Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Storstilet produktion af cardiomyocytter fra menneskelige pluripotente stamceller Ved hjælp af en meget reproducerbar lille molekyle-Based Differentiering Protocol

Published: July 25, 2016 doi: 10.3791/54276
Automatic Translation
*1,2,3,8, *1,8, 1, 6,7, 1, 6,7, 2,3,4, *2,3, *1,5
1Department of Stem Cells and Developmental Biology, Cell Science Research Center, Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, 2Developmental and Stem Cell Biology Division, Victor Chang Cardiac Research Institute, 3St. Vincent´s Clinical School, Faculty of Medicine, University of New South Wales, 4School of Biotechnology and Biomolecular Sciences, University of New South Wales, 5Department of Developmental Biology, University of Science and Culture, 6Heart Centre for Children, The Children´s Hospital at Westmead, 7Sydney Medical School, University of Sydney, 8Department of Developmental Biology, University of Science and Culture, Tehran, Iran
* These authors contributed equally

Abstract

Maksimering gavn af menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) til forskning, sygdom modellering, farmaceutiske og kliniske anvendelser kræver robuste metoder til produktion i stor skala af funktionelle celletyper, herunder cardiomyocytter. Her demonstrerer vi, at den tidsmæssige manipulation af WNT, TGF-β, og SHH signalveje fører til højeffektive cardiomyocyte differentiering af enkelt-celle passerede hPSC linier i både statiske suspension og omrørt suspension bioreaktorsystemer. Anvender denne strategi resulterede i ~ 100% slå sphæroider, konsekvent indeholder> 80% kardial troponin T-positive celler efter 15 dages dyrkning valideret i flere hPSC linjer. Vi rapporterer også om en variation af denne protokol til brug med cellelinjer i øjeblikket ikke tilpasset encellede passage, hvis succes er blevet verificeret i 42 hPSC linjer. Cardiomyocytter genereres ved hjælp af disse protokoller udtrykker afstamning-specifikke markører og show forventede electrophysiological funktionaliteter. Vores protokol præsenterer en enkel, effektiv og robust platform til produktion i stor skala af humane cardiomyocytter.

Introduction

Humane pluripotente stamceller (hPSCs), herunder humane embryonale stamceller (hESCs) og inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs), har mulighed for selv-fornyelse og evnen til at differentiere til celler i de tre embryonale kim lag 1,2. På grund af disse egenskaber, hPSCs en værdifuld og ubegrænset kilde til generering og skalerbar produktion af sygdomsspecifikke relevant celletyper til modellering human sygdom 3-5, til high-throughput lægemiddel-screening og toksicitet assays 6,7 og potentielt til kliniske anvendelser 8 . Generation af cardiomyocytter fra hPSCs giver mulighed for specifikt at undersøge mekanismerne i komplekse menneskelige hjerte-kar-sygdomme og deres mulige behandlinger, der tidligere uden for rammerne af vores kapacitet på grund af mangel på relevante dyremodeller og / eller tilgængeligheden af ​​berørte primære væv.

Alle førnævnte anvendelser af hPSCs necessitate produktionen af ​​massive antal af højt beriget og funktionelle cardiomyocytter. Således tilgængeligheden af en effektiv, reproducerbar og skalerbar in vitro hjerte-differentiering protokol egnet til flere hPSC linjer er afgørende. Konventionelle cardiomyocyte differentiering protokoller har ansat forskellige strategier såsom embryoid krop dannelse 9, co-kultur teknikker 10, induktion med cocktails af cytokiner 11 og protein transduktion metoder 12. På trods af fremskridt i disse teknikker, lider de fleste stadig af dårlig effektivitet, kræver dyre vækstfaktorer, eller tilbyde begrænset universalitet når du forsøger at bruge flere hPSC linjer. Til dato har disse udfordringer sat grænser for produktionen af hPSC-afledte cardiomyocytter for celleterapi studier i dyremodeller, samt i den farmaceutiske industri for drug discovery 13. Derfor er udviklingen af ​​robuste og overkommelige teknikker til store-skala produktion af funktionelle hPSC-afledte cardiomyocytter i skalerbare dyrkningssystemer vil i høj grad lette deres kommercielle og kliniske anvendelser.

I dette manuskript rapporterer vi udviklingen af ​​en omkostningseffektiv og integreret hjertedifferentiering system med høj effektivitet, reproducerbarhed og anvendelighed til hESCs og hiPSCs genereret fra en række forskellige kilder og dyrkningsmetoder, herunder en fremgangsmåde til produktion i stor målestok af højt berigede populationer af hPSC-afledte cardiomyocytter ved anvendelse af en bioreaktor. Derudover har vi optimeret denne protokol for hPSC linjer ikke er tilpasset feeder fri og / eller enkelt cellekultur, såsom nyetablerede hiPSCs eller store kohorter af hPSC linjer er relevante for analysen af ​​sygdom mekanisme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Udarbejdelse af Kultur Medier, Overfladebehandling af Cell Culture Plader og vedligeholdelse af udifferentierede hPSCs

