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Developmental Biology

La producción a gran escala de los cardiomiocitos de células madre pluripotentes utilizando un pequeño protocolo de diferenciación basada en la molécula altamente reproducible

Published: July 25, 2016 doi: 10.3791/54276
Automatic Translation
*1,2,3,8, *1,8, 1, 6,7, 1, 6,7, 2,3,4, *2,3, *1,5
1Department of Stem Cells and Developmental Biology, Cell Science Research Center, Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, 2Developmental and Stem Cell Biology Division, Victor Chang Cardiac Research Institute, 3St. Vincent´s Clinical School, Faculty of Medicine, University of New South Wales, 4School of Biotechnology and Biomolecular Sciences, University of New South Wales, 5Department of Developmental Biology, University of Science and Culture, 6Heart Centre for Children, The Children´s Hospital at Westmead, 7Sydney Medical School, University of Sydney, 8Department of Developmental Biology, University of Science and Culture, Tehran, Iran
* These authors contributed equally

Abstract

Maximizar el beneficio de las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) para la investigación, la modelización de enfermedades, farmacéuticos y aplicaciones clínicas requiere métodos robustos para la producción a gran escala de tipos de células funcionales, incluyendo los cardiomiocitos. Aquí demostramos que la manipulación temporal de WNT, TGF-β, y SHH vías de señalización conduce a líneas HPSC diferenciación de cardiomiocitos altamente eficiente de una sola célula a pases en tanto la suspensión estática y sistemas de suspensión de biorreactores agitados. El empleo de esta estrategia resultó en ~ 100% superando esferoides, que contiene consistentemente> 80% de células T positivos de troponina cardiaca después de 15 días de cultivo, validados en múltiples líneas HPSC. También informamos sobre una variación de este protocolo para su uso con líneas celulares no está adaptado a los pases de una sola célula, cuyo éxito ha sido verificado en 42 líneas HPSC. Cardiomiocitos generados usando estos protocolos expresan marcadores específicos de linaje y espera mostrar electrophysIOLÓGICA funcionalidades. Nuestro protocolo presenta una plataforma simple, eficiente y robusto para la producción a gran escala de los cardiomiocitos humanos.

Introduction

Las células humanas pluripotentes madre (hPSCs), incluyendo las células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs), tienen la capacidad de auto-renovación y la capacidad de diferenciarse en células de las tres capas germinales embrionarias 1,2. Debido a estas características, hPSCs proporcionan una fuente valiosa e ilimitado para la generación y escalable de producción de tipos de células relevantes de la enfermedad para el modelado de la enfermedad humana 3-5, para la detección de drogas y de toxicidad ensayos de alto rendimiento 6,7 y potencialmente para aplicaciones clínicas 8 . Generación de los cardiomiocitos de hPSCs ofrece la oportunidad de investigar específicamente los mecanismos de las enfermedades cardiovasculares humanos complejos y sus posibles tratamientos, anteriormente más allá del alcance de nuestra capacidad debido a la falta de modelos animales relevantes y / o la disponibilidad de tejidos primarios afectados.

Todas las aplicaciones mencionadas anteriormente de hPSCs necessitate la producción de un número masivo de los cardiomiocitos altamente enriquecidos y funcionales. Por lo tanto, la disponibilidad de un servicio eficaz, reproducible y escalable in vitro protocolo de diferenciación cardiaca adecuado para múltiples líneas HPSC es crucial. Protocolos de diferenciación de los cardiomiocitos convencionales han empleado diferentes estrategias como la formación de cuerpos embrioides 9, 10 técnicas de co-cultivo, la inducción con un cóctel de citoquinas 11 y métodos de transducción de la proteína 12. A pesar de los avances en estas técnicas, la mayoría todavía sufren de una pobre eficiencia, requieren factores de crecimiento caros, u ofrecer universalidad limitada cuando se trata de utilizar varias líneas HPSC. Hasta la fecha, estos problemas han establecido límites a la producción de los cardiomiocitos derivados de HPSC para los estudios de terapia celular en modelos animales, así como en la industria farmacéutica para el descubrimiento de fármacos 13. Por lo tanto, el desarrollo de técnicas robustas y asequibles para grandes-scale la producción de cardiomiocitos funcionales derivados de HPSC en sistemas de cultivo escalables facilitaría en gran medida sus aplicaciones comerciales y clínicos.

En este manuscrito, se presenta el desarrollo de un sistema de diferenciación cardiaca rentable e integrada con una alta eficacia, reproducibilidad y aplicabilidad a hESCs y hiPSCs generados a partir de una variedad de fuentes y métodos de cultivo, incluyendo un método para la producción a gran escala de muy poblaciones enriquecidas de cardiomiocitos derivados de HPSC utilizando un biorreactor. Además, hemos optimizado este protocolo para las líneas HPSC no adaptados al alimentador de cultivo celular libre y / o individual, como hiPSCs de nueva creación o grandes cohortes de líneas HPSC pertinentes para el análisis del mecanismo de la enfermedad.

