Abstract
Максимизация выгоды человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) для проведения исследований, моделирования болезней, фармацевтических и клинических применений требуются надежные методы для крупномасштабного производства функциональных типов клеток, включая кардиомиоциты. Здесь показано, что временное манипулирование WNT, TGF-бета, и SHH сигнальных путей приводит к высокоэффективным кардиомиоциты дифференцировка одноклеточных пассированными линий HPSC как в статической суспензии и перемешивали систем подвески в биореакторе. Используя эту стратегию, привела к ~ 100% избиение сфероидов, последовательно содержащие> 80% сердечного тропонина Т-позитивных клеток после 15 дней культивирования, заверенной в нескольких строках HPSC. Мы также сообщаем о вариации этого протокола для использования с клеточными линиями в настоящее время не приспособленных к одноклеточным пассажей, успех которого проверяется в 42 строках HPSC. Кардиомиоциты, генерируемые с помощью этих протоколов экспресс маркеров клональные конкретных и шоу ожидается electrophysiological функциональные возможности. Наш протокол представляет собой простую, эффективную и надежную платформу для крупномасштабного производства человеческих кардиомиоцитов.
Introduction
Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs), в том числе человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), обладают способностью к самообновлению и способностью дифференцироваться в клетки трех эмбриональных зародышевых листков 1,2. Благодаря этим характеристикам, hPSCs обеспечивают ценную и неограниченный источник для генерации и масштабируемой производства болезней релевантных типов клеток для моделирования заболевания человека 3-5, для высокой пропускной способности скрининга лекарственных средств и токсичности анализов 6,7 и потенциально для клинического применения 8 , Генерация кардиомиоцитов из hPSCs дает возможность конкретно исследовать механизмы сложных сердечно-сосудистых заболеваний человека и их возможные процедуры, ранее выходящие за рамки наших возможностей из-за отсутствия соответствующих моделей животных и / или наличия пострадавших первичных тканей.
Все вышеупомянутые применения hPSCs пecessitate производство огромного количества высокообогащенного и функциональных кардиомиоцитов. Таким образом, наличие эффективной, воспроизводимый и масштабируемый в пробирке сердца протокола дифференцировки подходит для нескольких линий HPSC имеет решающее значение. Обычные протоколы кардиомиоцитов дифференциации использовали различные стратегии , такие как формирование эмбриоидного тела 9, 10 методов совместного культивирования, индукцию с коктейлями цитокинов 11 и методов белка трансдукции 12. Несмотря на достижения в области этих технологий, большинство по-прежнему страдают от низкой эффективности, требуют дорогих факторов роста, или предлагают ограниченную универсальность при попытке использовать несколько строк HPSC. На сегодняшний день эти проблемы установили пределы производства HPSC-производных кардиомиоцитов для исследований клеточной терапии на животных моделях, а также в фармацевтической промышленности для обнаружения наркотиков 13. Поэтому разработка надежных и доступных методов для большого-scale производство функциональных HPSC-производных кардиомиоцитов в масштабируемых системах культивирования будет в значительной степени способствовать их коммерческих и клинических приложений.
В этой рукописи, мы сообщаем о разработке экономически эффективной и комплексной сердечной системы дифференциации с высокой эффективностью, воспроизводимости и применимости к ЭСК и hiPSCs, генерируемых из различных источников и методов культуры, в том числе метод для крупномасштабного производства высокообогащенного обогащенные популяции HPSC-производных кардиомиоцитов с использованием биореактора. Кроме того, мы оптимизировали этот протокол для линий HPSC не приспособленных к фидерных свободных и / или отдельно взятой культуре клеток, таких как вновь созданных hiPSCs или больших когорт HPSC линий, имеющих отношение к анализу механизма заболевания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка культуральной среды, покрытия клеточной культуры пластин и поддержания недифференцированных hPSCs
- Медиа Подготовка
Примечание: Стерилизовать носитель с помощью устройства 0,22 мкм фильтрации и хранят при 4 ° С в защищенном от света до 4 -х недель. Имена Реагент, поставщиков и номера по каталогу приведены в таблице материалов.- Для получения эмбриональных фибробластов мыши (MEF) Medium, смешайте 445 мл DMEM, 50 мл эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 5 мл среды для культивирования клеток (например, GlutaMAX).
- Для чЭСК среды, смешайте 390 мл Нокаут-DMEM (КО-DMEM), 100 мл Knockout Serum Замена (KO-SR), 5 мл среды для культивирования клеток, 5 мл MEM минимально необходимого раствора аминокислот и 0,5 мл 55 мМ бета-меркаптоэтанола.
ВНИМАНИЕ: β-меркаптоэтанол является токсичным. Избегайте вдыхания, проглатывания и контакта с кожей. - Для RPMI-B27 (RB) Medium, смешайте 475 мл RPMI 1640, 10 мл B27 минусинсулин, 5 мл среды для культивирования клеток, 5 мл МЕМ минимального основного раствора аминокислот, 5 мл пенициллина / стрептомицина и 0,5 мл 55 мМ β-меркаптоэтанола.
- Для решения диссоциацией (DS), смешайте 10 мл 0,05% трипсина, 4 мл КО-SR, 1 мл типа коллагеназы IV (1 мг / мл), 5 мл КО-DMEM и 20 мкл CaCl 2 (1 М).