  1. medier Forberedelse
    Bemærk: Der steriliseres mediet ved anvendelse af en 0,22 um filtreringsindretning og opbevares ved 4 ° C beskyttet mod lys i op til 4 uger. Reagens navne, leverandører og katalognumre er angivet i Materials tabel.
    1. For mus embryonale fibroblaster (MEF) Medium, kombinere 445 ml DMEM, 50 ml føtalt bovint serum (FBS) og 5 ml celledyrkningsmedium (fx Glutamax).
    2. For hESC Medium, kombinere 390 ml Knockout-DMEM (KO-DMEM), 100 ml Knockout Serum udskiftning (KO-SR), 5 ml celledyrkningsmedier, 5 ml MEM minimum essentielle aminosyrer opløsning og 0,5 ml 55 mM β-mercaptoethanol.
      ADVARSEL: β-mercaptoethanol er giftigt. Undgå indånding, indtagelse og hudkontakt.
    3. For RPMI-B27 (RB) Medium, kombinere 475 ml RPMI 1640, 10 ml B27 minusinsulin, 5 ml celledyrkningsmedier, 5 ml MEM minimum essentielle aminosyrer opløsning, 5 ml penicillin / streptomycin og 0,5 ml 55 mM β-mercaptoethanol.
    4. På Dissociation Solution (DS), kombinere 10 ml 0,05% trypsin, 4 ml KO-SR, 1 ml collagenase type IV (1 mg / ml), 5 ml KO-DMEM og 20 pi CaCI2 (1 M).
    5. For Feeder-celle-konditioneret medium, tilsættes 15 ml hESC medium (uden bFGF) til en T75 kolbe med kon fl gelige fødeceller (MEF eller humane forhudsfibroblaster), der tidligere er blevet inaktiveret ved behandling med enten mitomycin C eller ved bestråling. Harvest konditioneret medium efter 24 timer og erstatte med frisk embryonale medium. Celler kan anvendes i op til 2 uger.
  2. Coating af cellekulturplader
    1. ECM Gel Coating:
      1. Ved køb, tø ECM gel ekstrakt ved 4 ° C, indtil det er i en jævnt konsistent flydende tilstand, som pr fabrikantens anvisninger. Fortynd i et forholdpå 1: 2 i koldt KO-DMEM-medium, alikvot og opbevares ved -20 ° C.
        Bemærk: Under forberedelsen af ECM gel, holde alle nødvendige materialer til brug i aliquotting og belægning procedure koldt. Koncentrationen af ​​ECM-gel varierer med batchnummer. Sørg koncentrationen bemærkes på portioner. Alikvoter kan opbevares ved -20 ° C i op til 6 måneder.
      2. Optø et ECM gel alikvot ved 4 ° C. Når optøet, tilsættes kold KO-DMEM medium til en slutkoncentration på 0,34 mg / ml. Pipette godt og tilsæt 0,75 ml pr en brønd af en 6-brønds plade. Der inkuberes i 1 time ved 37 ° C.
    2. Mitotisk inaktiveret mus embryonale fibroblast Feeder Cell (MEF) Coating
      Bemærk:. Fremstilling af MEF feederceller er tidligere blevet beskrevet 14
      1. Coat en 6-brønds celledyrkningsplade med Attachment Factor (AF) eller 0,1% gelatine (se trin 1.2.3) ved stuetemperatur i 5 minutter (0,75 ml pr en brønd af en 6-brønds plade).Fjern og lad pladen i biosikkerhed kabinet (BSC) til tørre.
      2. Tø MEF ved at overføre en frossen hætteglas til et 37 ° C vandbad i ca. 2 - 3 i min.
      3. Tilføj 7 ml MEF medium til et 15 ml rør. Når hætteglasset af celler optøs langsomt overføre indholdet til 15 ml rør. Centrifuger ved 300 xg i 4 min. Aspirere supernatanten og resuspender cellerne i MEF medium.
      4. Tæl cellerne og pladen 1 × 10 6 celler pr plade 6 (~ 1,7 x 10 5 celler / brønd). Overførsel til en 37 ° C / 5% CO2 inkubator og tillade celler at vedhæfte O / N før brug.
    3. Gelatine Coating:
      1. Opløs 1 g gelatinepulver i ultrarent vand for at lave en 0,1% (w / v) opløsning. Inkuber i 15 minutter ved 37 ° C, derefter autoklaveres opløsningen ved 121 ° C i 15 min. Når afkølet, tilsættes til det nødvendige antal brønde (0,75 ml pr en brønd af en 6-brønds plade) og inkuberes i 15 minutter ved 37 ° C.
    4. Laminin Coating:
      1. Tø laminin (1 mg / ml) ved 4 ° C indtil optøet. Til 5 ul laminin løsning, tilsættes 1 ml kold PBS. Pipette godt derefter tilføje til det nødvendige antal brønde (0,75 ml pr en brønd af en 6-brønds plade) og inkuberes i 1 time ved 37 ° C.
    5. Silicon Belægning af Spinner Flask Intern Overflade:
      1. Vask grundigt en 100 ml spinner kolbe (med 1 glas pendul) med destilleret vand ved hjælp af en rensebørste til at fjerne støv og / eller kultur rest. Fyld med 70% ethanol, og efter 30 min skylles med destilleret vand. Tilsæt 5 M NaOH og efterlade O / N.
      2. Fjern NaOH-opløsning, og kolben skylles under rindende vand i 5 min. Fyld kolben med 1 M HCI og orlov i 15 min. Kolben skylles med rindende vand i 5 minutter, derefter to gange med dobbeltdestilleret vand til heltfjerne ethvert spor af HCI. Lad kolben tørre helt i BSC.
      3. Tilsættes 1,5 ml silikonebehandling opløsning til kolben og rotere vandret for at dække alle overflader. Gentag den samme procedure for glasset pendul.
      4. Varm coatede kolbe i en tør ovn ved 100 ° C i 1 time eller lad den tørre O / N ved stuetemperatur. Ved opvarmning i en ovn, henstilles til afkøling til stuetemperatur i 30-60 min.
      5. Kolben skylles 3 gange med deioniseret vand i 15 minutter hver, herefter steriliseres ved autoklavering ved 121 C i 20 minutter.
  3. Vedligeholdelse af udifferentierede hPSCs
    Bemærk:     For hver af de protokoller, der er beskrevet, medmindre det specifikt er angivet dyrkes celler og dyrket i brønde på 6-brønds kulturplader og volumener vil blive givet passende for dette format.
    1. hPSCs dyrkes som ikke nærmere angivet Spheroids i en statisk Suspension System
      Bemærk: Celler, der anvendes i disse trin, burde allerede være tilpassetsingle-cellekultur. 15
      1. Start eksperiment med hPSCs dyrket på ECM gel i en 6-brønds dyrkningsplade på ca. 70 - med 80% konfluens. Fjerne eventuelle differentierede kolonier ved hjælp stereomikroskop i BSC. Tilsæt 10 uM ROCK inhibitor Y-27632 og inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
        Bemærk: at fjerne de differentierede kolonier, bruge en pipettespids til at frigøre og forsigtigt fjerne alle de differentierede dele manuelt under stereomikroskop. Pas på ikke at fjerne udifferentierede kolonier.
      2. Fjerne celler fra inkubatoren og aspirat medium. Vask cellerne med 1 ml PBS, fjerne og tilføje 0,5 ml celle dissociation enzym. Inkubér cellerne i 4. - 5. min ved 37 ° C.
      3. Tilsæt 1 ml hESC medium og høste cellerne under anvendelse af en celleskraber. Dissociere celler i enkeltceller ved anvendelse af en p1,000 pipette. Tæl levedygtige celler under anvendelse af Trypan blå og et hæmocytometer.
      4. Resuspender celler til 2 × 10 5 levedygtige calen / ml i feeder-celle-konditioneret medium suppleret med 100 ng / ml bFGF og 10 uM ROCK inhibitor Y-27632. Overfør celler til ultralave fastgørelsesplader anvendelse af en 5 ml pipette (3 ml per brønd af 6-brønds plade).
      5. Efter 2 dage, forsigtigt fjerne celler fra inkubatoren og aspireres halvdelen af ​​(ca. 1,5 ml) mediet. Erstatte med frisk konditioneret medium suppleret med 100 ng / ml bFGF.
      6. Skift halvdelen af ​​mediet hver dag med konditioneret medium suppleret med 100 ng / ml bFGF indtil dag 5. Nu, enten yderligere kultur celler, passage for fortsat udifferentieret kultur (trin 1.3.1.2 - 5), eller brug for hjerte-differentiering (Afsnit 2 ). Hvis der fortsat kultur, passage celler hver 4 - 8 dage.
    2. hPSCs dyrket på fødeceller og passeret Brug Collagenase Type IV
      1. Før passage hPSCs, fjerne eventuelle differentierede kolonier ved hjælp af stereomikroskopet i BSC. Aspirer mediet og vask cellerne med 1 mlPBS per brønd. Fjern derefter tilsættes 0,75 ml collagenase type IV (1 mg / ml) og inkuberes ved 37 ° C 5 - 15 min, som krævet for at få kanterne af kolonierne begynder at skalle af.
      2. Aspirer collagenase og tilsæt 1 ml embryonale medium per brønd. Frigør kolonier til små klynger ved hjælp af en celleskraber, derefter overføre cellerne under anvendelse af en p1,000 pipette til et 15 ml rør. Vær omhyggelig med ikke at bryde op klyngerne i små stykker.
      3. Vask grundigt med 1 ml hESC medium til at indsamle alle tilbageværende celler og tilføje til 15 ml rør. Centrifuger ved 100 xg i 2 min. Aspirere supernatanten og resuspender cellerne i embryonale medium suppleret med 100 ng / ml bFGF.
      4. Fjern en MEF belagt plade fra inkubatoren og aspirér MEF medium. Overfør cellerne i et forhold mellem 1: 3 og 1:10, alt efter omstændighederne. Skift medium dagligt med frisk embryonale medium suppleret med 100 ng / ml bFGF. Passage celler hver 4 - 8 dage.