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Protocol

1. Preparación de medios de cultivo, revestimiento de placas de cultivo celular y Mantenimiento de indiferenciado hPSCs

  1. Preparación de medios
    Nota: Esterilizar los medios de comunicación que utilizan un dispositivo de 0,22 micras filtración y se almacena a 4 ° C protegido de la luz para un máximo de 4 semanas. Nombres de reactivos, los proveedores y los números de catálogo se enumeran en la Tabla de Materiales.
    1. Para fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) mediano, mezcle 445 ml de DMEM, 50 ml de suero bovino fetal (FBS) y 5 ml de medio de cultivo celular (por ejemplo, Glutamax).
    2. Para células madre mediano, combine 390 ml Knockout-DMEM (KO-DMEM), 100 ml golpe de gracia suero sustitución (KO-SR), 5 ml de medio de cultivo de células, 5 ml de solución de aminoácidos esenciales mínimos MEM y 0,5 ml de 55 mM β-mercaptoetanol.
      PRECAUCIÓN: β-mercaptoetanol es tóxico. Evitar la inhalación, ingestión y contacto con la piel.
    3. Para RPMI-B27 (RB) mediano, mezcle 475 ml de RPMI 1640, 10 ml, menos B27insulina, medios de cultivo celular 5 ml, 5 ml de solución de aminoácidos esencial mínimo MEM, 5 ml de penicilina / estreptomicina y 0,5 ml 55 mM β-mercaptoetanol.
    4. Para la solución de disociación (DS), se combinan 10 ml 0,05% de tripsina, 4 ml KO-SR, 1 ml de colagenasa tipo IV (1 mg / ml), 5 ml KO-DMEM y 20 l CaCl 2 (1 M).
    5. Para células Feeder Medio Acondicionado, añadir 15 ml de medio de células madre (sin bFGF) a un matraz T75 con confluentes células alimentadoras (MEF o fibroblastos de prepucio humano) que han sido inactivados previamente por tratamiento con mitomicina C o por irradiación. Cosecha medio acondicionado después de 24 horas y reemplazar células madre con medio fresco. Las células pueden ser utilizadas por hasta 2 semanas.
  2. El recubrimiento de las placas de cultivo celular
    1. ECM gel de revestimiento:
      1. Tras la compra, descongelar el extracto de gel de ECM a 4 ° C hasta que está en un estado líquido uniformemente consistentes, según las instrucciones del fabricante. Diluir en una proporciónde 1: 2 en frío KO-medio DMEM, alícuota y se almacena a -20 ° C.
        Nota: Durante la preparación del gel de ECM, mantenga todos los materiales requeridos para su uso en el procedimiento de recubrimiento en alícuotas y frío. La concentración del gel de ECM varía con el número de lote. Asegúrese de que la concentración se observó en alícuotas. Las alícuotas se pueden mantener a -20 ° C durante un máximo de 6 meses.
      2. Descongelar una alícuota de gel de ECM a 4 ° C. Cuando se descongela, se añade medio de KO-DMEM frío para una concentración final de 0,34 mg / ml. Pipeta bien y añadir 0,75 ml por pocillo de una placa de 6 pocillos. Se incuba durante 1 hora a 37 ° C.
    2. Mitóticamente inactivadas de fibroblastos de embriones de ratón alimentador celular (MEF) Revestimiento
      Nota:. Preparación de células de alimentación MEF se ha descrito previamente 14
      1. Escudo una placa de cultivo celular de 6 pocillos con factor de adhesión (AF) o 0,1% de gelatina (véase la etapa 1.2.3) a TA durante 5 min (0,75 ml por pocillo de una placa de 6 pocillos).Retirar y dejar la placa en la cabina de bioseguridad (BSC) para secar.
      2. Descongelar MEF mediante la transferencia de un vial congelado en un baño de agua a 37 ° C durante aproximadamente 2 - 3 min.
      3. Añadir 7 ml de medio de MEF a un tubo de 15 ml. Cuando se descongela el vial de células, transferir lentamente el contenido al tubo de 15 ml. Centrifugar a 300 g durante 4 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en medio de MEF.
      4. Contar las células y la placa 1 × 10 6 células por placa de 6 pocillos (~ 1,7 x 10 5 células / pocillo). Transferir a una incubadora a 37 ° C / 5% de CO 2 y permiten que las células se unan O / N antes de su uso.
    3. Gelatina de revestimiento:
      1. Disolver 1 g de polvo de gelatina en agua ultrapura para hacer una solución 0,1% (v / w). Incubar durante 15 min a 37 ° C y luego el autoclave la solución a 121 ° C durante 15 min. Cuando se enfría, añadir al número necesario de pocillos (0,75 ml por pocillo de una placa de 6 pocillos) y se incuba durante 15 min a 37 ° C.
    4. Laminina Revestimiento:
      1. Descongelar laminina (1 mg / ml) a 4 ° C hasta que se descongeló. Para 5 l de solución de laminina, añadir 1 ml de PBS frío. Pipeta y luego añadir al número necesario de pocillos (0,75 ml por pocillo de una placa de 6 pocillos) y se incuba durante 1 hora a 37 ° C.
    5. El recubrimiento de superficie de silicio Spinner Flask interna:
      1. Es necesario lavar un matraz de agitación de 100 ml (con 1 péndulo de vidrio) con agua destilada, usando un cepillo de limpieza para eliminar el polvo y / o residuos de la cultura. Rellenar con etanol al 70% y después de 30 minutos de enjuague con agua destilada. Se añade NaOH 5 M y dejar O / N.
      2. Eliminar la solución de NaOH y enjuagar el matraz con agua corriente durante 5 minutos. Llenar el matraz con HCl 1 M y se deja durante 15 min. Lavar el matraz con agua corriente durante 5 min, a continuación, dos veces con agua doblemente destilada para completamenteeliminar cualquier rastro de HCl. Mantener el matraz se seque por completo en el BSC.
      3. Añadir 1,5 ml de solución siliconado al matraz y girar horizontalmente para cubrir todas las superficies. Repetir el mismo procedimiento con el péndulo de cristal.
      4. Calentar el matraz recubierto en un horno seco a 100 ° C durante 1 hora o dejar secar O / N a temperatura ambiente. Si se calienta en un horno, dejar enfriar a temperatura ambiente durante 30 - 60 min.
      5. Lavar el matraz 3 veces con agua desionizada durante 15 min cada uno, luego esterilizar en autoclave a 121 ° C durante 20 min.
  3. Mantenimiento de indiferenciadas hPSCs
    Nota:     Para cada uno de los protocolos descritos, a menos que se indique específicamente, las células se cultivan y se cultivaron en pocillos de placas de cultivo de 6 pocillos y los volúmenes se dará apropiado para este formato.
    1. hPSCs cultivadas como esferoides no diferenciados en un sistema de suspensión estática
      Nota: Las células utilizadas en estos pasos ya deberían adaptarse a lasuna sola célula de la cultura. 15
      1. Iniciar experimento con hPSCs cultivaron en gel de ECM en una placa de cultivo de 6 pocillos a aproximadamente el 70 - 80% de confluencia. Retire cualquier colonias diferenciadas utilizando el microscopio estereoscópico en el BSC. Añadir 10 mM inhibidor ROCA Y-27632 y se incuba a 37 ° C durante 1 hr.
        Nota: Para la eliminación de las colonias diferenciadas, utilizar una punta de pipeta de quitar y retire con cuidado todas las partes diferenciadas de forma manual mediante el microscopio estereoscópico. Tenga cuidado de no eliminar las colonias no diferenciadas.
      2. Eliminar las células de la incubadora y medio aspirado. Se lavan las células con 1 ml de PBS, quitar y poner la enzima de disociación de 0,5 ml de células. Se incuban las células durante 4 - 5 min a 37 ° C.
      3. Añadir 1 ml de medio de células madre y la cosecha de las células utilizando un rascador de células. Disociar las células en células individuales utilizando una pipeta P1,000. Contar las células viables utilizando azul tripán y un hemocitómetro.
      4. Resuspender las células a 2 × 10 5 c viablesELL / ml en medio de células alimentador acondicionado suplementado con 100 ng / ml de bFGF y 10 mM inhibidor ROCA Y-27632. Transferir las células a placas de fijación ultra-bajo utilizando una pipeta de 5 ml (3 ml por pocillo de placa de 6 pocillos).
      5. Después de 2 días, retirar con cuidado las células de la incubadora y aspirado de la mitad del medio (aproximadamente 1,5 ml). Reemplazar con medio condicionado fresco suplementado con 100 ng de bFGF / ml.
      6. Cambiar la mitad del medio cada día con medio acondicionado suplementado con 100 ng de bFGF / ml hasta el día 5. Ahora, o células de cultivo nuevas, el paso de continuar la cultura no diferenciado (etapa 1.3.1.2 - 5), o el uso para la diferenciación cardiaca (Sección 2 ). Si la cultura continua, células de paso de cada 4 - 8 días.
    2. hPSCs cultivadas en células de alimentación y se pasaron Uso de colagenasa tipo IV
      1. Antes de pases hPSCs, quitar cualquier colonias diferenciadas utilizando el microscopio estereoscópico en el BSC. Aspirar el medio y lavar las células con 1 mlPBS por pocillo. Quitar a continuación, añadir 0,75 ml de colagenasa tipo IV (1 mg / ml) y se incuba a 37 ° C durante 5 - 15 min, como se requiera para tener los bordes de las colonias a partir de pelar.
      2. Aspirar colagenasa y se añade 1 ml de medio de células madre por pocillo. Separar las colonias a pequeños grupos utilizando un rascador de células, a continuación, transferir las células por medio de una pipeta P1,000 en un tubo de 15 ml. Tenga cuidado de no romper los cúmulos en trozos pequeños.
      3. Lavar el medio hCME bien con 1 ml para recoger cualquier resto de las células y añadir al tubo de 15 ml. Centrifugar a 100 xg durante 2 min. Aspirar las células sobrenadante y resuspender en medio hESC suplementado con 100 ng de bFGF / ml.
      4. Retire una placa recubierta MEF de la incubadora y aspirar el medio MEF. Transferir las células a una relación de entre 1: 3 y 01:10, según sea apropiado. Cambio de medio cada día con medio de células madre fresco suplementado con 100 ng de bFGF / ml. células de paso cada 4 - 8 días.