- Для фидера-кондиционированную среду клеток, добавляют 15 мл чЭСК среду (не содержащую bFGF) до Т75 колбу с кон фл uent фидерные клетки (MEF или фибробласты крайней плоти человека), которые были ранее инактивированные обработкой либо митомицином С или облучением. Урожай кондиционированной среды после 24 часов и заменить свежим чЭСК среды. Клетки могут быть использованы в течение 2 недель.
- Покрытие клеточной культуры Тарелки
- ECM гель покрытия:
- При покупке, растопить экстракт ECM гель при 4 ° С до тех пор, пока в равномерно последовательной жидком состоянии, в соответствии с инструкциями изготовителя. Развести в соотношении1: 2 в холодной КО-DMEM среде, аликвоты и хранят при -20 ° С.
Примечание: Во время подготовки геля ECM, хранить все материалы , необходимые для использования в aliquotting и покрытия процедуры холода. Концентрация ЕСМ геля изменяется с номером партии. Убедитесь, что концентрация отмечается на аликвоты. Порции могут храниться при температуре -20 ° С в течение до 6 месяцев. - Растаяйте гель аликвоты ECM при 4 ° С. Когда размораживают, добавить холодную среду КО-DMEM для конечной концентрации 0,34 мг / мл. Пипетка хорошо и добавить 0,75 мл в расчете на одну лунку 6-луночного планшета. Инкубировать в течение 1 часа при 37 ° С.
- При покупке, растопить экстракт ECM гель при 4 ° С до тех пор, пока в равномерно последовательной жидком состоянии, в соответствии с инструкциями изготовителя. Развести в соотношении1: 2 в холодной КО-DMEM среде, аликвоты и хранят при -20 ° С.
- Митотически инактивированная мышиных эмбриональных фибробластов Фидер Cell (MEF) Покрытие
Примечание:. Приготовление фидерных клеток MEF было описано ранее 14- Шерсть 6-луночный культуральный планшет с Factor Attachment (AF) или 0,1% желатина (этап 1.2.3) при комнатной температуре в течение 5 мин (0,75 мл на одну лунку 6-луночного планшета).Удалить и оставить пластину в шкафу биологической безопасности (BSC), чтобы высохнуть.
- Оттепель MEF путем переноса замороженного пузырек C водяной бане при 37 ° в течение приблизительно 2 - 3 мин.
- Добавить 7 мл MEF среды в 15 мл пробирку. Когда пробирка клеток размораживают, медленно перенесите содержимое в 15 мл пробирку. Центрифуга при 300 мкг в течение 4 мин. Аспирируйте супернатант и клетки вновь суспендируют в среде MEF.
- Граф клеток и пластины 1 × 10 6 клеток на 6 - луночного планшета (~ 1,7 × 10 5 клеток / лунку). Переход к 37 ° С / 5% СО 2 инкубатора и позволяют клеткам прикрепляться O / N перед использованием.
- Желатин Покрытие:
- Растворите 1 г желатина порошка в сверхчистой воде, чтобы сделать на 0,1% (вес / объем) раствора. Инкубировать в течение 15 мин при 37 ° С, затем автоклав раствор при 121 ° С в течение 15 мин. При охлаждении, добавить в требуемое количество лунок (0,75 мл на одну лунку 6-луночного планшета) и инкубируют в течение 15 мин при 37 ° С.
- Растворите 1 г желатина порошка в сверхчистой воде, чтобы сделать на 0,1% (вес / объем) раствора. Инкубировать в течение 15 мин при 37 ° С, затем автоклав раствор при 121 ° С в течение 15 мин. При охлаждении, добавить в требуемое количество лунок (0,75 мл на одну лунку 6-луночного планшета) и инкубируют в течение 15 мин при 37 ° С.
- Laminin Покрытие:
- Растаяйте ламинин (1 мг / мл) при 4 ° С до тех пор, пока размораживали. К 5 мкл раствора ламинин, прибавляют 1 мл холодного PBS. Пипетка хорошо затем добавить к требуемое количество лунок (0,75 мл на одну лунку 6-луночного планшета) и инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С.
- Покрытие силиконом вращающаяся колба внутренней поверхности:
- Тщательно вымойте вращающуюся колбу емкостью 100 мл (1 стаканом маятника) с дистиллированной водой, используя щетку для очистки, чтобы удалить пыль и / или остатки культуры. Залить 70% -ным этанолом и после 30 мин сполоснуть дистиллированной водой. Добавьте 5 М NaOH и оставить O / N.
- Удалить раствор NaOH и промойте колбу под проточной водой в течение 5 мин. Наполните колбу с 1 М HCl и оставить на 15 мин. Промыть колбу с проточной водой в течение 5 мин, затем дважды с дважды дистиллированной водой, чтобы полностьюудалить все следы HCl. Оставьте колбу, чтобы полностью высохнуть в BSC.
- Добавить 1,5 мл раствора силиконизации в колбу и вращать в горизонтальном направлении, чтобы покрыть все поверхности. Повторите ту же процедуру для стекольной маятника.