2. Differentiation af hPSCs som Spheroids i en statisk Suspension System

  1. Start eksperiment ved hjælp dag 5 udifferentierede spheroids som udarbejdet i afsnit 1.3.1.
    Bemærk: På dette tidspunkt, bør den gennemsnitlige størrelse af sfæroider være 175 ± 25 um. Et minimum af 50 spheroids bør anvendes, når du starter en differentiering eksperiment.
  2. Transfer sfæroider i et 15 ml rør ved anvendelse af en 5 ml pipette. Vask grundigt med 1 ml RB-medium til at indsamle alle resterende sfæroider og tilføje til det samme 15 ml rør. Lad cellerne i 5 min, indtil sphæroider har sedimenteret at danne en løs pellet (IKKE centrifugeres). Aspirere supernatanten, og pas på ikke at tage nogen sfæroider.
  3. Tilsæt 3 ml RB-medium suppleret med 12 pM CHIR99021. Overfør cellerne tilbage til en brønd af en 6-brønds fastgørelsesplade ultralav. Efter 24 timer, skal du gentage trin 2.2.
    Bemærk: RB medium er lysfølsomt. Når man arbejder med RB medium, holder BSC lys slukket.
  4. ENdd 3 ml RB medium til cellepelleten. Overfør cellerne tilbage til en brønd af en 6-brønds fastgørelsesplade ultralav. Efter 24 timer, skal du gentage trin 2.2.
  5. Tilsæt 3 ml RB-medium suppleret med IWP2, purmorphamine og SB431542 (5 uM hver). Overfør cellerne tilbage til en brønd af en 6-brønds fastgørelsesplade ultralav. Efter 2 dage gentage trin 2.2.
  6. Resuspender cellerne i 3 ml RB medium og overførsel til en gelatineovertrukket plade for at tillade cellerne at vedhæfte.
    Bemærk: På dette stadium kan cellerne også holdes i suspension. For at fortsætte med statisk suspensionskultur, overføre cellerne tilbage til en ultralav fastgørelsesplade.
  7. Skift medium med 3 ml RB medium efter 2 dage. Kulturerne vil begynde at slå næste dag. Skift medium hver 3 - 4 dage med RB medium.