2. Differentiación de hPSCs como esferoides en un sistema de suspensión estática

  1. Comience experimento utilizando los días 5 esferoides no diferenciadas según se preparó en la Sección 1.3.1.
    Nota: En esta etapa, el tamaño medio de esferoides debe ser 175 ± 25 micras. Un mínimo de 50 esferoides se debe utilizar cuando se inicia un experimento de diferenciación.
  2. Transferencia de esferoides en un tubo de 15 ml con una pipeta de 5 ml. Lavar el medio RB bien con 1 ml para recoger cualquier esferoides restantes y añadir al mismo tubo 15 ml. Deje las células durante 5 min hasta esferoides han sedimentado para formar un sedimento suelto (NO centrifugar). Aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no tomar ninguna esferoides.
  3. Añadir 3 ml de medio RB suplementado con 12 mM CHIR99021. La transferencia de las células de nuevo en un pocillo de una placa de fijación de 6 pocillos ultra-bajo. Después de 24 horas, repita el paso 2.2.
    Nota: RB medio es sensible a la luz. Cuando se trabaja con medio RB, mantener la luz apagada BSC.
  4. UNdd 3 ml de medio RB al sedimento celular. La transferencia de las células de nuevo en un pocillo de una placa de fijación de 6 pocillos ultra-bajo. Después de 24 horas, repita el paso 2.2.
  5. Añadir 3 ml de medio suplementado con RB IWP2, purmorphamine y SB431542 (5 mM cada uno). La transferencia de las células de nuevo en un pocillo de una placa de fijación de 6 pocillos ultra-bajo. Después de 2 días, repita el paso 2.2.
  6. Resuspender las células en 3 ml de medio de transferencia y RB a una placa recubierta con gelatina para permitir que las células se unan.
    Nota: En esta etapa, las células también se pueden mantener en suspensión. Con el fin de continuar con el cultivo en suspensión estática, transferir las células de nuevo a una placa de fijación ultra-bajo.
  7. Cambiar el medio con 3 ml de medio RB después de 2 días. Las culturas empezarán a batir día siguiente. Cambiar el medio cada 3 - 4 días con medio de RB.

3. Diferenciación de hPSCs como esferoides en un biorreactor suspensión agitada

  1. Iniciar el experimento con la cultura esferoides indiferenciadad en suspensión estática durante al menos 3 pasajes (véase la sección 1.3.1). Añadir 10 mM inhibidor ROCA Y-27632 y se incuba a 37 ° C durante 1 hr.
  2. Eliminar las células de la incubadora y transferir todos los esferoides en un tubo de 15 ml con una pipeta de 5 ml. Lavar el medio hESC bien con 1 ml para recoger cualquier esferoides restantes y añadir al mismo tubo 15 ml. Deje las células durante 5 min hasta esferoides han sedimentado para formar un sedimento suelto (NO centrifugar). Aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no tomar ninguna esferoides.
  3. Lavar las células mediante la adición de 1 ml de PBS. Dejar durante 5 minutos hasta que esferoides han sedimentado para formar un sedimento suelto (NO centrifugar). Aspirar el sobrenadante y añadir 0,5 ml de tripsina al 0,05% más EDTA 0,53 mM. Se incuban las células durante 4 - 5 min a 37 ° C.
  4. Eliminar las células de la incubadora y añadir 1 ml de medio de células madre. Con una pipeta P1,000, disociar las células en células individuales, contar las células usando azul tripán y un hemocitómetro. Volver a suspender a 2 × 10 5 VIABLe células / ml en medio acondicionado suplementado con 100 ng / ml de bFGF y 10 mM inhibidor ROCA Y-27632.
  5. Transferir 100 ml de suspensión de células en el matraz biorreactor siliconado con 1 péndulo (véase la Sección 1.2.5). Comience con una agitación de 35 rpm y después de aumento de 24 horas a 40 rpm.
  6. Después de 48 horas, detener la agitación durante 5 a 10 min hasta que todos los esferoides han depositado en el fondo del matraz. Reemplazar la mitad del medio con medio acondicionado suplementado con 100 ng de bFGF / ml. Repita el mismo proceso cada 24 horas hasta el día 5.
    Nota: En esta etapa, esferoides no diferenciadas con un tamaño medio de 175 ± 25 micras deben formarse.
  7. Detener la agitación durante 5 a 10 min hasta que todos los esferoides han depositado en el fondo del matraz. Transferir todos los esferoides a un tubo de 50 ml en una cantidad mínima de medio (menos de 50 ml). Descarte cualquier medio que queda en el matraz biorreactor, garantizando cuidadosamente no esferoides se queda en el recipiente.
  8. leave 5 - 10 min hasta que todos los esferoides se han asentado en la parte inferior del tubo 50 ml a continuación, quitar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento celular suelto. Lavar con 25 ml de PBS con calcio y magnesio o medio RB, a continuación, dejar de nuevo por 5 a 10 min hasta que todos los esferoides se han asentado en la parte inferior del tubo 50 ml para formar de nuevo un sedimento suelto.
  9. Retirar con cuidado el sobrenadante y añadir 40 ml de medio RB suplementado con 12 mM CHIR99021, 10 mM inhibidor de la roca y el 0,1% de alcohol de polivinilo (PVA). Volver a suspender los esferoides y transferir todas las células de nuevo al matraz biorreactor. Añadir medio para hacer el volumen total de 100 ml. Reiniciar la agitación a 40 rpm durante 24 horas.
    Nota: RB medio es sensible a la luz. Cuando se trabaja con medio RB mantener el BSC a la luz apagada modo.
  10. Repita los pasos 3.7 a 3.8.
  11. Retirar con cuidado el sobrenadante y añadir 40 ml RB medio suplementado con 0,1% de PVA. Volver a suspender los esferoides y transferir todas las células de nuevo atbiorreactor que matraz. Añadir medio para hacer el volumen total de 100 ml. Reiniciar la agitación a 40 rpm durante 24 horas.
  12. Repita los pasos 3.7 a 3.8.
  13. Retirar con cuidado el sobrenadante y añadir 40 ml de medio suplementado con RB IWP2, purmorphamine y SB431542 (5 mM cada uno). Volver a suspender los esferoides y transferir todas las células de nuevo al matraz biorreactor. Añadir medio para hacer el volumen total de 100 ml. Reinicie agitación a 40 rpm durante 2 días.
  14. Repita los pasos 3.7-3.8.
  15. Retirar con cuidado el sobrenadante y añadir 40 ml de medio RB solamente. Volver a suspender los esferoides y transferir todas las células de nuevo al matraz biorreactor. Añadir medio para hacer el volumen total de 100 ml. Reiniciar la agitación a 40 rpm. esferoides que baten deben observarse 48 - 72 horas más tarde.
  16. Cambiar la mitad del medio cada 3 - 4 días con medio RB solamente al detener la agitación durante 5 - 10 min hasta que todos los esferoides han depositado en el fondo del recipiente. Retire cuidadosamente 50 ml de medio sin molestar a los esferoides y Carefully sustituir con 50 ml de medio RB fresco.