- Нагревают колбу с покрытием в сухом сушильном шкафу при 100 ° С в течение 1 ч или дать высохнуть O / N при комнатной температуре. При нагревании в печи, оставляют охлаждаться до комнатной температуры в течение 30 - 60 мин.
- Смыва колбы 3 раза деионизированной водой в течение 15 мин каждый раз, а затем стерилизовать автоклавированием при 121 ° С в течение 20 мин.
- ECM гель покрытия:
- Обслуживание недифференцированных hPSCs
Примечание: Для каждого из протоколов , описанных, если это специально не оговорено особо, клетки выращивают и культивировали в лунках 6-луночные культуральные планшеты и объемы будут даны подходящим для этого формата.- hPSCs культивированные как Недифференцированная сфероидов в статической системе подвески
Примечание: Клетки , используемые в этих шагах уже должны быть адаптированы кодноклеточный культура. 15- Начало эксперимента с hPSCs культивировали на ЕСМ геле в культуральной пластины 6-луночного приблизительно 70 - 80% сплошности. Удалите все дифференцированные колонии с помощью стереомикроскопа в BSC. Добавить ингибитор ROCK 10 мкМ Y-27632 и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 1 часа.
Примечание: Для удаления дифференцированных колоний, использовать наконечник пипетки , чтобы снять и осторожно удалить все дифференцированные части вручную под стереомикроскопа. Будьте осторожны, чтобы не удалить недифференцированных колоний. - Удалить клетки из инкубатора и аспирата среды. Вымойте клеток с 1 мл PBS, удалить и добавить 0,5 мл клеточной диссоциации фермента. Инкубируйте клетки в течение 4 - 5 мин при 37 ° С.
- Добавляют 1 мл чЭСК среды и сбора клеток с помощью клеточного скребка. Диссоциируют клетки на отдельные клетки, используя p1,000 пипетку. Количество жизнеспособных клеток с использованием трипанового синего и гемоцитометра.
- Ресуспендируют клетки до 2 × 10 5 жизнеспособных CЭЛЕЙ / мл в фидерных клеток среды, кондиционированной с добавлением 100 нг / мл bFGF и 10 мкМ ингибитора ROCK Y-27632. Передача клеток в сверхмалых пластин крепления с помощью 5 мл пипетки (3 мл на лунку 6-луночного планшета).
- Через 2 дня, тщательно удалить клетки из инкубатора и аспирата половины среды (примерно 1,5 мл). Заменить свежей кондиционированной среды, дополненной 100 нг / мл bFGF.
- Изменение половины среды каждый день с кондиционированной средой не дополненной 100 нг / мл bFGF до дня 5. Теперь, либо дальнейшей культуре клеток, проход для дальнейшего недифференцированной культуры (этап 1.3.1.2 - 5), или использовать для сердечной дифференциации (Раздел 2 ). , Если продолжение культуры, прохождение клеток каждые 4 - 8 дней.
- Начало эксперимента с hPSCs культивировали на ЕСМ геле в культуральной пластины 6-луночного приблизительно 70 - 80% сплошности. Удалите все дифференцированные колонии с помощью стереомикроскопа в BSC. Добавить ингибитор ROCK 10 мкМ Y-27632 и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 1 часа.
- hPSCs культивируют на фидерных клеток и пассировать Использование коллагеназы типа IV
- Перед пересева hPSCs, удалите дифференцированные колонии с помощью стереомикроскопа в BSC. Аспирируйте средних и мыть клетки с 1 млPBS на лунку. Удалить и затем добавить 0,75 мл типа коллагеназы IV (1 мг / мл) и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 5 - 15 мин, как это требуется, чтобы иметь края колоний начинают отслаиваться.
- Отберите коллагеназы и добавляют 1 мл ЭСК среды на лунку. Отделить колонии небольших кластеров, используя клеточным скребком, а затем перенести клетки с использованием p1,000 пипеткой в 15 мл пробирку. Будьте осторожны, чтобы не разбить кластеры на мелкие кусочки.
- Промыть хорошо с 1 мл чЭСК среды, чтобы собрать оставшиеся клетки и добавляют к 15 мл трубки. Центрифуга при 100 мкг в течение 2 мин. Аспирата супернатант и ресуспендирования клеток в чЭСК среде, дополненной 100 нг / мл bFGF.
- Снять пластину с MEF с покрытием из инкубатора и аспирата MEF среды. Передача клеток при соотношении от 1: 3 до 1:10, в зависимости от обстоятельств. Изменение средней ежедневно свежей чЭСК среде, дополненной 100 нг / мл bFGF. Прохождение клетки каждые 4 - 8 дней.
- hPSCs культивированные как Недифференцированная сфероидов в статической системе подвески
2. Differentiданию hPSCs как сфероидов в статической системе подвески
- Начать эксперимент с использованием 5-й день недифференцированные сфероиды, полученного в разделе 1.3.1.
Примечание: На этом этапе, средний размер сфероидов должно быть 175 ± 25 мкм. Минимум 50 сфероидов следует использовать при запуске дифференцировки эксперимента. - Передача сфероидов в 15 мл пробирку с помощью 5 мл пипетки. Промыть хорошо с 1 мл RB среды, чтобы собрать все оставшиеся сфероиды и добавить к той же 15 мл трубки. Оставьте клетки в течение 5 мин, пока сфероиды не осаждаются, образуя рыхлый осадок (НЕ центрифуге). Аспирируйте супернатант, стараясь не принимать каких-либо сфероидов.
