрии для маркеров, описанных выше. В то время как мы не нашли потери эпитоп быть проблемой после позволяя клеткам восстановиться O / N из свежего переваренной ткани инкубируют в неадгезивных пластин, потеря эпитопы могут происходит при использовании трипсина или любой другой протеолитический фермент во отряда Клетки из пластины. Таким образом, чтобы избежать этой проблемы, мы рекомендуем использовать ячейки диссоциации раствора с хелатных агентов, таких как ЭДТА, когда прилипшие культуры MF предназначены для иммуноокрашивания последующим проточной цитометрии. После первичной культуры миофибробластами установлено, что клетки могут быть заморожены в морозильных сред и хранили в жидком азоте. Эти клетки не могут быть использованы в массиве экспериментов в пробирке до приблизительно 14 - 15проходы, после чего клетки стареют и должны быть отброшены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM, 1x | Corning | MT-10-010-CV | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100x | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacin HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Accumax cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Cell Strainer (70 µm) | Corning | 352350 | |
| PE Mouse Anti-Human Vimentin | BD Biosciences | 562337 | Clone RV202 |
| FITC Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich | F3777 | Clone 1A4 |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 559869 | Clone 5E10 |
References
- Yamaguchi, H., et al. Stromal Fibroblasts Mediate Extracellular Matrix Remodeling and Invasion of Scirrhous Gastric Carcinoma Cells. PLoS ONE. 9, e85485 (2014).
- Mullan, N., Hughes, K. R., Mahida, Y. R. Primary Human Colonic Myofibroblasts Are Resistant to Clostridium difficile Toxin A-Induced, but Not Toxin B-Induced, Cell Death. Infect Immun. 79, 1623-1630 (2011).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal Cells of the Intestinal Lamina Propria. Annu Rev Physiol. Annu Rev Physiol . 73, 213-237 (2011).
- Latella, G., Sferra, R., Speca, S., Vetuschi, A., Gaudio, E. Can we prevent, reduce or reverse intestinal fibrosis in IBD? Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17, 1283-1304 (2013).
- Saada, J. I., et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Mahida, Y. R., et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am J Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).
- Roncoroni, L., et al. Isolation and culture of fibroblasts from endoscopic duodenal biopsies of celiac patients. J Transl Med. 7 (40), (2009).
- Pinchuk, I. V., et al. Stromal Cells Induce Th17 during Helicobacter pylori Infection and in the Gastric Tumor Microenvironment. PLoS ONE. 8, e53798 (2013).
- Pinchuk, I. V., et al. Monocyte chemoattractant protein-1 production by intestinal myofibroblasts in response to staphylococcal enterotoxin a: relevance to staphylococcal enterotoxigenic disease. J. Immunol. 178, 8097-8106 (2007).
- Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Sem Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
- Valcz, G., Sipos, F., Tulassay, Z., Molnar, B., Yagi, Y. Importance of carcinoma-associated fibroblast-derived proteins in clinical oncology. J. Clin. Pathol. 67, 1026-1031 (2014).
- Minonzio, G., et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69, 211-216 (2014).
- Gargus, M., Niu, C., Shaker, A. Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus. J. Vis. Exp. (95), e52215 (2015).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. J. Vis. Exp. (80), e50611 (2013).
- Schiller, J. H., Bittner, G. Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an α5/β1-Integrin-Fibronectin Interaction. Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).
- Augello, A., Kurth, T. B., De Bari, C. Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches. Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).
- Meller, D., Pires, R. T. F., Tseng, S. C. G. Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures. Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).
- Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., Beswick, E. J. Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers. PLoS ONE. 9, e98656 (2014).