3. Differentiering af hPSCs som Spheroids i en omrørt suspension bioreaktor

  1. Start eksperimentere med udifferentieret sphæroider kulturd i statisk suspension i mindst 3 passager (Se afsnit 1.3.1). Tilsæt 10 uM ROCK inhibitor Y-27632 og inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
  2. Fjerne celler fra inkubatoren og overdrager sfæroider i et 15 ml rør ved anvendelse af en 5 ml pipette. Vask grundigt med 1 ml hESC medium til at indsamle alle resterende sfæroider og tilføje til det samme 15 ml rør. Lad cellerne i 5 min, indtil sphæroider har sedimenteret at danne en løs pellet (IKKE centrifugeres). Aspirere supernatanten, og pas på ikke at tage nogen sfæroider.
  3. Vask cellerne ved tilsætning af 1 ml PBS. Lad i 5 min, indtil sphæroider har sedimenteret at danne en løs pellet (IKKE centrifugeres). Fjern supernatanten og tilsæt 0,5 ml 0,05% trypsin plus 0,53 mM EDTA. Inkubér cellerne i 4. - 5. min ved 37 ° C.
  4. Fjern celler fra inkubatoren, og der tilsættes 1 ml hESC medium. Ved hjælp af en p1,000 pipette, dissociere cellerne i enkelte celler, tælle cellerne ved hjælp af Trypan blå og et hæmocytometer. Resuspender til 2 × 10 5 viaBle celler / ml i konditioneret medium suppleret med 100 ng / ml bFGF og 10 uM ROCK inhibitor Y-27632.
  5. Overfør 100 ml cellesuspension i silikoniseret bioreaktor kolbe med en pendul (se afsnit 1.2.5). Start med 35 rpm agitation og efter 24 timers stigning til 40 rpm.
  6. Efter 48 timer stoppe omrøring i 5 - 10 min, indtil alle sfæroiderne har løst til bunden af ​​kolben. Erstat halvdelen af ​​mediet med konditioneret medium suppleret med 100 ng / ml bFGF. Gentag den samme proces hver 24 timers indtil dag 5.
    Bemærk: På dette tidspunkt bør dannes udifferentierede sfæroider med en gennemsnitlig størrelse på 175 ± 25 um.
  7. Stop omrøring i 5 - 10 min, indtil alle sfæroiderne har løst til bunden af ​​kolben. Overfør alle sfæroider til en 50 ml rør i et minimum af (mindre end 50 ml) medium. Kassér al resterende medium i bioreaktoren kolbe, omhyggeligt sikrede ingen sfæroider er tilbage i beholderen.
  8. ble i 5 - 10 min, indtil alle sfæroiderne har afgjort i bunden af ​​50 ml rør derefter forsigtigt fjerne supernatanten uden at forstyrre den løse cellepellet. Vask med 25 ml PBS med calcium og magnesium eller RB medium, derefter forlade igen i 5 - 10 min, indtil alle sfæroiderne har afgjort i bunden af ​​50 ml rør til igen at danne en løs pellet.
  9. Fjern forsigtigt supernatanten, og der tilsættes 40 ml RB medium suppleret med 12 pM CHIR99021, 10 uM Rock-hæmmer og 0,1% poly vinyl alkohol (PVA). Resuspendere sfæroider og overføre alle celler tilbage til bioreaktoren kolbe. Tilføj medium for at gøre det samlede volumen 100 ml. Genstart omrøring ved 40 rpm i 24 timer.
    Bemærk: RB medium er lysfølsomt. Når man arbejder med RB medium holde BSC i lyset slukket tilstand.
  10. Gentag trin 3,7-3,8.
  11. Fjern forsigtigt supernatanten, og der tilsættes 40 ml RB-medium suppleret med 0,1% PVA. Resuspendere sfæroider og overføre alle celler tilbage til than bioreaktoren kolbe. Tilføj medium for at gøre det samlede volumen 100 ml. Genstart omrøring ved 40 rpm i 24 timer.
  12. Gentag trin 3,7-3,8.
  13. Fjern forsigtigt supernatanten, og der tilsættes 40 ml RB medium suppleret med IWP2, purmorphamine og SB431542 (5 uM hver). Resuspendere sfæroider og overføre alle celler tilbage til bioreaktoren kolbe. Tilføj medium for at gøre det samlede volumen 100 ml. Genstart omrøring ved 40 rpm i 2 dage.
  14. Gentag trin 3,7-3,8.
  15. Fjern forsigtigt supernatanten, og der tilsættes 40 ml RB medium alene. Resuspendere sfæroider og overføre alle celler tilbage til bioreaktoren kolbe. Tilføj medium for at gøre det samlede volumen 100 ml. Genstart omrøring ved 40 rpm. Slå sfæroider bør observeres 48, - 72 timer senere.
  16. Skift halvdelen af ​​medium hver 3 - 4 dage med RB medium alene ved at stoppe omrøringen i 5 - 10 min, indtil alle sfæroiderne har løst til bunden af ​​beholderen. Fjern forsigtigt 50 ml medium uden at forstyrre sfæroiderne og carefUlly erstatte med 50 ml frisk RB medium.