- Добавьте 3 мл RB среду, дополненную 12 мкМ CHIR99021. Передача клетки обратно в одну лунку 6-луночного планшета со сверхнизким крепления. Через 24 часа, повторите шаг 2.2.
Примечание: RB среда чувствительна к свету. При работе с RB среды, держать BSC свет выключен. - дд 3 мл Р.Б. среды до клеточного осадка. Передача клетки обратно в одну лунку 6-луночного планшета со сверхнизким крепления. Через 24 часа, повторите шаг 2.2.
- Добавьте 3 мл RB среду, дополненную IWP2, purmorphamine и SB431542 (5 мкМ каждого). Передача клетки обратно в одну лунку 6-луночного планшета со сверхнизким крепления. Через 2 дня повторите шаг 2.2.
- Ресуспендируют клеток в 3 мл среды РБ и передачи на пластине желатин покрытием, чтобы позволить клеткам прикрепляться.
Примечание: На этой стадии, клетки также могут быть сохранены в виде суспензии. Для продолжения со статической суспензионной культуре, перенесите клетки обратно к пластине сверхнизким крепления. - Изменение среды с 3 мл среды РБ после 2-х дней. Культуры начнут бить следующий день. Изменение носителя через каждые 3 - 4 дней с РБ среды.
3. Дифференциация hPSCs как сфероидов в перемешиваемой суспензии биореактора
- Начните эксперимент с недифференцированной сфероидов культурыd в статической суспензии, по крайней мере, 3-х пассажей (смотри раздел 1.3.1). Добавить ингибитор ROCK 10 мкМ Y-27632 и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 1 часа.
- Удалить клетки из инкубатора и передавать все сфероиды в 15 мл пробирку с помощью 5 мл пипетки. Промыть хорошо с 1 мл чЭСК среды, чтобы собрать все оставшиеся сфероиды и добавить к той же 15 мл трубки. Оставьте клетки в течение 5 мин, пока сфероиды не осаждаются, образуя рыхлый осадок (НЕ центрифуге). Аспирируйте супернатант, стараясь не принимать каких-либо сфероидов.
- Промывают клетки путем добавления 1 мл PBS. Оставьте на 5 минут, пока сфероиды не осаждаются, образуя рыхлый осадок (НЕ центрифуге). Удалить супернатант и добавляют 0,5 мл 0,05% трипсина плюс 0,53 мМ ЭДТА. Инкубируйте клетки в течение 4 - 5 мин при 37 ° С.
- Удалить клетки из инкубатора и добавить 1 мл чЭСК среды. Использование p1,000 пипетки, диссоциируют клетки на отдельные клетки, подсчет клеток с использованием трипанового синего и гемоцитометра. Ресуспендируют до 2 × 10 5 viabле клеток / мл в кондиционированной среде, дополненной 100 нг / мл bFGF и 10 мкМ ингибитора ROCK Y-27632.
- Перенести 100 мл суспензии клеток в биореакторе силиконизированный колбу с 1 маятником (см раздел 1.2.5). Начните с 35 оборотов в минуту и перемешивании после увеличения 24 ч до 40 оборотов в минуту.
- Через 48 ч прекратить перемешивание в течение 5 - 10 мин, пока все сфероиды не осели на дно колбы. Заменить половину среды с кондиционированной средой, дополненной 100 нг / мл bFGF. Повторите тот же самый процесс каждые 24 ч до 5-й день.
Примечание: На данном этапе, недифференцированные сфероиды со средним размером 175 ± 25 мкм должна быть сформирована. - Прекратить перемешивание в течение 5 - 10 мин, пока все сфероиды не осели на дно колбы. Передача всех сфероидов в 50 мл пробирку в минимальном количестве среды (менее 50 мл). Выбросьте оставшуюся среду в биореакторе колбу, тщательно обеспечивая не сфероиды не остаются в сосуде.
- Leavе в течение 5 - 10 мин, пока все сфероиды не осели на дно 50 мл пробирку затем осторожно удалите супернатант, не нарушая свободную осадок клеток. Промывают 25 мл PBS с кальцием и магнием или RB среды, а затем снова уйти в течение 5 - 10 мин, пока все сфероиды не осели на дно 50 мл трубки, чтобы снова образовать рыхлый осадок.
- Осторожно удалите супернатант и добавьте 40 мл RB среду, дополненную 12 мкМ CHIR99021, ингибитор Rock 10 мкМ и 0,1% поливинилового спирта (ПВС). Ресуспендируют сфероидов и передать все клетки обратно в биореактор колбу. Добавить среду, чтобы общий объем 100 мл. Перезапустите перемешивание при 40 оборотах в минуту в течение 24 часов.
Примечание: RB среда чувствительна к свету. При работе с RB среды держать BSC в свет выключается режим. - Повторите шаги 3.7 - 3.8.
- Осторожно удалите супернатант и добавьте 40 мл RB среду, дополненную 0,1% PVA. Ресуспендируют сфероидов и передать все клетки обратно в тон биореактор колбу. Добавить среду, чтобы общий объем 100 мл. Перезапустите перемешивание при 40 оборотах в минуту в течение 24 часов.