4. Diferenciación de hPSCs usando cultivos no adaptados a los pases de los organismos unicelulares

Nota: Este enfoque es específicamente útil para la diferenciación rápida de un gran número de líneas de HPSC sin tener que adaptarse a técnicas de cultivo de una sola célula, un proceso que consume enormemente mano de obra y tiempo. Esta técnica es aplicable a líneas celulares que son altamente sensibles a la disociación celular enzimática, tales como líneas HPSC recién establecidas.

  1. Iniciar el experimento con hPSCs cultivadas en MEF (como en la sección 1.3.2), que son aproximadamente el 70 - 80% de confluencia. Retire cualquier colonias diferenciadas utilizando el microscopio estereoscópico en el BSC.
  2. Retire medio y añadir 0,5 ml de solución de disociación (DS). Incubar durante 0,5 - 1 min hasta que las células MEF han redondeado hacia arriba y los bordes de las colonias hPSCs quedado claro. eliminar rápidamente DS y añadir 0,75 ml de colagenasa tipo IV (1 mg / ml).
  3. Incubarlas células durante 5 - 15 min a 37 ° C. Compruebe las células bajo el microscopio durante el período de incubación, y cuando las colonias enteras están empezando a levantar y separar, eliminar la colagenasa y añadir 1,5 ml de medio de células madre.
    Nota: Si después de 15 minutos la mayoría de las colonias están todavía unida, poner las células de nuevo a la incubadora. Compruebe las células bajo el microscopio cada 5 minutos. Tenga cuidado de no dejar las pilas en colagenasa durante más de 30 minutos. Si hay muchas colonias flotantes en la solución de colagenasa, no quite la colagenasa; sólo tiene que añadir 1 ml de medio de células madre.
  4. Con una pipeta P1,000, suavemente pipeta colonias para separar las colonias en su conjunto. No rompa las colonias en trozos pequeños. Transferencia de las células en un tubo de 15 ml con una pipeta de 5 ml. Lavar el bien con 1 ml de medio de células madre para recoger las células restantes para añadir al mismo tubo. Dejar durante 5 minutos hasta que todas las colonias han sedimentado (NO centrifugar).
  5. Retirar con cuidado el sobrenadante y añadir 2 ml medi células madreum suplementado con 100 ng / ml de bFGF. Transferencia de las células en una placa de fijación ultra baja usando 5 pipeta ml (1 ml en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y 3 ml en cada pocillo de una placa de 6 pocillos). Incubar a 37 ° C / 5% de CO 2 durante al menos 6 horas (máximo de 12 hr).
  6. Durante este tiempo, preparar el número necesario de pocillos / placas recubiertas con laminina para la etapa 4.7. ratios de transferencia de células confluentes recomendada es de 1 pocillo de una placa de 6 pocillos a 2 pocillos de una placa de 24 pocillos (o cantidad equivalente por unidad de superficie).
  7. Después de 6 horas, transferir cuidadosamente los agregados de colonias en un tubo de 15 ml con 5 ml pipeta. Lavar la placa con medio RB, a percibir los agregados restantes y añadir al mismo tubo de 15 ml (0,5 ml por pocillo de 24 pocillos y 1 ml por pocillo de placas de 6 pocillos). Espere 5 minutos hasta que el sedimento agregados, a continuación, aspirar cuidadosamente el sobrenadante. Tenga cuidado de no perturbar el sedimento suelto.
  8. Añadir 2 ml de medio RB suplementado con 12 mM CHIR99021 y transferir cuidadosamentecon una pipeta de 5 ml a sus pozos previamente preparada laminina recubierto (como en la Sección 1.2.4) para permitir que las células se unan.
  9. Después de 24 horas, retirar con cuidado el medio de cada pocillo y añadir 1 ml de medio RB solamente.
    Nota: Algunos de los agregados serán sólo muy débilmente unida a la placa de cultivo; Por lo tanto, es importante no eliminar los agregados grandes que puedan haberse soltado durante el procedimiento de cambio de medio. Es importante, sin embargo, para eliminar la mayor cantidad de la pequeña restos de células como sea posible.
  10. Después de 24 horas, retire con cuidado el medio y se añade medio suplementado con RB IWP2, purmorphamine y SB431542 (5 mM cada uno).
  11. Cambiar el medio después de 2 días con medio RB solamente. Las células se empiezan a superar día siguiente.
  12. Cambiar el medio cada 3 - 4 días con medio RB solamente.

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Representative Results

Con el fin de establecer un método simple para la diferenciación a gran escala de los cardiomiocitos de hPSCs, hemos creado un protocolo en el cual se trataron las células inicialmente con un activador de WNT / β-catenina (CHIR99021) 16 y, posteriormente, con inhibidores de la Wnt / β- catenina y factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) vías (IWP2 16 y SB431542 17, respectivamente) y, finalmente, un activador de la proteína sonic hedgehog (SHH) y la vía (purmorphamine) 17 (Figura 1A). En nuestra estrategia de diferenciación, aproximadamente el 50% de los esferoides (175 ± 25 micras de tamaño de diámetro esferoide) comenzó a latir de 7 días después de la iniciación de la diferenciación, que luego se aumentó a 100% por día 10. Curiosamente, el uso de este protocolo, se han observado esferoides diferenciadas para continuar batiendo hasta 60 días después del inicio de la diferenciación 18. Los estudios de población en esferoides disociadasexaminado por citometría de flujo reveló que al día 15, más de 90% de la población contenía células troponina cardíaca T positivo (cTnT +), mientras que menos del 12% de las células fueron positivas para el músculo liso y los marcadores endoteliales (3,1% von Willibrand Factor (vWF +), 8,4% de alfa-actina de músculo liso positivo (ASMA +)) 18. Hasta la fecha, el protocolo de diferenciación suspensión estática ha sido probado en las líneas de células madre 5 y 4 hiPSC, con salidas resultantes en aproximadamente el 90% de golpear esferoides de cada línea, mostrando la alta reproducibilidad de este protocolo entre las diferentes líneas HPSC (Figura 1B).

Con el fin de desarrollar una plataforma integrada para la producción a gran escala de los cardiomiocitos humanos, hemos aplicado nuestra estrategia de diferenciación suspensión estática a una suspensión agitada biorreactor (Figura 2A). Los esferoides diferenciadores mostraron un comportamiento similar en el biorreactor environment como en el sistema estático (figura 2B) y se observaron aproximadamente 100% de los esferoides que se latiendo a día 10 18. La inmunotinción en las secciones de vencer esferoides recogidos a día 30 utilizando anticuerpos contra cTnT y el factor de transcripción cardiaca NKX2-5, mostró expresión citoplásmica y nuclear de estas proteínas, respectivamente (Figura 2C). El rendimiento total de células en el cultivo en suspensión dinámica fue de aproximadamente 90 - 100 millones de células en 100 ml de volumen de trabajo después de 15 días de cultivo de diferenciación. Siendo este el caso, el rendimiento de los cardiomiocitos puede alcanzar hasta aproximadamente 54-90 million células (con el observado 60 - eficacia diferenciación 90%) de 20 millones de hPSCs de partida, inoculados en la fase de expansión hPSCs como células individuales. Se examinó adicionalmente las propiedades electrofisiológicas de cardiomiocitos diferenciados usando el método de patch clamp de célula única. Superando esferoides de los cultivos de biorreactor fueronse disocia en células individuales en el día 30 y los potenciales de acción registrados en células representativas utilizando toda la técnica de patch clamp de células. Los datos mostraron que la presencia de los tres tipos de células cardíacas principales (atrial-, nodal- y células ventriculares-like) en la población de células individuales 18.