4. Differentiering af hPSCs Brug Cultures ikke Tilpasset Single Cell Passage

Bemærk: Denne fremgangsmåde er specielt anvendelig til hurtig differentiering af et stort antal hPSC linjer uden at skulle tilpasse til encellede dyrkningsteknikker, en enormt arbejdskrævende og tidskrævende proces. Denne teknik kan anvendes på cellelinier, som er meget følsomme for enzymatisk celle dissociation, såsom nyoprettede hPSC linjer.

  1. Start eksperiment med hPSCs dyrket på MEF (som i afsnit 1.3.2), som er ca. 70 - med 80% sammenflydende. Fjerne eventuelle differentierede kolonier ved hjælp stereomikroskop i BSC.
  2. Fjern medium og tilsæt 0,5 ml Dissociation Solution (DS). Inkuber i 0,5 C - 1 min, indtil MEF celler er rundet op og kanterne af hPSCs kolonier blevet klart. Hurtigt fjerne DS og tilsæt 0,75 ml collagenase type IV (1 mg / ml).
  3. inkubercellerne 5 - 15 minutter ved 37 ° C. Kontroller cellerne under lup i inkubationstiden, og når hele kolonier er begyndt at løfte og tag, fjerne collagenase og tilsæt 1,5 ml hESC medium.
    Bemærk: Hvis der efter 15 min fleste af kolonierne er stadig er fastgjort, sætte cellerne tilbage til inkubatoren. Kontroller cellerne under mikroskop hver 5 min. Pas på ikke at forlade cellerne i collagenase i mere end 30 min. Hvis der er mange flydende kolonier i collagenaseopløsningen, fjern ikke collagenase; blot tilføje en ml embryonale medium.
  4. Ved hjælp af en p1,000 pipette forsigtigt pipettere kolonier at frigøre som hele kolonier. Må ikke bryde kolonierne i små stykker. Overfør cellerne i et 15 ml rør ved anvendelse af en 5 ml pipette. Vask grundigt med 1 ml hESC medium til at indsamle alle resterende celler at tilføje til det samme rør. Lad i 5 min, indtil alle kolonier har sedimenteret (IKKE centrifugeres).
  5. Fjern forsigtigt supernatanten, og der tilsættes 2 ml hESC medium suppleret med 100 ng / ml bFGF. Overfør cellerne i en ultralav fastgørelsesplade anvendelse af 5 ml pipette (1 ml i hver brønd af en 24-brønds plade og 3 ml i hver brønd af en 6-brønds plade). Der inkuberes ved 37 ° C / 5% CO2 i mindst 6 timer (maksimalt 12 timer).
  6. I løbet af denne tid, forberede det nødvendige antal laminin-coatede brønde / plader til trin 4.7. Anbefalet celleoverførsel forhold er 1 sammenflydende brønd i en 6-brønds plade til 2 brønde på en plade med 24 brønde (eller en ækvivalent mængde pr overfladeareal).
  7. Efter 6 timer, omhyggeligt overføre koloni aggregater i et 15 ml rør med 5 ml pipette. Vask pladen med RB medium til at indsamle alle resterende aggregater og tilføje til det samme 15 ml rør (0,5 ml per brønd i 24-brønd og 1 ml per brønd i 6-brønds plader). Vent 5 min, indtil aggregater sediment, derefter forsigtigt aspireres supernatanten. Pas på ikke at forstyrre den løse pellet.
  8. Tilsæt 2 ml RB medium suppleret med 12 pM CHIR99021 og omhyggeligt overføremed en 5 ml pipette til dine forberedte lamininovertrukne brønde (som i afsnit 1.2.4) for at tillade cellerne at vedhæfte.
  9. Efter 24 timer, forsigtigt fjerne mediet i hver brønd og tilsæt 1 ml RB medium alene.
    Bemærk: Nogle af aggregaterne vil kun har knyttet meget svagt til kulturen plade; derfor er det vigtigt at ikke fjerne nogen store aggregater, som kan have løsnes under proceduren mediet ændring. Det er imidlertid vigtigt, at fjerne så meget af den lille cellerester som muligt.
  10. Efter 24 timer, forsigtigt fjerne mediet og tilsæt RB medium suppleret med IWP2, purmorphamine og SB431542 (5 uM hver).
  11. Skift mediet efter 2 dage med kun RB medium. Celler vil begynde at slå næste dag.
  12. Skift medium hver 3 - 4 dage med kun RB medium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at etablere en simpel metode til storstilet differentiering af cardiomyocytter fra hPSCs, vi skabt en protokol, hvor cellerne oprindeligt blev behandlet med en WNT / β-catenin aktivator (CHIR99021) 16 og efterfølgende med hæmmere af WNT / β- catenin og transformerende vækstfaktor-β (TGF-β) pathways (IWP2 16 og SB431542 17, henholdsvis) og endelig en aktivator af den soniske hedgehog (SHH) pathway (purmorphamine) 17 (figur 1A). I vores differentiering strategi, ca. 50% af sfæroiderne (175 ± 25 um sfæroid diameter størrelse) begyndte at slå 7 dage efter påbegyndelse af differentiering, som derefter forøget til 100% på dag 10. Det er interessant, ved hjælp af denne protokol, differentierede sfæroider er blevet observeret at fortsætte med at slå op til 60 dage efter differentiering initiering 18. Befolkning undersøgelser af dissocierede sfæroiderundersøgt ved flowcytometri afslørede, at på dag 15, mere end 90% af befolkningen indeholdt kardiel troponin T positive (cTnT +) celler, mens mindre end 12% af cellerne var positive for glat muskulatur og endotelceller markører (3,1% von Willibrand Factor (vWF +), 8,4% alfa glatmuskelactin-positive (Asma +)) 18. Til dato har den statiske suspension differentiering protokol blevet testet på 5 hESC og 4 hiPSC linjer, med udgange resulterer i ca. 90% af slå spheroids fra hver linje, der viser den høj reproducerbarhed af denne protokol mellem forskellige hPSC linjer (Figur 1B).