- Повторите шаги 3.7 - 3.8.
- Осторожно удалите супернатант и добавьте 40 мл RB среду, дополненную IWP2, purmorphamine и SB431542 (5 мкМ каждого). Ресуспендируют сфероидов и передать все клетки обратно в биореактор колбу. Добавить среду, чтобы общий объем 100 мл. Перезапустите перемешивание при 40 оборотах в минуту в течение 2-х дней.
- Повторите шаги 3.7-3.8.
- Осторожно удалите супернатант и добавьте 40 мл RB только среду. Ресуспендируют сфероидов и передать все клетки обратно в биореактор колбу. Добавить среду, чтобы общий объем 100 мл. Перезапуск перемешивание при 40 оборотах в минуту. Избиение сфероиды следует соблюдать 48 - 72 ч позже.
- Изменение половину среды через каждые 3 - 4 дней с RB средой только прекратить перемешивание в течение 5 - 10 мин, пока все сфероиды не осели на дно сосуда. Осторожно удалите 50 мл среды, не нарушая сфероидов и carefully заменить 50 мл свежей среды РБ.
4. Разграничение hPSCs Использование культур не адаптированы к одноклеточ- пассажей
Примечание: Этот подход особенно полезно для быстрой дифференциации большого количества HPSC линий без необходимости адаптироваться к методам культивирования одноклеточных, процесса чрезвычайно трудоемкой и требует много времени. Этот метод применим к клеточных линий, которые очень чувствительны к ферментативной диссоциации клеток, таких, как вновь созданных линий HPSC.
- Начните эксперимент с hPSCs культивировали на MEF (как описано в разделе 1.3.2), которые примерно на 70 - 80% сплошности. Удалите все дифференцированные колонии с помощью стереомикроскопа в BSC.
- Удалить средний и добавьте 0,5 мл диссоциация раствора (DS). Выдержите в течение 0,5 - 1 мин, пока MEF клетки не округляется, а края hPSCs колоний стало ясно. Быстро удалить DS и добавить 0,75 мл типа коллагеназы IV (1 мг / мл).
- высиживатьклетки в течение 5 - 15 мин при температуре 37 ° С. Проверьте клетки под микроскопом, в течение инкубационного периода, и когда целые колонии начинают отрываться и отсоединить, удалить коллагеназы и добавить 1,5 мл чЭСК среды.
Примечание: Если после 15 минут большинство колоний все еще прикреплены, положить клетки обратно в инкубатор. Проверьте клетки под микроскопом, через каждые 5 мин. Будьте осторожны, чтобы не оставить клетки в коллагеназы в течение более 30 мин. Если есть много плавающих колоний в растворе коллагеназы, не удаляйте коллагеназы; просто добавьте 1 мл чЭСК среды. - Используя p1,000 пипетку, аккуратно пипеткой колонии отделяться, как целые колонии. Не ломайте колонии на мелкие кусочки. Передача клеток в 15 мл пробирку с помощью 5 мл пипетки. Промыть скважину с 1 мл чЭСК среды, чтобы собрать оставшиеся клетки, чтобы добавить к той же трубе. Оставьте на 5 минут, пока все колонии не осаждаются (НЕ центрифуге).
- Осторожно удалите супернатант и добавьте 2 мл чЭСК Mediмкм с добавлением 100 нг / мл bFGF. Перенести клетки в ультранизким монтажной пластине с использованием 5 мл пипеткой (1 мл в каждую лунку 24-луночного планшета и 3 мл в каждую лунку 6-луночного планшета). Инкубировать при 37 ° C / 5% CO 2 в течение по крайней мере 6 часов (максимум 12 часов).
- За это время подготовить необходимое количество ламинин покрытием скважин / плиты для стадии 4.7. Коэффициенты передачи Рекомендуемый клеточные 1 сливающийся лунку 6-луночного планшета на 2 лунки 24-луночного планшета (или эквивалентное количество на единицу площади поверхности).
- Через 6 ч, тщательно передачи агрегированных колонию в 15 мл пробирку с использованием 5 мл пипетку. Промыть пластины с RB средой для сбора любых оставшихся агрегатов и добавить к той же 15 мл трубки (0,5 мл на лунку в течение 24-луночного и 1 мл на лунку в течение 6-луночные планшеты). Подождите 5 минут, пока осадка агрегатов, а затем тщательно аспирата супернатант. Будьте осторожны, чтобы не нарушить свободную гранул.
- Добавляют 2 мл RB среде с добавлением 12 мкМ CHIR99021 и тщательно передачис 5 мл пипетки на предварительно подготовленный ламинин покрытием скважин (как описано в разделе 1.2.4), чтобы позволить клеткам прикрепляться.
- Через 24 часа, осторожно удалите среду в каждую лунку и добавляют 1 мл RB только среду.
Примечание: Некоторые из агрегатов будет только придает очень слабо к культуре пластины; Поэтому важно, чтобы не удалить крупные агрегаты, которые, возможно, отсоединился во время процедуры замены среды. Важно, однако, чтобы удалить как можно больше тонкой остатков клеток, как это возможно. - Через 24 часа, осторожно удалите среду и добавьте RB среду, дополненную IWP2, purmorphamine и SB431542 (5 мкМ каждого).
