Abstract
Fibroblasts / myofibroblasts (MFS) כבר צובר תשומת לב הולכת וגובר לתפקידם בפתוגנזה ותרומתם לשני ריפוי הפצע והקידום של מייקרו-הסביבה של הגידול. אמנם יש כיום טכניקות רבות לבידוד של MFS מרקמות של מערכת העיכול (GI), פרוטוקול זה מציג אלמנט רומן של בידוד של תאי סטרומה אלה מהרקמה קפוא. הקפאת דגימות רקמה במערכת העיכול לא רק מאפשרת לחוקר לרכוש דגימות ממשתפי פעולה ברחבי העולם, biobanks, וספקים מסחריים, זה גם מאפשר עיבוד המאוחר של דגימות טריות. הפרוטוקול המתואר באופן עקבי יניב תאים דמויי כישור אופייניים עם פנוטיפ MF המבטא את הסמנים CD90, α-SMA וvimentin. כאשר התאים אלה נגזרים מדגימות מטופל, השימוש בתאים ראשוניים גם מקנים היתרון של MFS מחקה באופן הדוק ממדינות-כלומר מחלה סרטן ומחלות מעי דלקתיות. טכניקה זו יש דבורהn תוקף בקיבה, מעי דק, ודור התרבות העיקרית הגס MF. תרבויות MF עיקריות ניתן להשתמש במגוון רחב של ניסויים על פני מספר המעבר וטוהר שלהם הוערכו על ידי שני immunocytochemistry וcytometry זרימת הניתוח.
Introduction
Myofibroblasts / fibroblasts (MFS) מייצג אוכלוסיית שפע של תאים במערכת עיכול רירית (GI). תאי סטרומה אלה ממוקמים ממש מתחת האפיתל ויוצרים רשת ביניהם בתוך propria lamina הרירי במעיים. MFS הוא לא רק אחראי על התצהיר של מטריקס, אבל באמצעות רגולציה אוטוקריני עשויים להשפיע תחבורת אלקטרוליט, השבת, ותפקוד מחסום של האפיתל הסמוך 1, 2. יתר על כן, MFS הוכח לשחק תפקיד מפתח בדלקת ורקמה שיפוץ 3, 4. myofibroblasts הוא חלק קריטי של מייקרו-הסביבה של הגידול, שבו הם ידועים גם בשם fibroblasts הסרטן הקשורים, ולתרום לצמיחת התאים הסרטני ולשמש כנישה לתאי גזע סרטני 3. נתונים חדשים מצביעים על כך שMFS יכול גם לשמש תאי הצגת אנטיגן מקומיים. בנוסף, פונקצית MFS רגולטורים חשובים של תגובה חיסונית מולדת ובעלי כושר הסתגלות, producing מגוון של ציטוקינים וגורמי גדילה 5.
באנשים בריאים, הם האמינו תאי MFS להבדיל מתאי גזע mesenchymal ולהביע על פני השטח שלהם התא, סמן mesenchymal, 3 CD90, 5. תאים אלה הם גם חיוביים עבור vimentin, אבל שלילי לאפיתל וסמן תא דם, EpCAM וCD45 , בהתאמה. Myofibroblasts הם הציעו להיות צורה פעילה של fibroblasts וניתן להבחין בין fibroblasts מופעל לא על ידי הביטוי של α-SMA 5.
במהלך העשור האחרון, גישות רבות לבידוד של myofibroblasts מרירית מעי הגס אנושית פורסמו-מבוססת בעיקר על השיטה המתוארת במקור על ידי et al Mahida. 5-8. בעוד שמחקרים בודדים לדווח נהלי בידוד מרירית מעי שונים, אין פרוטוקול אוניוורסלי לבידוד של MFS מאזורים מרובים של מערכת העיכול (כלומר, קיבה, קטן וlרירית מעי arge) כבר פורסמה. הפרוטוקול שהוצג במסמך זה נבדק ומשמש בהצלחה לכל שלושת הסוג של רקמה שהוזכר לעיל. . יתר על כן, נהלים לבידוד MFS מרירית מערכת העיכול קפוא לא דווחו.