Para las dos técnicas de diferenciación mencionados anteriormente, hPSCs necesitan ser adaptados a y / o libre de alimentador de una sola célula de cultivo en suspensión 19-21. Algunas líneas de HPSC sin embargo, son muy sensibles a la disociación celular enzimática y muestran significativa pérdida de la viabilidad celular después de la disociación, tal como se puede observar en las líneas hiPSC recién establecidas. Además, cuando se trabaja con grandes cohortes de líneas, la adaptación de todos a los enlaces de conexión y la cultura de una sola célula sería enormemente laborioso y requiere mucho tiempo. Para abordar estas cuestiones, esferoides no diferenciadas fueron reemplazados con los agregados de células no diferenciadas (Figura 3A).Nuestros datos muestran que el uso de esta técnica modificada, los clusters que baten aparecieron 7 días después de la iniciación diferenciación. La reproducibilidad de esta versión modificada se confirmó usando 42 líneas hiPSC, donde todas las líneas ensayadas generan un promedio de células de más de 60% ​​de cTnT + por día 15 para cada experimento realizado (Figura 3B). La inmunotinción utilizando anticuerpos contra la cTnT y NKX2-5 en racimos superando disociadas mostró la expresión citoplasmática y nuclear, respectivamente (Figura 3C).

Figura 1
Figura 1. Esquemática de los cardiomiocitos Diferenciación de hPSCs en suspensión estática y datos representativos. (A) Diseño experimental de hPSCs la diferenciación de los cardiomiocitos en el sistema de suspensión estática. (B) Evaluación de la eficacia dediferenciación cardiaca se mide contando el número de esferoides batiendo (%). Aquí se presentan los promedios de al menos 3 experimentos de diferenciación de células madre de cada uno de 5 y 4 líneas hiPSC 18. Promedio general de vencer esferoides de todas las líneas es de aproximadamente 90%. Las barras de error representan SD (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Esquema general de los cardiomiocitos Diferenciación de hPSCs en suspensión dinámica y datos representativos. (A) Diseño experimental de hPSCs la diferenciación de los cardiomiocitos en el sistema de suspensión dinámica. RI: inhibidor de la roca (B) Imagen de contraste de fase de los días 5 esferoides (r Representanteesultado de la línea de células madre Royan H5). Barra de escala de 200 micras (C) La inmunotinción de células madre deriva latiente esferoides seccionados en el día 30 para NKX2.5 y cTnT. La barra de escala 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Esquema general de los cardiomiocitos Diferenciación de hPSCs usando cultivos no adaptados a los pases de los organismos unicelulares. (A) Diseño experimental de hPSCs diferenciación de cardiomiocitos utilizando cultivos no adaptados a los pases de células individuales. (B) La citometría de flujo El análisis de los agregados disociadas mostrar en el promedio de las células más de 60% ​​de cTnT + en 42 líneas hiPSC probados. (C) inmunotinción de disociado cardiomiocitos derivados dehiPSCs para NKX2.5 y cTnT (resultado 646-4 representante de la línea hiPSC). La barra de escala 20 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los cardiomiocitos derivados de hPSCs son una fuente extremadamente atractivo para su uso en el modelado de la enfermedad humana, la detección de pruebas de drogas / toxicidad y, quizás en el futuro, las terapias regenerativas. Uno de los principales obstáculos para el uso de estas células, sin embargo, es la capacidad para proporcionar suficiente material de alta calidad para su uso efectivo. Utilizando nuestro protocolo descrito, ofrecemos un método que supera esta limitación.

Recientemente, se han descrito moléculas pequeñas sintéticas dirigidas a las vías de señalización específicos implicados en la cardiogénesis para mejorar 16,17,22,23 diferenciación cardiaca. Estos se utilizan ahora como una alternativa a las citoquinas recombinantes y suero, que contiene muchos factores no definidos y que muestra la variación de lotes. La principal ventaja de una pequeña molécula de protocolo, que no sea su especificidad, es que es de bajo costo y factores de componentes generalmente tienen un prolongado tiempo de conservación en comparación con medios que contienen citoquinas o factores de crecimiento. Como las pequeñas moléculas utilizadas en el protocolo reportado son agentes de bajo peso molecular, que son estructuralmente y funcionalmente definidos y pueden difundirse fácilmente a través de la membrana celular 24,25.

Hasta ahora, los diferentes métodos se han aplicado a hPSCs el fin de establecer sólidas técnicas de diferenciación, escalables; Sin embargo, la mayoría de estos métodos se han establecido como 2D y cultivos estáticos a pequeña escala, lo que puede ofrecer una pobre capacidad de ampliación y homogeneidad. Técnicas tales como la agregación forzada, las tecnologías de micro-impresión y culturas micro-portadoras 26-29 están entrando en uso, pero a pesar de algunos avances en este campo, estos métodos están todavía lejos de proporcionar el número de células necesarias para su uso en alta Exigir sistemas. reproducibilidad y escalabilidad limitada o no probada, y los altos costos debido a la necesidad de que los medios de comunicación costosos (mTeSR1 o StemPro-34) o micro-soportes tanto para la expansión de hPSCs y su diferenciación dirigida a Cardiomyocytes 30,31, son los inconvenientes del uso de estos métodos en tecnologías hPSCs de alto rendimiento.

En este estudio, hemos reportado un protocolo simple, robusta y escalable para la producción de cardiomiocitos derivados de HPSC. La reproducibilidad de este protocolo ha sido validado con más de 40 líneas HPSC diferentes, el más extenso de validación notificada hasta la fecha. En comparación con los protocolos de suspensión se informó anteriormente, este método presenta grandes ventajas en términos de escalabilidad, la reproducibilidad, la asequibilidad, la eficacia y la funcionalidad de los cardiomiocitos generados. El éxito de nuestro protocolo de diferenciación es dependiente a fondo en la alta calidad de los hPSCs utilizados para el estudio. Por lo tanto es crucial para comprobar cariotipo de cada línea y la expresión de alto y sostenido de los marcadores de pluripotencia por inmunotinción y PCR antes de comenzar el experimento. En particular, cuando el cultivo de células en el biorreactor, es crucial usar hPSCs que han been a pases a nivel de una sola célula durante al menos tres pasajes antes del inicio de la diferenciación. En nuestros protocolos hemos utilizado esferoides con un tamaño medio de 175 ± 25 micras, que eran esferoides generados después de 5 días. El día que los esferoides cumplen esta restricción de tamaño puede variar dependiendo de la tasa de crecimiento de las líneas de HPSC individuales; por lo tanto, es importante que el tamaño, más que el día de crecimiento, se toma en consideración.

Este protocolo también se puede manipular para llegar a ser adecuado para líneas de células sensibles y grandes cohortes de líneas HPSC. Aunque este protocolo resultados en cardiomiocitos altamente enriquecido, la pureza se puede mejorar mediante la combinación del protocolo de diferenciación con un método de selección metabólica tal como el medio de lactato enriquecido en 32. Además, las mejoras en la maduración y funcionalidad de los cardiomiocitos derivados descritos en este protocolo pueden ser aplicadas por la generación de tres dimensiones, alineado cardiaca33 tejidos. Una de las limitaciones de este protocolo es que los subtipos particulares de los cardiomiocitos no se generan específicamente, simplemente una mezcla de auricular, ventricular y las células ganglionares. Se necesita más investigación en este campo para desarrollar protocolos de diferenciación que pueden producir cardiomiocitos específicos de subtipo altamente enriquecido en gran escala. Aunque algunos protocolos de pequeña escala se han desarrollado hasta la fecha, tendrían que ser sometido a pruebas rigurosas para asegurar ampliación es posible 34 los métodos.

El desarrollo de este tipo de plataformas integradas puede ser considerada como un paso importante hacia la comercialización de tecnologías de cardiomiocitos derivados de HPSC para la clínica, farmacéutica, la ingeniería de tejidos y órganos in vitro en aplicaciones de desarrollo / organoides.

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Disclosures

El Chang Instituto de Investigación Cardíaca Victor no se involucra en, ni aprueba, la destrucción de embriones humanos para la investigación. Su contribución a este estudio se limitó a trabajar en células madre pluripotentes inducidas por el hombre.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Knockout DMEM Life Technologies 10829018
Knockout Serum Replacement (KO-SR) Life Technologies 10828028
Glutamax Life Technologies 35050061
MEM Non-essential Amino Acids Life Technologies 11140-050
β-Mercaptoethanol Life Technologies 21985-023
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) Miltenyi Biotec 130-093-843
RPMI1640 Life Technologies 11875093
DPBS, no calcium, no magnesium Life Technologies 14190144
DPBS Life Technologies 14287072
Attachment Factor (AF) Life Technologies S006100
ECM Gel Sigma-Aldrich E1270
Laminin Invitrogen 23017-015
DMEM Life Technologies 11965-092                                                                                                       
Fatal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16140-071
B27 minus insulin Gibco A18956-01
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070063
0.05% Trypsin/EDTA Life Technologies 25300-054
Collagenase Type IV Life Technologies 17140-019
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C7902
Mitomycin C Bioaustralis BIA-M1183
CHIR99021 Miltenyi Biotec 130-104-172
IWP2 Miltenyi Biotec 130-105-335
SB431542 Miltenyi Biotec 130-095-561
Purmorphamine Miltenyi Biotec 130-104-465
ROCK inhibitor Y-27632 Miltenyi Biotec 130-104-169
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E6758
Poly Vinyl Alcohol (PVA) Sigma-Aldrich 363073
Gelatin Sigma-Aldrich G1890
Trypan Blue Bio-Rad 145-0013
Accumax  Innovative Cell Technologies Inc. AM105
Sigmacote  Sigma-Aldrich SL2 
CELLSPIN Integra Biosciences 183 001
Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml  Integra Biosciences 182 023
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) Prepared in-house (or commercially available)
Human pluripotent stem cell (hPSC) lines Prepared in-house (or commercially available)

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References

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Fonoudi, H., Ansari, H., Abbasalizadeh, S., Blue, G. M., Aghdami, N., Winlaw, D. S., Harvey, R. P., Bosman, A., Baharvand, H. Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol. J. Vis. Exp. (113), e54276, doi:10.3791/54276 (2016).

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