- Изменение среды после 2-х дней только с RB средой. Клетки начнут бить следующий день.
- Изменение среды каждые 3 - 4 дней только с RB средой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для того чтобы установить простой метод для крупномасштабной дифференциации кардиомиоцитов из hPSCs, мы создали протокол , в котором клетки обрабатывали сначала с Wnt / β-катенина активатора (CHIR99021) 16 , а затем с ингибиторами Wnt / β- катенин и трансформирующий фактор роста β (TGF-β) пути (IWP2 16 и SB431542 17, соответственно) и , наконец , активатор еж Соник (SHH) пути (purmorphamine) 17 (Рис . 1А) В нашей стратегии дифференциации, примерно 50% от сфероидов (175 ± 25 мкм диаметр сфероида размер) начал бить через 7 дней после начала дифференциации, которая затем увеличилась до 100% на 10 день Интересно, что с помощью этого протокола, были обнаружены дифференцированные сфероиды продолжать избиение до 60 дней после того, как начала дифференцировки 18. Демографические исследования по диссоциированных сфероидовисследовали методом проточной цитометрии показал , что в 15 -й день, более 90% населения содержали сердечного тропонина Т положительный (cTnT +) клетки, в то время как менее 12% клеток были положительными для гладких мышц и эндотелиальных маркеров (3,1% фон Willibrand Factor (фВ +), 8,4% альфа - актин гладких мышц-положительным (+ Асма)) 18. На сегодняшний день, статический протокол подвески дифференциации был протестирован на 5 чЭСК и 4 hiPSC линий, с выходами в результате чего примерно 90% в избиении сфероидов из каждой строки, показывая высокую воспроизводимость этого протокола между различными HPSC линиями (рис 1B).
Для того , чтобы разработать интегрированную платформу для крупномасштабного производства человеческих кардиомиоцитов, мы применили нашу статическую стратегию подвески дифференциации к перемешиваемой суспензии биореактора (рис 2А). В дифференцирующие сфероиды показали аналогичное поведение в биореакторе еnvironment как в статической системе (рис 2В) и наблюдались приблизительно 100% от сфероидов быть стучались в 10 -й день 18. Иммунологическое в секциях взбивания сфероиды , собранных на 30 -й день с использованием антител против cTnT и сердечного фактора транскрипции Nkx2-5, показал , цитоплазматической и ядерной экспрессии этих белков, соответственно (рис 2С). Общий выход клеток в суспензионной культуре динамической составляла примерно 90 - 100 миллионов клеток в 100 мл рабочего объема после 15 дней культивирования для дифференцировки. При этом, как в случае, выход кардиомиоцитов может доходить до примерно 54-90 миллионов клеток (с наблюдаемой 60 - 90% дифференциации эффективности) от 20 миллионов исходных hPSCs, привитых в фазу hPSCs расширения в виде отдельных клеток. Мы дополнительно исследовали электрофизиологические свойства дифференцированных кардиомиоцитов с использованием одноклеточного метода патч зажим. Избиение сфероидов из биореактора культурраспадается на отдельные клетки в день 30 и потенциалов действия, записанные на репрезентативных клеток с использованием всей клетки патч технику зажима. Данные показали наличие трех основных типов клеток сердца (atrial-, nodal- и желудочковой-подобных клеток) в популяции отдельных клеток 18.
Для двух методов дифференциации , упомянутых выше, hPSCs должны быть адаптированы к фидерной свободной и / или одной клеточной суспензии культуры 19-21. Некоторые линии HPSC однако, очень чувствительны к ферментативной клеточной диссоциации и показывают значительные потери жизнеспособности клеток после диссоциации, например, можно наблюдать во вновь созданных линий hiPSC. Кроме того, при работе с большими когорт линий, адаптируя все фидерных свободных и одноклеточного культуры будет чрезвычайно трудоемкий и отнимает много времени. Для решения этих проблем, недифференцированные сфероиды были заменены недифференцированных клеточных агрегатов (рис 3А).Наши данные показывают, что с помощью этой модифицированной техники, бьющие кластеры появились через 7 дней после начала дифференцировки. Воспроизводимость данного модифицированного варианта была подтверждена с помощью 42 hiPSC линий, где все протестированные линии , сгенерированные в среднем более чем на 60% cTnT + клеток на 15 день для каждого эксперимента , выполненного (фигура 3В). Иммуноокрашивание с использованием антител против cTnT и Nkx2-5 в диссоциированных бьющих кластеров показал цитоплазматической и ядерной экспрессии, соответственно (рис 3C).