כאן, אנו מציגים שיטה מותאמת, המבוססת על עיכול אנזימטי, ובמקביל מאפשר לבידודה של רירית מעי אדם MFS לתרבות וcytometry זרימת הניתוח בתא בודד, הכנות טריות מתעכלים, רירית. טכניקה זו באופן מהימן מניבה תרבויות עיקריות עם פנוטיפ MF. יתר על כן, ניתן להשתמש באותן השיטות כדי לבודד MFS מדגימות קפואות של רקמות מעי קיבה וקטנות גם כן. בידוד של myofibroblasts מרקמת GI טרי כבר תואר לעיל; עם זאת, השימוש בדגימות קפואות מציג יתרונות רבים. כלומר, חוקרים יוכלו לאסוף ורקמות חנות מכל מספר של משתפי פעולה ברחבי העולם שיש להם capability ספינה דגימות רקמה קפוא. יתר על כן, חוקרים עשויים למצוא את האוסף של רקמות שהושלכו מחדר הניתוח ו / או צמוד אנדוסקופיה והמיידי עיבוד הרקמות לבידוד לסכסוך עם לוח הזמנים של הניסויים הנוכחיים שלהם. כמו כן, בשל האופי הבלתי צפוי של ניתוח, רכש רקמה עלול להתרחש מאוחר מאוד ביום, אשר יגביל את הזמן שנותר לרקמת עיבוד. הקפאת רקמה לעיבוד מאוחר יותר יהיה לשפר באתגרים אלה.
לבסוף, שיטות אלה כבר נוצלו בהצלחה בבידוד של myofibroblasts מעי הגס, קיבה וקטנה במצבי מחלה כגון קרצינומה של המעי הגס ומחלות מעי דלקתיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול לקבלת רקמה אנושית שהושלכה מחולים כירורגי והקמת התרבויות העיקריות אושר על ידי אוניברסיטת טקסס רפואית הסניף ואוניברסיטת ניו מקסיקו לוחות סקירה מוסדית. הדרישות הכלליות לרכש של דגימות רקמה אנושיות מתוארת להלן. שים לב כי מאז MFS עשוי להיות מבודד מהרקמה קפוא, biobanks וספקים מסחריים גם אפשרויות קיימא.
1. השג רקמה אנושית
- הכנס פרוטוקול להשיג רקמת מעי גס אנושית למועצה לביקורת המוסדית לאישור.
- לבסס שיתופי פעולה עם מנתחים כלליים ו / או מנתחי מעי גס על מנת לקבל רקמות אנושיות למחקר. שיתוף פעולה עם המחלקה לפתולוגיה היא גם חובה כפי שהם יהיו קביעת הרקמה שאינו נדרשת לאבחון ויכול להיות מיועדת למחקר.
- לייעץ פתולוג לספק רקמה מneoplasm ולאחר מכן grosslרירית נורמלית y לפחות 5 סנטימטרים מהגידול. מייד למקם את הדגימות בתקשורת לשטוף קר כקרח ומניח על קרח. פתולוג יקבע את כמות הרקמה שיכול להינתן בבטחה למחקר. הרקמה המינימלית הנדרשת לבידוד MF היא 1.5 מ"מ 2.
- השתמש ברקמות שהושגו או מייד להקים תרבויות העיקריות או הקפאה והמקום ב -80 ° C עבור בידוד עתיד.
- אם הקפאה לבידוד מאוחר יותר, לחתוך את הרקמה לתוך כ 1 - 2 מ"מ 2 חתיכות, מקום לתוך צינור קירור עם 1 מיליליטר של תקשורת הקפאה (ראה להלן), וחנות ב -80 ° C. הערה: ניצול פרוטוקול זה, בידוד מוצלח של MFS מהרקמה קפואה במשך 4 שנים נצפה.
2. הכן ריאגנטים
- לפתרון Collagenase: הכן 100 U collagenase מיליליטר / I, II ו- IV בתמיסת מלח המאוזן של האנק (HBSS) עם Ca 2 + / 2 + Mg (ראה לוח חומרים
- הכן פתרון מניות DNase על בסיס מים ב 10 מיליליטר / מ"ג (3.55 UA / מ"ג).
- הכן תקשורת לשטוף: (ממ: 89 מיליליטר, אנטיביוטיקת antimycotic, 100x: 1 מיליליטר; FCS מומת חום: 10 מיליליטר)
- הכן פיברובלסטים צמיחת מדיה: ממ: 500 מיליליטר בקבוק; L- גלוטמין (200 מ"מ): 5 מיליליטר; חומצות ממ שאינה חיונית אמינו, 100x פתרון: 5 מיליליטר; ציפרופלוקסצין HCl (10 מ"ג / מיליליטר): 570 μl; אנטיביוטיקה antimycotic, פתרון 100x: 10 מיליליטר; פירובט נתרן (100 מ"מ): 5 מיליליטר; FCS מומת חום: 50 מיליליטר
- הכן תקשורת הקפאה: תקשורת צמיחת פיברובלסטים (מגיב 2.4) עם התוספת של 10% דימתיל sulfoxide (DMSO), ואז לסנן-sterilize עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
רקמות 3. אנזימים Digest אדם
- אם הרקמה הוקפאה בתקשורת הקפאה, cryovial מקום ב( ~ 37 מעלות צלזיוס) מים חמים עד רקמה ותקשורת מופשר.
- ל4 - 5 של 2 מ"מ 2 חתיכות של רקמות, רקמות לשטוף פעמיים עם 10 מיליליטר של HBSS ללא Ca 2 + / Mg 2 +.
- ברגע שהרקמה יש התיישבה על ידי כוח הכבידה, להשליך בזהירות supernatant מבלי מסתובב מדגם.
- להוסיף 10 מיליליטר של תמיסת collagenase לדוגמא ולהעביר את תערובת רקמות פתרון ל, צינור DNase / RNase ללא סטרילי עם המובנה הרוטורים לניתוק מדגם. השתמש collagenase לנתק את מטריקס המקיף את ההיבט הבסיסי של תאי האפיתל ומהווה את החלק בלתי תאי של propria lamina הרירי.
- חוזקה קרוב צינור ולצרף אותו במהופך על השרוול של Dissociator (למשל, gentleMACS). אם אין לו את המעבדה הגישה לtהוא האמור לעיל ציוד, להגדיל את הזמן של כל שלב עיכול כדי להשיג תוצאות דומות.
- הפעל את h_tumor_01 התכנית, פרופיל שנקבע מראש כלול עם המכשיר (משך הזמן הכולל של 36 שניות, עם קטניות לסירוגין החל 1,000 - 4,000 סל"ד, עם 268 כדורים לריצה).
- לאחר סיומה של התכנית, לנתק את הצינור מDissociator.
- דגירה לדוגמה עבור 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס מתחת סיבוב רציף על שייקר ב 140 סל"ד. הערה: כמויות משתנות של דגימות רקמה, זמן של עיכול יכול להיות מופחת או מוגבר באופן יחסי (כלומר, כמויות גדולות יותר של רקמה עשויות לדרוש זמן נוסף).
- צרף צינור הפוך על השרוול של Dissociator.
- בחר ולהפעיל את התכנית h_tumor_02 (משך זמן כולל של 37 שניות, עם קטניות לסירוגין החל 1,000 - 4,000 סל"ד, עם 235 כדורים לריצה).
- לאחר סיומה של התכנית, לנתק את הצינור מDissociator.
- הוסף 50 μl של פתרון מניות DNase. השתמש DNAse לנתק / להסיר תאים מתים וחלק DNA של פסולת הסלולר שמוביל לתא בצעדים כבד.
- דגירה מדגם למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס מתחת סיבוב רציף על שייקר ב 60 סל"ד.
- צרף צינור הפוך על השרוול של Dissociator שוב.
- בחר ולהפעיל את התכנית h_tumor_03 (משך זמן כולל של 37 שניות, עם קטניות לסירוגין החל 1,000 - 4,000 סל"ד, עם 168 כדורים לריצה).
הערה: אם הרקמה אינה מתעכל לגמרי, צנטריפוגות ב × גרם 250 עבור 10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס, להשליך supernatant, resuspend ב 2 מיליליטר של תמיסת תא דיסוציאציה ולדגור על RT במשך 10 דקות. - להעביר את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר סטרילי.
- השעיה תא צנטריפוגה ב g × 250 במשך 10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. לשאוב supernatant לחלוטין.
- גלולה לשטוף תא פעמיים עם 25 מיליליטר של HBSS ללא Ca 2 + / 2 + Mg וזורקים supernatant.