For at udvikle en integreret platform for storstilet produktion af humane cardiomyocytter, vi anvendte vores statiske suspension differentiering strategi til en omrørt suspension bioreaktor (figur 2A). De differentierende sfæroider viste lignende adfærd i bioreaktoren environment som i statisk system (figur 2B) og blev observeret ca. 100% af sfæroider, der skal slå på dag 10 18. Immunfarvning i sektioner for at slå sfæroider indsamlet på dag 30 ved anvendelse af antistoffer mod cTnT og den kardiale transskriptionsfaktor NKX2-5, viste cytoplasmatisk og nuklear ekspression af disse proteiner, henholdsvis (figur 2C). Det totale udbytte af celler i den dynamiske suspensionskultur var ca. 90 - 100 millioner celler i 100 ml arbejdsvolumen efter 15 dages differentiering kultur. Med dette er tilfældet, kan den cardiomyocyte udbytte nå op til ca. 54-90 millioner celler (med den observerede 60 - 90% differentiering effekt) fra 20 millioner startende hPSCs, inokuleret i hPSCs ekspansionsfasen som enkeltceller. Vi har desuden undersøgt elektrofysiologiske egenskaber af differentierede cardiomyocytter ved hjælp af enkelt-celle patch clamp-metoden. Slå sfæroider fra bioreaktoren kulturer vardissocieres til enkeltceller på dag 30 og aktionspotentialer konstateret på repræsentative celler ved anvendelse af helcelle patch-clamp-teknikken. Data viste tilstedeværelsen af de tre vigtigste hjerte- celletyper (atrial-, nodal- og ventrikulær-lignende celler) i populationen af enkeltceller 18.

For de to differentieringsfaktorer ovennævnte teknikker, skal tilpasses til feeder-fri og / eller enkeltstrenget cellesuspensionskultur 19-21 hPSCs. Nogle hPSC linjer er imidlertid meget følsomme over for enzymatisk celle dissociation og viser signifikant tab cellernes levedygtighed efter dissociation, såsom kan observeres i nyoprettede hiPSC linjer. Desuden vil, når der arbejdes med store kohorter af linjer, tilpasning af alle til fødefri og enkelt cellekultur være enormt arbejdskrævende og tidskrævende. For at løse disse problemer, blev udifferentierede sfæroider erstattet med udifferentierede celle aggregater (figur 3A).Vores data viser, at ved hjælp af denne ændrede teknik, slå klynger dukkede 7 dage efter differentiering indvielse. Reproducerbarheden af denne modificerede version blev bekræftet under anvendelse af 42 hiPSC linjer, hvor alle testede linjer genereret i gennemsnit mere end 60% cTnT + -celler ved dag 15 for hvert forsøg udført (figur 3B). Immunfarvning bruger antistoffer mod cTnT og NKX2-5 i dissocierede slå klynger viste cytoplasmatisk og nuklear udtryk, henholdsvis (figur 3C).

figur 1
Figur 1. Skematisk af cardiomyocyte Differentiering fra hPSCs i Static Suspension og repræsentative data. (A) Eksperimentel udformning af hPSCs differentiering til cardiomyocytter i statisk affjedringssystem. (B) Evaluering af effektiviteten afhjertedifferentiering måles ved at tælle antallet af bankende sfæroider (%). Vist her er gennemsnit på mindst 3 differentiering eksperimenter fra hver af 5 hESC og 4 hiPSC linjerne 18. Samlet gennemsnit på slå sfæroider fra alle linjer er ca. 90%. Fejl søjler repræsenterer SD (n = 3). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Samlet Skematisk af cardiomyocytter Differentiering fra hPSCs i Dynamic Suspension og repræsentative data. (A) Eksperimentel udformning af hPSCs differentiering til cardiomyocytter i dynamisk affjedringssystem. RI: Rock inhibitor (B) Fase kontrast billede af dagen 5 sfæroider (Repræsentant result fra Royan H5 embryonale linje). Scale bar 200 um (C) immunfarvning af embryonale afledt-bankende sphæroider sektioneret på dag 30 for Nkx2.5 og cTnT. Scale bar 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Samlet Skematisk af cardiomyocytter Differentiering fra hPSCs hjælp Cultures ikke tilpasset til Single Cell Passage. (A) Eksperimentel udformning af hPSCs differentiering til cardiomyocytter ved anvendelse kulturer ikke er tilpasset enkelt celle passage. (B) Flowcytometrianalyse af dissocierede aggregater viser gennemsnitligt mere end 60% cTnT + -celler i 42 testede hiPSC linier. (C) immunfarvning af dissocierede cardiomyocytter afledt afhiPSCs for Nkx2.5 og cTnT (Repræsentant resultat 646-4 hiPSC linje). Scale bar 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cardiomyocytter afledt hPSCs er en særdeles attraktiv kilde til brug i human sygdom modellering, narkotika screening / toksicitet og måske i fremtiden, regenerative behandlinger. En af de største hindringer til anvendelse af disse celler imidlertid er evnen til at give tilstrækkelig høj kvalitet materiale for deres effektive anvendelse. Ved hjælp af vores beskrevne protokol, tilbyder vi en metode, der overvinder denne begrænsning.