Рисунок 1. Схема кардиомиоцитов дифференциацию от hPSCs в статическом Suspension и репрезентативных данных. (А) Экспериментальный дизайн hPSCs дифференциации в кардиомиоциты в статической системе подвески. (Б) Оценка эффективностисердечная дифференциация измеряется путем подсчета количества бьющихся сфероидов (%). Здесь показаны средние значения по крайней мере , 3 дифференцировки экспериментов от каждого из 5 ЭСК и 4 hiPSC линий 18. В целом в среднем в избиении сфероидов из всех линий составляет около 90%. Усы представляют SD (n = 3). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Общая Схема кардиомиоцитов дифференциацию от hPSCs в Dynamic Suspension и репрезентативных данных. (А) Экспериментальный дизайн hPSCs дифференциации кардиомиоцитов в динамической системе подвески. RI: ингибитор Rock (B) фазового контраста изображения 5 -й день сфероиды (представитель гesult из Роянская H5 чЭСК линии). Масштабная линейка 200 мкм (C) Иммуноокрашивание ЭСК происходит избиение сфероидов секционного на 30 день для Nkx2.5 и cTnT. Масштабная линейка 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Общая Схема кардиомиоцитов дифференциацию от hPSCs с использованием культур , не предназначенные для Single Cell пассажей. (А) Экспериментальный дизайн hPSCs дифференциации в кардиомиоциты с использованием культур , не приспособленных к одной клетки пассажей. (В) Анализ проточной цитометрией диссоциированных агрегатов показывают в среднем более чем на 60% cTnT + клеток в 42 протестированных линий hiPSC. (С) Иммунологическое диссоциированных кардиомиоциты полученный изhiPSCs для Nkx2.5 и cTnT (репрезентативный результат от 646-4 hiPSC линии). Масштабная линейка 20 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Кардиомиоциты, полученные из hPSCs являются чрезвычайно привлекательным источником для использования в моделировании заболеваний человека, испытывать снадобья скрининга / токсичности и, возможно, в будущем, регенеративной терапии. Одним из основных препятствий для использования этих клеток, однако, является способность обеспечить достаточно высокое качество материала для их эффективного использования. Используя наш описанный протокол, мы предлагаем метод, который преодолевает это ограничение.
В последнее время синтетические маленькие молекулы , направленные на конкретные сигнальные пути , участвующие в кардиогенеза были описаны для улучшения сердечной дифференциации 16,17,22,23. Они в настоящее время используются в качестве альтернативы рекомбинантных цитокинов и сыворотки, содержащих много неопределенных факторов и показывающих изменение партии. Основное преимущество небольшого протокола молекулы, отличной от его специфичности, является то, что она недорога и составные факторы обычно имеют длительный срок хранения по сравнению с средах, содержащих цитокины или факторы роста,, По мере того как малые молекулы , используемые в нашем протоколе сообщили агенты с низкой молекулярной массой, они структурно и функционально определены и могут легко проникать через клеточную мембрану 24,25.
До сих пор различные методы были применены к hPSCs с целью создания надежных, масштабируемых методов дифференциации; Тем не менее, большинство из этих методов были установлены, как 2D, так и мелких статических культур, которые могут предложить плохого масштабируемости и гомогенности. Такие методы, как принудительный агрегация, микро-технологии печати и микро-носителей культур 26-29 теперь приходят в использовании, но, несмотря на определенные успехи в этой области, эти методы все еще далеки от предоставления числа клеток , необходимых для их использования в высокопроизводительных -demand системы. Limited или недоказанной воспроизводимости и масштабируемости, а также высокие затраты, связанные с необходимостью использования дорогостоящих средств массовой информации (mTeSR1 или StemPro-34) или микро-носителей как для расширения hPSCs и их направленной дифференцировки в Cardiomyocytes 30,31, являются недостатки использования этих методов в высокой пропускной способности hPSCs технологий.
В данном исследовании мы уже сообщали простую, надежную и масштабируемую протокол для производства HPSC-производных кардиомиоцитов. Воспроизводимость этого протокола было подтверждено с более чем 40 различных линий HPSC, самая обширная проверка зарегистрированных на сегодняшний день. По сравнению с ранее описанными протоколами подвесок, этот метод показывает большие преимущества с точки зрения масштабируемости, воспроизводимости, доступности, эффективности и функциональности кардиомиоцитов генерируемых. Успех нашего протокола дифференциации тщательно зависит от высокого качества hPSCs, используемых для исследования. Поэтому крайне важно, чтобы проверить кариотип каждой линии и высокие и устойчивые экспрессию маркеров плюрипотентности иммунным окрашиванием и ПЦР перед началом эксперимента. В частности, при культивировании клеток в биореакторе, очень важно использовать hPSCs, которые бееп пассировать на уровне одной клетки в течение по крайней мере трех проходов до начала дифференцировки. В наших протоколах мы использовали сфероиды со средним размером 175 ± 25 мкм, которые были сфероиды, сгенерированные через 5 дней. На следующий день, который сфероиды выполнить это ограничение на размер может меняться в зависимости от скорости роста отдельных линий HPSC; Поэтому важно, чтобы размер, больше, чем на следующий день роста, принимается во внимание.
Этот протокол также можно манипулировать, чтобы стать подходящим для чувствительных клеточных линий и больших когорт HPSC линий. Хотя этот результаты протокола в высоко обогащенных кардиомиоцитов, чистота может быть улучшена путем комбинирования протокола дифференцировки с метаболическим методом селекции , таких как лактат , обогащенной среде 32. Кроме того, улучшение созревания и функциональности полученных кардиомиоцитов, описанных в данном протоколе могут быть применены генерации трехмерных, выровненной сердечнойтканей 33. Одним из недостатков этого протокола является то, что отдельные подтипы кардиомиоцитов конкретно не генерируется, просто смесь предсердий, желудочковой и узловыми клетками. Дальнейшие исследования в этой области необходимо разработать дифференциацию протоколы, которые могут производить сильно обогащены определенных подтипов кардиомиоцитов в особо крупных размерах. Хотя некоторые небольшие протоколы были разработаны на сегодняшний день методы должны быть тщательно протестированы , чтобы обеспечить расширение масштабов возможно 34.