- לפני שעבר היהh, לספור את המספר הסלולרי באמצעות מערכת ספירת תאים אוטומטית זמינה במעבדה או באמצעות hemocytometer ידני. עבור דור התרבות העיקרית MF להמשיך לצעד 3.19.1, לניתוח או מיון של MFS באמצעות cytometry זרימה להמשיך לצעד 3.19.2.
- לבידוד וצמיחה של תרבות MF הטהורה (איור 1), לבטל את supernatant מצנטריפוגה האחרונה, תא גלולה גלול בכמות המתאימה של תקשורת בידוד פיברובלסטים צריך זרע עד 4 x 10 6 תאים ב 3 מיליליטר של התקשורת לכל גם ב 6 צלחות גם, שטופלה תרבית תאים. המשך לשלב 3.20.
- לניתוח או מיון של MFS באמצעות cytometry זרימה, למקם עד 2 x 10 6 ב 2 מיליליטר של תקשורת בידוד פיברובלסטים ב 24 גם, צלחת נמוכה מחייבת ודגירת O / N ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. זה הוא להחזיר את epitopes פני תא שעשוי להיות מושפע מההליך האנזימטית. לאחר מכן לאסוף השעיה תא ולספור תאים התאוששו ולהמשיךלimmunostaining וניתוח תזרים cytometry 8.
- לגדל תאים על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. לשנות תקשורת כל 2 - 3 ימים עד היווצרות ~ monolayer MF מחוברות 80% (איור 1D-E).
- תאי מעבר בצלוחיות T25 עם מ 6 צלחת גם ביחס 1: 1 ולגדול ל~ 10 - 14 ימים בתקשורת צמיחה פיברובלסטים להשיג 80 - confluency 100%.
- להרחיב תרבות על ידי passaging תאים מT25 לתאי T75 ביחס 1: 2. ברגע שתאים מגיעים confluency, להשתמש בקבוק אחד לניתוח של טוהר MF המבודד באמצעות ידי cytometry זרימה כפי שתואר לעיל 5. להקפיא או מעבר אחר בקבוק T75 תרבות MF ביחס 1: 3.
הערה: כאשר נותחו על ידי cytometry זרימה, צפוי כי במערכת העיכול רירית סטרומה MF ממוצא mesenchymal כאשר גדלו בתרבות יהיה פנוטיפ הבא: EpCAM-, CD31-, CD45-, + vimentin, α-SMA +, CD90 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השימוש בפרוטוקול עיכול אנזימטי זה, יש לנו כבר הצליח לבודד ולגדל תאי סטרומה בטן אוכלוסיית MF CD90 + רירית מדגימות כירורגית במערכת העיכול וביופסיות (איור 1) באופן עקבי. התפשטות המושבה MF גלויה יכולה להיבחן ביום 2 - 5 לאחר זריעת השעיות תא mononuclear לתוך 6 צלחות היטב (איור 1 א-ב). התרבויות העיקריות MF להגיע ~ 50 - מפגש 70% ביום 7 - 11 (איור 1 ג-ד).
איור 1. היסודי myofibroblasts (MFS) מבודדים מהרקמה קפואה במערכת העיכול. הגדלת 20X של MFS אדם מבודד מדגימה קפוא של רירית מעי אדם. יום (א ') 2. אשכולות חסיד של תאי סטרומה נמצאים. (ב) ימים 4. גפרורים האופייניים או stellate-מורפולוגיה של תאים פיתחה וגלוי לעין. הצפיפות של פיברובלסטים תמשיך להגדיל ביום 7 (ג) ו- (ד) יום 10. (ה) על ידי 14 יום, יש monolayer ומחוברות לגמרי של MFS. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
יש ירידה קלה ביכולת קיום של הכנת תא בודד ברירית על הקפאת דגימות כירורגית (~ 10%, טבלת 1). עם זאת, עם הקפאה, יש גם ירידה בזיהום פטרייתי / החיידקים של הרקמה נצפתה וכתוצאה מכך, עלייה ביעילות של דור תרבות MF.
| מקור של myofibroblasts הרירי במערכת העיכול | * כדאיות של הכנת הרירית יחידה השעיה תא (n = 11) </ Td> | יעילות בידוד MF (n = 11) |
| טָרִי | 88.32 ± 2.369 | 8 מתוך 11 (82%) |
| קָפוּא | 78.64 ± 4.174 | 11 מתוך 11 (100%) |
| * יכולת הקיום, כפי שנקבע על ידי מונה תא אוטומטי הבא מכתים פתרון trypan הכחול 0.4%. | ||
שולחן הכדאיות 1. ויעיל של שחזור Myofibroblast. טרי לעומת רקמות קפואות.
טוהר תרבות MF נוצרה נותח לאחר התאים היו מופצים לפחות לשני קטעים, כדי להבטיח שאין זיהום על ידי תאים ריריים אחרים. באמצעות מיקרוסקופ confocal, שהוכיח כי MFS היה חיובי עבור הסמן של CD90 שושלת תא mesenchymal וvimentin, ו also α-SMA, סמן של תאי mesenchymal הבדיל (איור 2).
תאי איור 2. מבודדות יש לי צורת פיברובלסטים ועטים MF Express. Immunostaining של monolayer MF המבודד, passaged לפחות שתי פעמים בתרבות תוקנו עם paraformaldehyde 1%, immunostained ונותחו על ידי מיקרוסקופיה confocal כפי שתוארו לעיל 9. תאים מבודדים הביעו סמן של myofibroblast,-SMA (בירוק, כפי שזוהה על ידי עכברי שיבוט מב 1A4), וסמני mesenchymal: vimentin (באדום, כפי שזוהה על ידי מב, RV202 שיבוט) וCD90 (בכחול, כפי שזוהה על ידי עכברי מב, שיבוט 5E10). בתמונה הממוזגת, כתומים / צהובים תאים מייצגים שיתוף לוקליזציה של-SMA וvimentin; סגול מייצג שיתוף לוקליזציה של vimentin וCD90. תחנונים דואר לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
מידע זה אושר על ידי ניתוח תזרים cytometry (איור 3). כפי שדווח בעבר, MFS הנורמלי מבודד מרירית מערכת העיכול גם היו שליליים למקבלי hematopoietic CD45 וCD31, כמו גם סמן אפיתל, EpCAM 3, 5, 9.
איור 3. אפיון פנוטיפי הראשי Myofibroblast (MF) תרבויות. המחקרים בוצעו על MFS העיקרי מבודד מרירית מעי הגס וpassaged לפחות שני זמן בתרבות. Immunostaining, ואחרי ניתוח תזרים cytometry, אישר כי יש לי התאים המבודדים פנוטיפ MF הם אחיד חיוביים עבור vimentin, α-SMA, וCD90. בקרות אלוטיפ מתאימות נכללו במחקר."Target =" _ arge.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעוד פרוטוקול זה פותח ליישום המחקר בלבד, לאור גדל חשיבות קריטית של תאי סטרומה כסמנים ביולוגיים פוטנציאליים סרטן פרוגנוסטיים ויעד טיפולי, היכולת להקפיא biospecimens "פונקציונלי" לשימוש מאוחר יותר מציעה יתרון משמעותי. זה מייצג יתרון ייחודי ליצירת biorepository הקליני, העשויים לשמש כלים נוספים כמו משרת כדי לקדם את הפיתוח של רפואה אישית 10, 11. בדומה לממצאים שדווחו בעבר לתאי גזע שמקורם בשומן mesenchymal המבודדים מחלק של כלי דם סטרומה הקפואה, שעשינו לא נצפה שינויים משמעותיים בסמנים ותגובות שגשוג / חיסון / דלקתיות ופעילות המטבולית של MFS מבודד מדגימות רירית קפוא. 12 עם זאת, אנחנו לא שוללים כי חלק מתגובות שנבדקו לא כמו בתצהיר סמן תאי, וכו 'עשוי להשתנות . לפיכך, במקרים של עבודה עם לא ידוע / unreאירועים מועבר, חוקרים יכולים להגדיר ניסוי השוואה שבפונקציה המסוימת תיבחן צד על ידי הצד בMFS מבודד מהרקמה קפוא וטריה של אותו האדם.
רוב הטכניקות לשיטות בידוד myofibroblast מבוססים גם על השימוש במתייפייף מכאני של הרקמה בשילוב עם טיפול או עם סוכני chelating [חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) DL-dithiothreitol (DTT),] אנזימי מפרקי חלבונים או collagenolytic ו13-14 . דווח בעבר כי דור של MF מקיבה, המעי דק ומעי גס היה יעיל על ידי שימוש בשיטה שתוארה על ידי תולדה תחילה Mahida et al, המבוסס על מתייפייף ויישום של סוכני chelating 5, 6 מכאניים. הנה, האנזימטית נוסף שיטה שמאפשרת את הדור של תרבויות העיקריות של MFS מדגימות רקמה קפוא מדווחת. בעוד שני טכניקות-תולדה והאנזימטית עיכול-הםיעיל באותה מידה בבידוד של myofibroblasts העיקרי מקיבה, מעי דק, מעי הגס ורקמות, יש עדיין ויכוח בקהילה מדעית בשאלה אם תאים בתרבית לשמר הפנוטיפ שלהם in vivo. הטכניקה דיווחה בכתב היד הזה מאפשרת לדור לא רק של תרבות MF העיקרית, אלא גם מאפשרת ניתוח vivo לשעבר של אוכלוסיות תאים שונות המוצגות במערכת עיכול רירית 15-17. זה כולל קביעת השפע היחסי שלהם עם הרקמה והסמנים הם מבטאים, אלא גם לשימוש במבחנים פונקציונליים (למשל, פעילות אנזימטית או ייצור ציטוקינים). שפע יחסי של MFS בתוך הרקמה ניתן להעריך באמצעות FACS ידי מיון התאים המבוססים על סמנים ייחודיים לMFS (כלומר, EpCAM-, CD31-, CD45-, + vimentin, α-SMA +, CD90 +) וכימות נוכחותם בהשוואה ל סך כל תאים מבודדים טרי או, אם תהיה בכך צורך, על ידי עושה יחס השוואתי עם סוגים שונים של תאים. למרות היעילותשל בידוד תא קיימא, הגבלה ראויה לציון של זה ופרוטוקולים אחרים המבוססת על עיכול אנזימטי היא שפעילות מפרקי החלבונים של האנזים המועסק עשויים לשנות epitopes פני תא. כדי להתגבר על זה, אנו מאפשרים לתאים להתאושש O / N כדי epitopes להיות מחדש הביעה באופן דומה למצב predigested.
אנחנו כבר מסוגלים לייצר באופן עקבי תרבות MF מהרקמה קפוא עם הפסד מינימאלי של כדאיות תא. היכולת לשחזר תרבויות אלה מדגימה קפוא מאפשרת לחוקרים כדי לתפעל וטובים יותר לשמר דגימות רקמה כירורגית ו / או אנדוסקופית שהושגו במהלך הלילה או מחוץ לשעתי עבודה רגילות. יתר על כן, הירידה באובדן רקמת רכש, שמישה עקב זיהום החיידקים ו / או פטרייתי במהלך תהליך ההקפאה משמשת כיתרון נוסף. בעקבות בידוד, שימוש באנטיביוטיקה צריך להיות מוגבל ל-2 הראשונים בלבד - 3 קטעים, לאחר שculturing צריך להמשיך להשתמש asepti הסטנדרטיטכניקת ג ואנטי-פַּטַרתִי / ללא מדיה סוכן אנטי-mycoplasma. שימוש שיגרתי של סוכנים אלה בתרבות התאית הוכח להפעיל אפקטי cytoxic, כלומר צמיחת תאים, ניוון סלולארי, ובהזדמנות, מות 18.
עיכול אנזימתי יניב אוכלוסיות תאים מרובות הנוכחיות בpropria lamina GI כולל: תאי מערכת חיסון, תאי אפיתל, וMFS. לאחר המעבר הראשון, רק MFS יישאר וניתן לזהות על ידי פנוטיפ הייחודי שלהם (איור 1), וכן באמצעות פנל תא ספציפי של ניתוח סמן (CD90,-SMA, וvimentin חיובי, אך שלילי לאפיתל וhematopoietic סמנים) 3, 5, 9. למרות שזה מקובל שmyofibroblasts נובע מתאי גזע mesenchymal במארח הרגיל, במצבי מחלה כגון דלקת וסרטן כרוניים, תת-אוכלוסייה של MFS הוכחה אפיתל המפורש או סמני 3 hematopoietic. ממצאים אלה כבר הציעו להיות אוליתוצאה של מעבר אפיתל- mesenchymal (EMT) או גיוס של fibrocytes נגזר משושלת hematopoietic 3, 19. יתר על כן, יש להשתמש בזהירות נוספת אם תאי immunostained ונותחו על ידי cytometry זרימה עבור הסמנים שנדונו לעיל. בזמן שאנחנו לא מצאנו את אובדן epitope להיות בעיה לאחר מאפשר לתאים להתאושש O / N מהרקמה טרי מתעכל מודגרות בלוחות שאינם חסיד, אובדן epitopes יכול מתרחש בעת שימוש טריפסין או כל אנזים פרוטאוליטים אחר בניתוק של תאים מהצלחת. לכן, כדי להימנע מבעיה זו, אנו ממליצים להשתמש בפתרון תא דיסוציאציה עם סוכני chelating כגון EDTA כאשר תרבויות MF חסיד מיועדות לimmunostaining אחרי ניתוח cytometry זרימה. אחרי תרבות העיקרית של myofibroblasts הוא הוקם, אז יכולים להיות קפוא התאים בתקשורת הקפאה ומאוחסנים בחנקן נוזלי. תאים אלה יכולים לשמש במגוון של ניסויים במבחנה עד כ 14-15מעברים, אחרי שזמן התאים להזדקן וצריכים להיות מושלכים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM, 1x | Corning | MT-10-010-CV | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100x | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacin HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Accumax cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Cell Strainer (70 µm) | Corning | 352350 | |
| PE Mouse Anti-Human Vimentin | BD Biosciences | 562337 | Clone RV202 |
| FITC Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich | F3777 | Clone 1A4 |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 559869 | Clone 5E10 |
References
- Yamaguchi, H., et al. Stromal Fibroblasts Mediate Extracellular Matrix Remodeling and Invasion of Scirrhous Gastric Carcinoma Cells. PLoS ONE. 9, e85485 (2014).
- Mullan, N., Hughes, K. R., Mahida, Y. R. Primary Human Colonic Myofibroblasts Are Resistant to Clostridium difficile Toxin A-Induced, but Not Toxin B-Induced, Cell Death. Infect Immun. 79, 1623-1630 (2011).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal Cells of the Intestinal Lamina Propria. Annu Rev Physiol. Annu Rev Physiol . 73, 213-237 (2011).
- Latella, G., Sferra, R., Speca, S., Vetuschi, A., Gaudio, E. Can we prevent, reduce or reverse intestinal fibrosis in IBD? Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17, 1283-1304 (2013).
- Saada, J. I., et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Mahida, Y. R., et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am J Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).
- Roncoroni, L., et al. Isolation and culture of fibroblasts from endoscopic duodenal biopsies of celiac patients. J Transl Med. 7 (40), (2009).
- Pinchuk, I. V., et al. Stromal Cells Induce Th17 during Helicobacter pylori Infection and in the Gastric Tumor Microenvironment. PLoS ONE. 8, e53798 (2013).
- Pinchuk, I. V., et al. Monocyte chemoattractant protein-1 production by intestinal myofibroblasts in response to staphylococcal enterotoxin a: relevance to staphylococcal enterotoxigenic disease. J. Immunol. 178, 8097-8106 (2007).
- Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Sem Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
- Valcz, G., Sipos, F., Tulassay, Z., Molnar, B., Yagi, Y. Importance of carcinoma-associated fibroblast-derived proteins in clinical oncology. J. Clin. Pathol. 67, 1026-1031 (2014).
- Minonzio, G., et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69, 211-216 (2014).
- Gargus, M., Niu, C., Shaker, A. Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus. J. Vis. Exp. (95), e52215 (2015).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. J. Vis. Exp. (80), e50611 (2013).
- Schiller, J. H., Bittner, G. Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an α5/β1-Integrin-Fibronectin Interaction. Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).
- Augello, A., Kurth, T. B., De Bari, C. Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches. Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).
- Meller, D., Pires, R. T. F., Tseng, S. C. G. Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures. Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).
- Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., Beswick, E. J. Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers. PLoS ONE. 9, e98656 (2014).