For nylig er syntetiske små molekyler rettet mod specifikke signalveje, der er involveret i cardiogenese blevet beskrevet at øge hjertedifferentiering 16,17,22,23. Disse bliver nu brugt som et alternativ til rekombinante cytokiner og serum, der indeholder mange udefinerede faktorer og viser variation batch. Den største fordel ved et lille molekyle protokol end dets specificitet, er, at det er billigt og komponent faktorer har generelt en forlænget holdbarhed sammenlignet med medier indeholdende cytokiner eller vækstfaktorer. Da de små molekyler, der anvendes i vores rapporterede protokol er lavmolekylære stoffer, de er strukturelt og funktionelt defineret og kan diffundere nemt gennem cellemembranen 24,25.

Hidtil har forskellige metoder været anvendt på hPSCs for at etablere robuste, skalerbare differentieringsfaktorer teknikker; De fleste af disse metoder er blevet etableret som 2D og små statiske kulturer, som kan tilbyde dårlig skalerbarhed og homogenitet. Teknikker såsom tvungen sammenlægning, mikro-udskrivning teknologi og mikro-carrier kulturer 26-29 kommer nu i brug, men på trods af visse fremskridt på dette område, disse metoder er stadig langt fra at levere den celle numre er nødvendige for deres anvendelse i høj -demand systemer. Limited eller udokumenterede reproducerbarhed og skalerbarhed, og de høje omkostninger på grund af nødvendigheden af ​​dyre medier (mTeSR1 eller StemPro-34) eller mikro-luftfartsselskaber for både udvidelse af hPSCs og deres dirigeret differentiering til cardiomyocytes 30,31, er ulemperne ved at bruge disse metoder i højt gennemløb hPSCs teknologier.

I denne undersøgelse har vi rapporteret en enkel, robust og skalerbar protokol for produktion af hPSC-afledte cardiomyocytter. Reproducerbarheden af ​​denne protokol er blevet valideret med mere end 40 forskellige hPSC linjer, den mest omfattende validering rapporteret til dato. I forhold til tidligere indberettede suspension protokoller, denne metode viser store fordele i form af skalerbarhed, reproducerbarhed, pris, effektivitet og funktionalitet af cardiomyocytter genereret. Succesen med vores differentiering protokollen er grundigt afhænger den høje kvalitet af de hPSCs anvendes til undersøgelsen. Derfor er det afgørende at kontrollere hver linje er karyotype og den høje og vedvarende udtryk for pluripotens markører ved immunfarvning og PCR før du starter eksperimentet. Især når dyrkning af celler i bioreaktoren, er det afgørende at anvende hPSCs der har BEen passeret på enkeltcelle-niveau i mindst tre passager før starten af ​​differentiering. I vores protokoller har vi anvendt sfæroider med en gennemsnitlig størrelse på 175 ± 25 um, som var sfæroider genereret efter 5 dage. Den dag, der sfæroiderne opfylder denne størrelse begrænsning kan variere efter vækstraten for individuelle hPSC linjer; det er derfor vigtigt, at størrelsen, mere end dagen for vækst, er taget i betragtning.

Denne protokol kan også manipuleres til at blive egnet til følsomme cellelinjer og store kohorter af hPSC linjer. Selv om denne protokol resulterer i højt beriget cardiomyocytter, kan renhed forbedres ved at kombinere differentiering protokol med en metabolisk udvælgelsesmetode såsom lactat-beriget medium 32. Derudover kan forbedringer i modning og funktionaliteten af ​​de afledte cardiomyocytter beskrevet i denne protokol anvendes af generation af tre-dimensionelle, justeret hjerte-væv 33. En af begrænsningerne ved denne protokol er, at særlige undertyper af cardiomyocytter ikke specifikt genereret, simpelthen en blanding af atrial, ventrikulær og nodal celler. Yderligere undersøgelser på dette område er nødvendig for at udvikle differentiering protokoller, der kan producere højt beriget subtype-specifikke cardiomyocytter i stor skala. Selv om nogle små-protokoller er blevet udviklet til dato, vil de metoder, skal grundigt testet for at sikre opskalering er muligt 34.

Udvikling af sådanne integrerede platforme kan betragtes som et vigtigt skridt mod kommercialiseringen af hPSC-afledte cardiomyocytter teknologier til klinisk, farmaceutiske, tissue engineering, og in vitro-orgel / organoide applikationer udvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Victor Chang Cardiac Research Institute ikke engagere sig i, heller ikke tolerere, ødelæggelse af menneskelige embryoner til forskning. Sit bidrag til denne undersøgelse var begrænset til at arbejde på menneskelige inducerede pluripotente stamceller.