Развитие таких интегрированных платформ можно рассматривать как важный шаг на пути коммерциализации HPSC-производных кардиомиоцитов технологий для клинической, фармацевтической, тканевой инженерии, и в пробирке органа / приложений Органоид развития.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Chang Сердечный научно-исследовательский институт Виктор не занимается, и не оправдываю, уничтожение человеческих эмбрионов для исследований. Его вклад в это исследование было ограничено работать над плюрипотентных стволовых клеток человека индуцированных.
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement (KO-SR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| MEM Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Miltenyi Biotec | 130-093-843 | |
| RPMI1640 | Life Technologies | 11875093 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190144 | |
| DPBS | Life Technologies | 14287072 | |
| Attachment Factor (AF) | Life Technologies | S006100 | |
| ECM Gel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fatal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| B27 minus insulin | Gibco | A18956-01 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17140-019 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Mitomycin C | Bioaustralis | BIA-M1183 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotec | 130-104-172 | |
| IWP2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-095-561 | |
| Purmorphamine | Miltenyi Biotec | 130-104-465 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Miltenyi Biotec | 130-104-169 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Poly Vinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | 363073 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Trypan Blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies Inc. | AM105 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| CELLSPIN | Integra Biosciences | 183 001 | |
| Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml | Integra Biosciences | 182 023 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | Prepared in-house (or commercially available) | ||
| Human pluripotent stem cell (hPSC) lines | Prepared in-house (or commercially available) |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465, 808-812 (2010).
- Vitale, A. M., Wolvetang, E., Mackay-Sim, A. Induced pluripotent stem cells: a new technology to study human diseases. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 843-846 (2011).
- Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circ Res. 115, 556-566 (2014).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
- Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. Korean J Intern Med. 29, 547-557 (2014).
- Kimbrel, E. A., Lanza, R. Current status of pluripotent stem cells: moving the first therapies to the clinic. Nat. Rev. Drug Discov. 14, 681-692 (2015).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108, 407-414 (2001).
- Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107, 2733-2740 (2003).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
- Fonoudi, H., et al. ISL1 protein transduction promotes cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells. PLoS One. 8, e55577 (2013).
- Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. Human embryonic stem cells and cardiac repair. Transplant Rev (Orlando). 23, 53-68 (2009).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854 (2012).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol Biol. 767, 137-146 (2011).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109, E1848-E1857 (2012).
- Gonzalez, R., Lee, J. W., Schultz, P. G. Stepwise chemically induced cardiomyocyte specification of human embryonic stem cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11181-11185 (2011).
- Fonoudi, H., et al. A Universal and Robust Integrated Platform for the Scalable Production of Human Cardiomyocytes From Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. , (2015).
- Abbasalizadeh, S., Larijani, M. R., Samadian, A., Baharvand, H. Bioprocess development for mass production of size-controlled human pluripotent stem cell aggregates in stirred suspension bioreactor. Tissue Eng Part C Methods. 18, 831-851 (2012).
- Larijani, M. R., et al. Long-term maintenance of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells in suspension. Stem Cells Devt. 20, 1911-1923 (2011).
- Baharvand, H., Larijani, M. R., Yousefi, M. Protocol for expansion of undifferentiated human embryonic and pluripotent stem cells in suspension. Methods Mol Biol. 873, 217-226 (2012).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11, 855-860 (2014).
- Minami, I., et al. A small molecule that promotes cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined, cytokine- and xeno-free conditions. Cell reports. 2, 1448-1460 (2012).
- Buskirk, A. R., Liu, D. R. Creating small-molecule-dependent switches to modulate biological functions. Chem Bio. 12, 151-161 (2005).
- McKinsey, T. A., Kass, D. A. Small-molecule therapies for cardiac hypertrophy: moving beneath the cell surface. Nat Rev Drug Discov. 6, 617-635 (2007).
- Niebruegge, S., et al. Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor. Biotechnol Bioeng. 102, 493-507 (2009).
- Bauwens, C. L., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Eng Part A. 17, 1901-1909 (2011).
- Hwang, Y. S., et al. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16978-16983 (2009).
- Nguyen, D. C., et al. Microscale generation of cardiospheres promotes robust enrichment of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3, 260-268 (2014).
- Kempf, H., et al. Controlling expansion and cardiomyogenic differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 3, 1132-1146 (2014).
- Hemmi, N., et al. A massive suspension culture system with metabolic purification for human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Transl Med. 3, 1473-1483 (2014).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell stem cell. 12, 127-137 (2013).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat meth. 10, 781-787 (2013).
- Devalla, H. D., et al. Atrial-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells are a robust preclinical model for assessing atrial-selective pharmacology. EMBO Mol Med. 7, 394-410 (2015).