Forfatterne erklærer de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Knockout DMEM Life Technologies 10829018
Knockout Serum Replacement (KO-SR) Life Technologies 10828028
Glutamax Life Technologies 35050061
MEM Non-essential Amino Acids Life Technologies 11140-050
β-Mercaptoethanol Life Technologies 21985-023
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) Miltenyi Biotec 130-093-843
RPMI1640 Life Technologies 11875093
DPBS, no calcium, no magnesium Life Technologies 14190144
DPBS Life Technologies 14287072
Attachment Factor (AF) Life Technologies S006100
ECM Gel Sigma-Aldrich E1270
Laminin Invitrogen 23017-015
DMEM Life Technologies 11965-092                                                                                                       
Fatal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16140-071
B27 minus insulin Gibco A18956-01
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070063
0.05% Trypsin/EDTA Life Technologies 25300-054
Collagenase Type IV Life Technologies 17140-019
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C7902
Mitomycin C Bioaustralis BIA-M1183
CHIR99021 Miltenyi Biotec 130-104-172
IWP2 Miltenyi Biotec 130-105-335
SB431542 Miltenyi Biotec 130-095-561
Purmorphamine Miltenyi Biotec 130-104-465
ROCK inhibitor Y-27632 Miltenyi Biotec 130-104-169
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E6758
Poly Vinyl Alcohol (PVA) Sigma-Aldrich 363073
Gelatin Sigma-Aldrich G1890
Trypan Blue Bio-Rad 145-0013
Accumax  Innovative Cell Technologies Inc. AM105
Sigmacote  Sigma-Aldrich SL2 
CELLSPIN Integra Biosciences 183 001
Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml  Integra Biosciences 182 023
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) Prepared in-house (or commercially available)
Human pluripotent stem cell (hPSC) lines Prepared in-house (or commercially available)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  3. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465, 808-812 (2010).
  4. Vitale, A. M., Wolvetang, E., Mackay-Sim, A. Induced pluripotent stem cells: a new technology to study human diseases. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 843-846 (2011).
  5. Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circ Res. 115, 556-566 (2014).
  6. Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
  7. Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. Korean J Intern Med. 29, 547-557 (2014).
  8. Kimbrel, E. A., Lanza, R. Current status of pluripotent stem cells: moving the first therapies to the clinic. Nat. Rev. Drug Discov. 14, 681-692 (2015).
  9. Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108, 407-414 (2001).
  10. Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107, 2733-2740 (2003).
  11. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  12. Fonoudi, H., et al. ISL1 protein transduction promotes cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells. PLoS One. 8, e55577 (2013).
  13. Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. Human embryonic stem cells and cardiac repair. Transplant Rev (Orlando). 23, 53-68 (2009).
  14. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854 (2012).
  15. Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol Biol. 767, 137-146 (2011).
  16. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109, E1848-E1857 (2012).
  17. Gonzalez, R., Lee, J. W., Schultz, P. G. Stepwise chemically induced cardiomyocyte specification of human embryonic stem cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11181-11185 (2011).
  18. Fonoudi, H., et al. A Universal and Robust Integrated Platform for the Scalable Production of Human Cardiomyocytes From Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. , (2015).
  19. Abbasalizadeh, S., Larijani, M. R., Samadian, A., Baharvand, H. Bioprocess development for mass production of size-controlled human pluripotent stem cell aggregates in stirred suspension bioreactor. Tissue Eng Part C Methods. 18, 831-851 (2012).
  20. Larijani, M. R., et al. Long-term maintenance of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells in suspension. Stem Cells Devt. 20, 1911-1923 (2011).
  21. Baharvand, H., Larijani, M. R., Yousefi, M. Protocol for expansion of undifferentiated human embryonic and pluripotent stem cells in suspension. Methods Mol Biol. 873, 217-226 (2012).
  22. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11, 855-860 (2014).
  23. Minami, I., et al. A small molecule that promotes cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined, cytokine- and xeno-free conditions. Cell reports. 2, 1448-1460 (2012).
  24. Buskirk, A. R., Liu, D. R. Creating small-molecule-dependent switches to modulate biological functions. Chem Bio. 12, 151-161 (2005).
  25. McKinsey, T. A., Kass, D. A. Small-molecule therapies for cardiac hypertrophy: moving beneath the cell surface. Nat Rev Drug Discov. 6, 617-635 (2007).
  26. Niebruegge, S., et al. Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor. Biotechnol Bioeng. 102, 493-507 (2009).
  27. Bauwens, C. L., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Eng Part A. 17, 1901-1909 (2011).
  28. Hwang, Y. S., et al. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16978-16983 (2009).
  29. Nguyen, D. C., et al. Microscale generation of cardiospheres promotes robust enrichment of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3, 260-268 (2014).
  30. Kempf, H., et al. Controlling expansion and cardiomyogenic differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 3, 1132-1146 (2014).
  31. Hemmi, N., et al. A massive suspension culture system with metabolic purification for human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Transl Med. 3, 1473-1483 (2014).
  32. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell stem cell. 12, 127-137 (2013).
  33. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat meth. 10, 781-787 (2013).
  34. Devalla, H. D., et al. Atrial-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells are a robust preclinical model for assessing atrial-selective pharmacology. EMBO Mol Med. 7, 394-410 (2015).

Tags

Developmental Biology Humane pluripotente stamceller stamcellebiologi cardiomyocytter Cardiac differentiering Små molekyler omrørt suspension bioreaktor
Storstilet produktion af cardiomyocytter fra menneskelige pluripotente stamceller Ved hjælp af en meget reproducerbar lille molekyle-Based Differentiering Protocol
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fonoudi, H., Ansari, H.,… More

Fonoudi, H., Ansari, H., Abbasalizadeh, S., Blue, G. M., Aghdami, N., Winlaw, D. S., Harvey, R. P., Bosman, A., Baharvand, H. Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol. J. Vis. Exp. (113), e54276, doi:10.3791/54276 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter