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Developmental Biology

Produzione su larga scala dei cardiomiociti da cellule staminali umane pluripotenti usando un altamente riproducibile piccole molecole-Based Differenziazione protocollo

Published: July 25, 2016 doi: 10.3791/54276
Automatic Translation
*1,2,3,8, *1,8, 1, 6,7, 1, 6,7, 2,3,4, *2,3, *1,5
1Department of Stem Cells and Developmental Biology, Cell Science Research Center, Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, 2Developmental and Stem Cell Biology Division, Victor Chang Cardiac Research Institute, 3St. Vincent´s Clinical School, Faculty of Medicine, University of New South Wales, 4School of Biotechnology and Biomolecular Sciences, University of New South Wales, 5Department of Developmental Biology, University of Science and Culture, 6Heart Centre for Children, The Children´s Hospital at Westmead, 7Sydney Medical School, University of Sydney, 8Department of Developmental Biology, University of Science and Culture, Tehran, Iran
* These authors contributed equally

Abstract

Massimizzare il vantaggio di cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs) per la ricerca, la modellazione della malattia, farmaceutica e applicazioni cliniche richiede metodi affidabili per la produzione su larga scala di tipi di cellule funzionali, tra cui cardiomiociti. Qui mostriamo che la manipolazione temporale del WNT, TGF-β, e SHH vie di segnalazione porta a linee HPSC altamente efficiente cardiomiociti differenziazione di cella singola diversi passaggi sia in sospensione statica e sistemi di sospensione bioreattori agitati. Utilizzando questa strategia ha comportato ~ 100% battendo sferoidi, contenente costantemente> 80% delle cellule T-positivi di troponina cardiaca dopo 15 giorni di coltura, convalidati in più righe HPSC. Riportiamo anche una variazione di questo protocollo per l'uso con linee cellulari attualmente non adeguate alle passaging cella singola, il cui successo è stata verificata in 42 linee HPSC. Cardiomiociti generati utilizzando questi protocolli esprimono marcatori specifici per lignaggio e spettacolo previsto electrophysfunzionalità iological. Il nostro protocollo presenta una piattaforma semplice, efficiente e robusto per la produzione su larga scala di cardiomiociti umani.

Introduction

Le cellule umane pluripotenti staminali (hPSCs), comprese le cellule staminali embrionali umane (hESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs), hanno la capacità di auto-rinnovamento e la capacità di differenziarsi in cellule dei tre strati germinali embrionali 1,2. Grazie a queste caratteristiche, hPSCs forniscono una fonte preziosa e illimitato per la generazione e scalabile produzione di tipi di cellule malattie rilevanti per la modellazione di malattie umane 3-5, per high-throughput screening di stupefacenti e di tossicità saggi 6,7 e potenzialmente per le applicazioni cliniche 8 . Generazione di cardiomiociti dal hPSCs offre l'opportunità di indagare specificamente i meccanismi di malattie cardiovascolari umane complesse ei loro possibili trattamenti, precedentemente oltre la portata delle nostre capacità a causa della mancanza di modelli animali e / o la disponibilità di tessuti primari colpiti.

Tutte le applicazioni di cui sopra di hPSCs necessitate la produzione di un massiccio numero di cardiomiociti altamente arricchito e funzionali. Pertanto, la disponibilità di un efficiente, riproducibile e scalabile in vitro cardiaca protocollo differenziazione adatto a più linee HPSC è cruciale. Protocolli di differenziazione dei cardiomiociti convenzionali hanno impiegato strategie diverse quali la formazione del corpo embrioide 9, tecniche di co-coltura di 10, induzione con cocktail di citochine 11 e metodi di proteina di trasduzione 12. Nonostante i progressi in queste tecniche, la maggior parte ancora soffrono di scarsa efficienza, richiedono costosi fattori di crescita, o offrire universalità limitata quando si tenta di utilizzare più linee HPSC. Fino ad oggi, queste sfide hanno fissato limiti alla produzione di cardiomiociti HPSC derivati ​​per gli studi di terapia cellulare in modelli animali, così come nel settore farmaceutico per la scoperta di nuovi farmaci 13. Pertanto, lo sviluppo di tecniche robuste e convenienti per grandila produzione di -scale funzionali cardiomiociti HPSC-derivati ​​in sistemi di coltura scalabili sarebbe in gran parte facilitare le loro applicazioni commerciali e cliniche.

In questo manoscritto, riportiamo lo sviluppo di un sistema di differenziazione cardiaca conveniente e integrata con elevata efficacia, riproducibilità e applicabilità alle hESC e hiPSCs generati da una varietà di fonti e metodi di coltura, compreso un metodo per la produzione su larga scala altamente popolazioni arricchite di cardiomiociti HPSC-derivati ​​dall'uso di un bioreattore. Inoltre, abbiamo ottimizzato questo protocollo per le linee HPSC non adattati alla rinfusa, coltura cellulare libero e / o singola, come hiPSCs di nuova costituzione o grandi coorti di linee HPSC rilevanti per l'analisi dei meccanismi di malattia.

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Protocol

1. Preparazione della Cultura Media, Rivestimento di piastre di coltura cellulare e la manutenzione di indifferenziato hPSCs

  1. media Preparazione
    Nota: Sterilizzare i media che utilizzano un dispositivo di 0,22 micron filtrazione e conservare a 4 ° C al riparo dalla luce per un massimo di 4 settimane. I nomi dei reagenti, i fornitori ei numeri di catalogo sono elencati nella tabella materiali.
    1. Per fibroblasti embrionali di topo (MEF) media, unire 445 ml DMEM, 50 ml siero fetale bovino (FBS) e 5 ml di mezzi di coltura cellulare (ad es, Glutamax).
    2. Per hESC media, unire 390 ml Knockout-DMEM (KO-DMEM), 100 ml Knockout siero sostituzione (KO-SR), 5 ml di terreni di coltura delle cellule, 5 ml essenziale soluzione aminoacidi minima MEM e 0,5 ml di 55 mm β-mercaptoetanolo.
      ATTENZIONE: β-mercaptoetanolo è tossico. Evitare l'inalazione, ingestione e contatto con la pelle.
    3. Per RPMI-B27 (RB) media, unire 475 ml RPMI 1640, 10 ml B27 menoinsulina, 5 ml terreni di coltura delle cellule, 5 ml essenziale soluzione aminoacidi minima MEM, 5 ml di penicillina / streptomicina e 0,5 ml 55 mM β-mercaptoetanolo.
    4. Per la soluzione di dissociazione (DS), unire 10 ml 0,05% tripsina, 4 ml KO-SR, 1 ml collagenasi di tipo IV (1 mg / ml), 5 ml KO-DMEM e 20 microlitri CaCl 2 (1 M).
    5. Per Feeder-cell mezzo condizionato, aggiungere 15 ml di mezzo hESC (senza bFGF) in un pallone T75 con con fl uente cellule di alimentazione (MEF o umani prepuzio fibroblasti) che sono stati precedentemente inattivati ​​dal trattamento con mitomicina C o per irraggiamento. Harvest condizionato media dopo 24 ore e sostituirlo con media hESC fresca. Le celle possono essere usati fino a 2 settimane.
  2. Rivestimento di piastre di coltura cellulare
    1. ECM Gel Rivestimento:
      1. Al momento dell'acquisto, scongelare l'estratto gel ECM a 4 ° C fino a quando è in uno stato liquido uniformemente coerenti, secondo le istruzioni del produttore. Diluire con un rapportodi 1: 2 a freddo KO-DMEM media, aliquotare e conservare a -20 ° C.
        Nota: Durante la preparazione del gel ECM, conservare i materiali necessari per l'uso in aliquotting e rivestimento procedimento fredda. La concentrazione di ECM gel varia con il numero di lotto. Assicurarsi che la concentrazione è annotato sulla aliquote. Aliquote possono essere conservati a -20 ° C per 6 mesi.
      2. Scongelare una aliquota del gel di ECM a 4 ° C. Quando scongelati, aggiungere fredda medio KO-DMEM per una concentrazione finale di 0,34 mg / ml. Pipetta bene e aggiungere 0,75 ml per un pozzetto di un 6-pozzetti. Incubare per 1 ora a 37 ° C.
    2. Mitoticamente inattivato embrionali di topo fibroblasti alimentatore cellulare (MEF) Rivestimento
      Nota:. Preparazione di cellule feeder MEF è stato descritto in precedenza 14
      1. Coat una piastra di coltura cellulare 6-bene con Factor allegato (AF) o 0,1% di gelatina (vedi punto 1.2.3) a temperatura ambiente per 5 min (0,75 ml per un pozzetto di un 6-pozzetti).Rimuovere e lasciare piatto nell'armadio biosicurezza (BSC) per asciugare.
      2. Scongelare MEF trasferendo una fiala congelata a bagnomaria C 37 ° per circa 2 - 3 min.
      3. Aggiungere 7 ml di mezzo MEF ad una provetta da 15 ml. Quando la fiala di cellule viene scongelato, trasferire lentamente il contenuto della provetta 15 ml. Centrifugare a 300 xg per 4 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in media MEF.
      4. Contare le cellule e piastra 1 × 10 6 cellule per 6 pozzetti (~ 1,7 x 10 5 cellule / pozzetto). Trasferire in un incubatore a 37 ° C / 5% di CO 2 e consentono alle cellule di allegare O / N prima dell'uso.
    3. Gelatina Rivestimento:
      1. Sciogliere 1 g di polvere di gelatina in acqua ultrapura per fare un 0,1% (w / v). Incubare per 15 minuti a 37 ° C e poi la soluzione in autoclave a 121 ° C per 15 min. Una volta raffreddato, aggiungere al numero richiesto di pozzetti (0,75 ml per un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti) e incubare per 15 min a 37 ° C.
    4. Laminina Rivestimento:
      1. Scongelare laminina (1 mg / ml) a 4 ° C fino scongelati. A 5 ml di soluzione di laminina, aggiungere 1 ml di PBS freddo. Pipetta bene quindi aggiungere al numero richiesto di pozzetti (0,75 ml per un pozzetto di un 6-pozzetti) e incubare per 1 ora a 37 ° C.
    5. Silicon Rivestimento di superficie Spinner Flask interno:
      1. Lavare accuratamente un pallone filatore 100 ml (con 1 pendolo vetro) con acqua distillata, usando una spazzola di pulizia per rimuovere la polvere e / o residui cultura. Riempire con il 70% di etanolo e dopo 30 minuti sciacquare con acqua distillata. Aggiungere 5 M NaOH e lasciare O / N.
      2. Rimuovere la soluzione di NaOH e lavare il pallone sotto l'acqua corrente per 5 minuti. Riempire il pallone con 1 M HCl e lasciar riposare per 15 minuti. Lavare il pallone con acqua corrente per 5 min, quindi due volte con acqua bidistillata completamenteeliminare ogni traccia di HCl. Lasciar riposare il pallone per asciugare completamente al BSC.
      3. Aggiungere 1,5 ml di soluzione di siliconatura al pallone e ruotare orizzontalmente per coprire tutte le superfici. Ripetere la stessa procedura per il pendolo di vetro.
      4. Riscaldare il pallone rivestito in forno secco a 100 ° C per 1 ora o lasciare asciugare O / N a RT. Se riscaldato in un forno, lasciare raffreddare a RT per il 30 - 60 min.
      5. Lavare il pallone 3 volte con acqua deionizzata per 15 minuti ciascuno, quindi sterilizzare in autoclave a 121 C per 20 min.
  3. Manutenzione di indifferenziati hPSCs
    Nota:     Per ciascuno dei protocolli descritti, se non specificatamente indicato, le cellule sono coltivate e coltivate in pozzetti di piastre di coltura 6 pozzetti e volumi sarà dato appropriato per questo formato.
    1. hPSCs coltivate come indifferenziate Spheroids in un sistema di sospensione statico
      Nota: Le cellule utilizzate in questi passaggi dovrebbero già essere adattate alleunicellulare cultura. 15
      1. Inizia esperimento con hPSCs coltivati ​​su gel di ECM in una piastra di coltura 6-bene a circa il 70 - 80% di confluenza. Rimuovere eventuali colonie differenziati utilizzando lo stereomicroscopio nella BSC. Aggiungere inibitore ROCK 10 pM Y-27632 e incubare a 37 ° C per 1 ora.
        Nota: per rimuovere le colonie differenziati, usare un puntale per staccare e rimuovere delicatamente tutte le parti differenziate manualmente con lo stereomicroscopio. Fare attenzione a non rimuovere le colonie indifferenziate.
      2. Rimuovere le cellule da incubatore e medie aspirare. Lavare le cellule con 1 ml di PBS, rimuovere e aggiungere la dissociazione enzimatica 0,5 ml di cellule. Incubare le cellule per 4 - 5 min a 37 ° C.
      3. Aggiungere 1 ml di mezzo hESC e raccogliere le cellule con un raschietto cellulare. Dissociare il cellule in singole cellule utilizzando una pipetta P 1.000. Contare le cellule vitali utilizzando Trypan blu e un emocitometro.
      4. Risospendere le cellule a 2 × 10 5 praticabile cells / ml nei alimentatore-cell mezzo condizionato integrato con 100 ng / ml bFGF e 10 micron inibitore ROCK Y-27632. Trasferire le cellule a piastre ultra-basso di attacco utilizzando una pipetta da 5 ml (3 ml per pozzetto di 6 pozzetti).
      5. Dopo 2 giorni, rimuovere con attenzione le cellule da incubatore e aspirare la metà del mezzo (circa 1,5 ml). Sostituire con fresco mezzo condizionato integrato con 100 ng / ml bFGF.
      6. Modificare la metà del mezzo ogni giorno con mezzo condizionato integrato con 100 ng / ml bFGF fino al giorno 5. Ora, o altre cellule di coltura, passaggio per la cultura indifferenziata continua (passo 1.3.1.2 - 5), o utilizzare per la differenziazione cardiaca (sezione 2 ). Se la cultura continua, cellule di passaggio ogni 4 - 8 giorni.
    2. hPSCs coltivati ​​su cellule di alimentazione e diversi passaggi Utilizzando Collagenasi di tipo IV
      1. Prima passaging hPSCs, rimuovere eventuali colonie differenziati utilizzando lo stereomicroscopio nella BSC. Aspirare il medio e lavare le cellule con 1 mlPBS per pozzetto. Rimuovere quindi aggiungere 0,75 ml collagenasi di tipo IV (1 mg / ml) e incubare a 37 ° C per 5 - 15 minuti, come richiesto per avere i bordi delle colonie iniziano a staccarsi.
      2. Aspirare collagenasi e aggiungere 1 ml di terreno hESC per pozzetto. Staccare colonie a piccoli gruppi con un raschietto cellulare, quindi trasferire le cellule utilizzando una pipetta P 1.000 in un tubo da 15 ml. Fare attenzione a non rompere i grappoli in piccoli pezzi.
      3. Lavare il medium bene con 1 ml di hESC per raccogliere tutte le cellule rimanenti e aggiungere 15 ml di tubo. Centrifugare a 100 xg per 2 min. Aspirare le cellule surnatante e risospendere in media hESC integrato con 100 ng / ml bFGF.
      4. Rimuovere una piastra MEF rivestito dal termostato e aspirare il terreno MEF. Trasferire le cellule in un rapporto compreso tra 1: 3 a 1:10, come appropriato. Cambiare media giornaliera con il mezzo hESC fresca integrato con 100 ng / ml bFGF. cellule Passage ogni 4 - 8 giorni.

2. Differentizione di hPSCs come Spheroids in un sistema di sospensione statico

  1. Iniziare esperimento utilizzando giorno 5 sferoidi indifferenziati come preparato nella sezione 1.3.1.
    Nota: In questa fase, la dimensione media di sferoidi dovrebbe essere 175 ± 25 micron. Un minimo di 50 sferoidi dovrebbe essere usato quando si inizia un esperimento differenziazione.
  2. Trasferimento sferoidi in una provetta da 15 ml con una pipetta da 5 ml. Lavare il medium bene con 1 ml di RB per raccogliere eventuali residui sferoidi e aggiungere allo stesso tubo da 15 ml. Lasciare le cellule per 5 minuti fino a quando sferoidi hanno sedimentato in modo da formare un pellet sciolto (NON centrifugare). Aspirare il surnatante, facendo attenzione a non prendere qualsiasi sferoidi.
  3. Aggiungere 3 ml di mezzo RB integrato con 12 micron CHIR99021. Trasferire le cellule di nuovo in un pozzetto di un 6-pozzetti attacco ultra-bassa. Dopo 24 ore, ripetere il punto 2.2.
    Nota: media RB è sensibile alla luce. Quando si lavora con il mezzo RB, tenere la luce spenta BSC.
  4. UNdd 3 ml medie RB al pellet cellulare. Trasferire le cellule di nuovo in un pozzetto di un 6-pozzetti attacco ultra-bassa. Dopo 24 ore, ripetere il punto 2.2.
  5. Aggiungere 3 ml di mezzo RB integrato con IWP2, purmorphamine e SB431542 (5 micron ciascuno). Trasferire le cellule di nuovo in un pozzetto di un 6-pozzetti attacco ultra-bassa. Dopo 2 giorni ripetere il punto 2.2.
  6. Risospendere le cellule in 3 ml di terreno RB e trasferimento ad una piastra di gelatina rivestita per permettere alle cellule di allegare.
    Nota: In questa fase, le cellule possono essere mantenute in sospensione. Per continuare con la coltura in sospensione statica, trasferire le cellule di nuovo ad un piatto di ultra-low attaccamento.
  7. Cambiare la media con 3 ml di mezzo RB dopo 2 giorni. Le culture cominceranno a battere giorno successivo. Cambiare la media ogni 3 - 4 giorni con media RB.

3. Differenziazione delle hPSCs come Spheroids in un bioreattore sospensione agitata

  1. Inizia esperimento con la cultura sferoidi indifferenziatad in sospensione statico per almeno 3 passaggi (vedi sezione 1.3.1). Aggiungere inibitore ROCK 10 pM Y-27632 e incubare a 37 ° C per 1 ora.
  2. Rimuovere le cellule da incubatore e trasferire tutti i sferoidi in un tubo da 15 ml con una pipetta da 5 ml. Lavare il medium bene con 1 ml di hESC per raccogliere eventuali residui sferoidi e aggiungere allo stesso tubo da 15 ml. Lasciare le cellule per 5 minuti fino a quando sferoidi hanno sedimentato in modo da formare un pellet sciolto (NON centrifugare). Aspirare il surnatante, facendo attenzione a non prendere qualsiasi sferoidi.
  3. Lavare le cellule con l'aggiunta di 1 ml di PBS. Lasciare agire per 5 minuti fino a quando sferoidi hanno sedimentato in modo da formare un pellet sciolto (NON centrifugare). Rimuovere il surnatante e aggiungere 0,5 ml di 0,05% tripsina più 0,53 mM EDTA. Incubare le cellule per 4 - 5 min a 37 ° C.
  4. Rimuovere le cellule dal termostato e aggiungere 1 ml di mezzo hESC. Usando una pipetta P 1.000, dissociare le cellule in singole cellule, contare le cellule utilizzando Trypan blu e un emocitometro. Risospendere a 2 × 10 5 viabLe cellule / ml in mezzo condizionato integrato con 100 ng / ml bFGF e 10 micron inibitore ROCK Y-27632.
  5. Trasferire 100 ml di sospensione cellulare nel pallone bioreattore siliconato con 1 pendolo (si veda la Sezione 1.2.5). Inizia con 35 giri al minuto agitazione e dopo l'aumento 24 ore a 40 giri al minuto.
  6. Dopo 48 ore, interrompere l'agitazione per 5 - 10 minuti fino a quando tutti gli sferoidi sono stabiliti al fondo del pallone. Sostituire la metà del mezzo con medium condizionato supplementato con 100 ng / ml bFGF. Ripetere lo stesso processo ogni 24 ore fino al giorno 5.
    Nota: A questo punto, dovrebbe essere formato sferoidi indifferenziate con una dimensione media di 175 ± 25 micron.
  7. Arrestare agitazione per 5 - 10 minuti fino a quando tutti gli sferoidi sono stabiliti al fondo del pallone. Trasferire tutte sferoidi in una provetta da 50 ml in una quantità minima di terreno (meno di 50 ml). Eliminare qualsiasi mezzo che resta nel pallone bioreattore, con attenzione per garantire non sferoidi sono rimasti nel recipiente.
  8. leave per 5 - 10 minuti fino a quando tutti gli sferoidi sono insediati sul fondo della provetta 50 ml poi rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet sciolto. Lavare con 25 ml di PBS con calcio e magnesio o medio RB, poi ripartire per 5 - 10 minuti fino a quando tutti gli sferoidi sono insediati sul fondo della provetta 50 ml per formare nuovamente un pellet sciolto.
  9. Rimuovere con attenzione il surnatante e aggiungere 40 ml di mezzo RB integrato con 12 micron CHIR99021, inibitore della roccia 10 micron e 0,1% alcool polivinilico (PVA). Risospendere le sferoidi e trasferire tutte le cellule di nuovo al pallone bioreattore. Aggiungere mezzo per rendere il volume totale di 100 ml. Riavviare agitazione a 40 giri al minuto per 24 ore.
    Nota: media RB è sensibile alla luce. Quando si lavora con il mezzo RB mantenere il BSC in luce spenta modalità.
  10. Ripetere i passaggi 3,7-3,8.
  11. Rimuovere con attenzione il surnatante e aggiungere 40 ml di RB media integrato con 0,1% PVA. Risospendere le sferoidi e trasferire tutte le cellule di nuovo al tegli bioreattore pallone. Aggiungere mezzo per rendere il volume totale di 100 ml. Riavviare agitazione a 40 giri al minuto per 24 ore.
  12. Ripetere i passaggi 3,7-3,8.
  13. Rimuovere con attenzione il surnatante e aggiungere 40 ml di mezzo RB integrato con IWP2, purmorphamine e SB431542 (5 micron ciascuno). Risospendere le sferoidi e trasferire tutte le cellule di nuovo al pallone bioreattore. Aggiungere mezzo per rendere il volume totale di 100 ml. Riavviare agitazione a 40 rpm per 2 giorni.
  14. Ripetere i punti 3.7-3.8.
  15. Rimuovere con attenzione il surnatante e aggiungere 40 ml di mezzo RB solo. Risospendere le sferoidi e trasferire tutte le cellule di nuovo al pallone bioreattore. Aggiungere mezzo per rendere il volume totale di 100 ml. Riavviare agitazione a 40 giri al minuto. sferoidi Battere devono essere osservate 48-72 ore più tardi.
  16. Cambiare la metà del mezzo ogni 3 - 4 giorni con media RB solo fermando l'agitazione per 5 - 10 minuti fino a quando tutti gli sferoidi sono stabiliti al fondo del recipiente. Rimuovere con cautela 50 ml di terreno senza disturbare gli sferoidi e Carefully sostituire con 50 ml di terreno fresco RB.

4. Differenziazione di hPSCs utilizzando colture non adatto a singola cella Passaging

Nota: Questo approccio è particolarmente utile per la differenziazione rapida di un elevato numero di linee HPSC senza dover adattarsi alle tecniche di coltura monocellulari un processo estremamente laboriosa e che richiede tempo. Questa tecnica è applicabile a linee cellulari che sono molto sensibili alla dissociazione enzimatica delle cellule, come linee HPSC recente costituzione.

  1. Inizia esperimento con hPSCs coltivati ​​su MEF (come nella sezione 1.3.2), che sono circa il 70 - 80% confluenti. Rimuovere eventuali colonie differenziati utilizzando lo stereomicroscopio nella BSC.
  2. Rimuovere medie e aggiungere 0,5 ml di soluzione di dissociazione (DS). Incubare per 0,5-1 minuti fino a quando le cellule MEF hanno arrotondato ei bordi delle colonie hPSCs diventato chiaro. rimuovere rapidamente DS e aggiungere 0,75 ml tipo collagenasi IV (1 mg / ml).
  3. covarele cellule per 5 - 15 min a 37 ° C. Controllare le cellule sotto il microscopio durante il periodo di incubazione, e quando le colonie intere stanno iniziando a sollevare e staccare, rimuovere collagenasi e aggiungere 1,5 ml di mezzo hESC.
    Nota: Se dopo 15 minuti la maggior parte delle colonie sono ancora attaccato, mettere le cellule di nuovo al incubatrice. Controllare le cellule al microscopio ogni 5 minuti. Fare attenzione a non lasciare le cellule in collagenasi per più di 30 min. Se ci sono molte colonie galleggianti nella soluzione collagenasi, non rimuovere la collagenasi; basta aggiungere 1 ml di hESC media.
  4. Usando una pipetta P 1.000, Pipetta delicatamente colonie per staccare colonie nel suo complesso. Non rompere le colonie in piccoli pezzi. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml con una pipetta da 5 ml. Lavare il bene con 1 ml di mezzo hESC per raccogliere eventuali cellule rimanenti da aggiungere al tubo stesso. Lasciare agire per 5 minuti fino a quando tutte le colonie hanno sedimentato (NON centrifugare).
  5. Rimuovere con attenzione il surnatante e aggiungere 2 ml hESC medium integrato con 100 ng / ml bFGF. Trasferire le cellule in una piastra ultra-bassa allegato utilizzando 5 ml pipetta (1 ml in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti e 3 ml in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti). Incubare a 37 ° C / 5% di CO 2 per almeno 6 ore (massimo di 12 ore).
  6. Durante questo tempo, preparare il numero richiesto di laminina rivestite pozzetti / piastre per il passo 4.7. rapporti di trasferimento di cellule consigliato sono 1 confluenti pozzetto di una piastra da 6 pozzetti a 2 pozzetti di una piastra da 24 pozzetti (o importo equivalente per superficie).
  7. Dopo 6 ore, trasferire accuratamente gli aggregati colonia in un tubo da 15 ml con 5 ml pipetta. Lavare la piastra con il mezzo RB per raccogliere eventuali residui inerti e aggiungere allo stesso tubo da 15 ml (0,5 ml per ben per 24 pozzetti e 1 ml per pozzetto per 6 pozzetti). Attendere 5 minuti fino a quando il sedimento aggregati, quindi aspirare accuratamente il surnatante. Fare attenzione a non disturbare il pellet sciolto.
  8. Aggiungere 2 ml di mezzo RB completato con 12 micron CHIR99021 e trasferire con cautelacon una pipetta da 5 ml per i vostri pozzi laminina pre-preparato rivestito (come nella sezione 1.2.4) per consentire alle cellule di allegare.
  9. Dopo 24 ore, rimuovere con attenzione il mezzo in ogni bene e aggiungere 1 ml di mezzo RB solo.
    Nota: alcuni degli aggregati avranno attaccato molto debolmente solo alla piastra di coltura; quindi è importante non rimuovere eventuali grandi aggregati eventualmente allentati durante la procedura di cambio medio. È importante, tuttavia, per rimuovere la maggior quantità di piccoli detriti cellulari possibile.
  10. Dopo 24 ore, rimuovere con attenzione il supporto e aggiungere media RB integrato con IWP2, purmorphamine e SB431542 (5 micron ciascuno).
  11. Cambiare la media dopo 2 giorni con un solo mezzo di RB. Le cellule cominceranno a battere giorno successivo.
  12. Cambiare la media ogni 3 - 4 giorni con solo mezzo di RB.

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Representative Results

Al fine di stabilire un metodo semplice per la differenziazione su larga scala di cardiomiociti da hPSCs, abbiamo creato un protocollo in cui le cellule sono state trattate inizialmente con un attivatore WNT / β-catenina (CHIR99021) 16 e, successivamente, con gli inibitori della Wnt / β- catenina e fattore di crescita trasformante-β (TGF-β) percorsi (IWP2 16 e SB431542 17, rispettivamente) e, infine, un attivatore della sonic hedgehog (SHH) percorso (purmorphamine) 17 (Figura 1A). Nella nostra strategia di differenziazione, circa il 50% degli sferoidi (175 ± 25 micron di diametro sferoide dimensioni) ha cominciato a battere 7 giorni dopo l'inizio della differenziazione, che poi portata al 100% di giorno 10. È interessante notare che, utilizzando questo protocollo, sono stati osservati differenziati sferoidi per continuare a battere fino a 60 giorni dopo la differenziazione iniziazione 18. studi di popolazione su sferoidi dissociatiesaminata mediante citometria di flusso ha rivelato che al giorno 15, oltre il 90% della popolazione conteneva troponina cardiaca T positivo (cTnT +), le cellule, mentre meno del 12% delle cellule sono risultati positivi per la muscolatura liscia e marcatori endoteliali (3,1% von Willibrand Factor (vWF +), 8,4% alfa del muscolo liscio actina-positivo (+ ASMA)) 18. Fino ad oggi, il protocollo di differenziazione sospensione statico è stato testato sulle linee 5 hESC e 4 hiPSC, con uscite un aumento di circa il 90% di battere sferoidi da ogni riga, che mostra l'alta riproducibilità di questo protocollo tra le diverse linee di HPSC (Figura 1B).

Al fine di sviluppare una piattaforma integrata per la produzione su larga scala di cardiomiociti umani, abbiamo applicato la nostra strategia di differenziazione sospensione statico ad un bioreattore sospensione agitata (Figura 2A). Gli sferoidi di differenziazione hanno mostrato un comportamento simile nel bioreattore environment come nel sistema statico (Figura 2B) e sono stati osservati circa il 100% di sferoidi da battere al giorno 10 18. immunocolorazione in sezioni di battere sferoidi raccolti al giorno 30 utilizzando anticorpi contro cTnT e il fattore di trascrizione cardiaco NKX2-5, mostrato espressione citoplasmatica e nucleare di queste proteine, rispettivamente (Figura 2C). La resa totale di cellule nella coltura in sospensione dinamica è stata di circa 90 - 100 milioni di cellule in 100 ml di volume di lavoro dopo 15 giorni di coltura differenziazione. Con questo è il caso, la resa dei cardiomiociti può arrivare fino a circa 54-90.000.000 cellule (con l'osservato 60 - efficacia differenziazione del 90%) da 20 milioni a partire hPSCs, inoculati nella fase di espansione hPSCs come singole cellule. Abbiamo inoltre esaminato le proprietà elettrofisiologiche di cardiomiociti differenziati secondo il metodo del patch clamp cella singola. Battere sferoidi dalle culture bioreattore eranodissociate in singole cellule al giorno 30 e potenziali d'azione registrati su cellule rappresentative che utilizzano l'intera tecnica del patch clamp cellulare. I dati hanno mostrato la presenza di tre principali tipi di cellule cardiache (atrial-, nodal- e cellule ventricolare simili) nella popolazione di cellule singole 18.

Per le due tecniche di differenziazione di cui sopra, hPSCs devono essere adattati al-alimentatore libero e / o cella singola coltura in sospensione 19-21. Alcune linee HPSC tuttavia, sono molto sensibili alla dissociazione enzimatica delle cellule e mostrano una significativa perdita di vitalità cellulare dopo la dissociazione, come si osserva in linee hiPSC recente costituzione. Inoltre, quando si lavora con grandi coorti di linee, adeguando tutti per alimentatore-Free e la cultura unicellulare sarebbe enormemente alta intensità di lavoro e che richiede tempo. Per affrontare questi problemi, sferoidi indifferenziati sono stati sostituiti con aggregati di cellule indifferenziate (Figura 3a).I nostri dati mostrano che l'utilizzo di questa tecnica modificata, cluster battendo apparsi 7 giorni dopo la differenziazione iniziazione. La riproducibilità di questa versione modificata è stata confermata usando 42 linee hiPSC, in cui tutte le linee testate generati sulle cellule media più di 60% + cTnT giorno 15 per ogni esperimento condotto (Figura 3B). Immunocolorazione utilizzando anticorpi contro cTnT e NKX2-5 a grappoli battendo dissociati ha mostrato espressione citoplasmatica e nucleare, rispettivamente (Figura 3C).

Figura 1
Figura 1. Schema di Cardiomyocyte differenziazione da hPSCs in sospensione statico e Rappresentante dei dati. (A) progettazione sperimentale di hPSCs differenziazione di cardiomiociti in sistema di sospensione statica. (B) La valutazione dell'efficienza delladifferenziazione cardiaca è misurata contando il numero di sferoidi battenti (%). Visualizzati sono le medie di almeno 3 esperimenti differenziazione da ciascuno dei 5 hESC e 4 linee hiPSC 18. media complessiva di battere sferoidi da tutte le linee è di circa il 90%. Le barre di errore rappresentano SD (n = 3). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. Schema generale dei cardiomiociti differenziazione da hPSCs in Dynamic Suspension e Rappresentante dei dati. (A) Disegno sperimentale di differenziazione hPSCs di cardiomiociti in sistema di sospensione dinamica. RI: inibitore della roccia (B) fase di contrasto immagine giorno 5 sferoidi (R Rappresentanteisultato dalla linea di Royan H5 hESC). Barra della scala 200 micron (C) immunocolorazione di hESC deriva-battendo sferoidi sezionati al giorno 30 per NKX2.5 e cTnT. Barra della scala di 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Schema generale dei cardiomiociti differenziazione da hPSCs utilizzando colture non adatto a singola cella Passaging. (A) progettazione sperimentale di hPSCs differenziazione di cardiomiociti utilizzando le culture non adattate al singolo passaging cellule. (B) citometria a flusso analisi degli aggregati dissociate mostra sulla oltre il 60% + cellule media cTnT in 42 linee hiPSC testati. (C) immunocolorazione di dissociate cardiomiociti derivati ​​dahiPSCs per NKX2.5 e cTnT (risultato rappresentante 646-4 linea hiPSC). Barra della scala 20 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Cardiomiociti derivati ​​da hPSCs sono una fonte estremamente attraente per l'uso in modelli di malattia umana, farmaci di screening test / tossicità e, forse, in futuro, le terapie rigenerative. Uno dei principali ostacoli all'utilizzo di queste cellule però, è la capacità di fornire materiale di alta qualità sufficiente per il loro uso efficace. Utilizzando il nostro protocollo descritto, offriamo un metodo che supera questa limitazione.

Recentemente, piccole molecole sintetiche destinate specifiche vie di segnalazione coinvolte nel cardiogenesis sono stati descritti per migliorare cardiaca 16,17,22,23 differenziazione. Questi vengono ora utilizzati come alternativa ai citochine ricombinanti e siero, contenenti molti fattori indefiniti e mostrando variazione batch. Il vantaggio principale di una piccola molecola di protocollo, diverso sua specificità, è che è fattori economici e componenti generalmente hanno una shelf-life prolungata rispetto ai supporti contenenti citochine e fattori di crescita. Poiché le piccole molecole utilizzate nel nostro protocollo riportato sono bassi agenti peso molecolare, sono strutturalmente e funzionalmente definiti e possono diffondere facilmente attraverso la membrana cellulare 24,25.

Finora, diversi metodi sono stati applicati al hPSCs per stabilire robuste tecniche di differenziazione scalabili; tuttavia, la maggior parte di questi metodi sono stati stabiliti come 2D e culture statiche su piccola scala, che può offrire scarsa scalabilità ed omogeneità. Tecniche come aggregazione forzata, le tecnologie di micro-stampa e le culture di micro-carrier 26-29 sono ormai prossimi in uso, ma nonostante alcuni progressi in questo settore, questi metodi sono ancora lungi dal fornire i numeri di cellule necessarie per il loro impiego in alto sistemi -demand. riproducibilità limitata o non provata e scalabilità, nonché gli elevati costi dovuti alla necessità di supporti costosi (mTeSR1 o StemPro-34) o micro-vettori sia per l'espansione della hPSCs e la loro differenziazione diretta a cardiomyocytes 30,31, sono gli svantaggi di usare questi metodi in hPSCs tecnologie ad alto rendimento.

In questo studio, abbiamo riportato un protocollo semplice, robusta e scalabile per la produzione di cardiomiociti HPSC-derivati. La riproducibilità di questo protocollo è stato convalidato con più di 40 diverse linee HPSC, la più ampia convalida segnalato fino ad oggi. Rispetto ai protocolli di sospensione precedentemente riportati, questo metodo presenta grandi vantaggi in termini di scalabilità, riproducibilità, l'accessibilità, l'efficacia e la funzionalità dei cardiomiociti generati. Il successo del nostro protocollo di differenziazione è completamente dipendente dalla qualità dei hPSCs utilizzati per lo studio. Pertanto è fondamentale controllare cariotipo di ogni riga e l'espressione elevata e costante di marcatori pluripotenza di immunoistochimica e PCR prima di iniziare l'esperimento. In particolare, quando coltivando cellule nel bioreattore, è fondamentale utilizzare hPSCs che sono been diversi passaggi a livello di singola cellula per almeno tre passaggi prima dell'inizio di differenziazione. Nei nostri protocolli abbiamo utilizzato sferoidi con una dimensione media di 175 ± 25 micron, che erano sferoidi generati dopo 5 giorni. Il giorno che gli sferoidi si incontrano questa limitazione dimensioni possono variare a seconda del tasso di crescita delle singole linee HPSC; quindi è importante che la dimensione, più del giorno della crescita, viene preso in considerazione.

Questo protocollo può anche essere manipolato per diventare adatto per linee di cellule sensibili e grandi coorti di linee HPSC. Sebbene questo protocollo risultati in cardiomiociti altamente arricchito, la purezza può essere migliorata combinando il protocollo differenziazione con un metodo di selezione metaboliche come mezzo lattato arricchito 32. Inoltre, il miglioramento della maturazione e funzionalità dei cardiomiociti derivati ​​descritti in questo protocollo possono essere applicate per la generazione di tridimensionale, cardiaca allineatidei tessuti 33. Uno dei limiti di questo protocollo è che particolari sottotipi di cardiomiociti non sono specificamente generati, semplicemente una miscela di atriale, ventricolare e cellule nodali. Ulteriori indagini in questo campo è necessario per sviluppare protocolli di differenziazione che possono produrre altamente arricchito cardiomiociti specifici del sottotipo in larga scala. Anche se alcuni protocolli di piccole dimensioni sono stati sviluppati fino ad oggi, dovrebbero essere rigorosamente testato per garantire scale-up è possibile 34 metodi.

Lo sviluppo di queste piattaforme integrate può essere considerato come un passo importante verso la commercializzazione di tecnologie cardiomiociti HPSC-derivati ​​per cliniche, farmaceutica, ingegneria dei tessuti, e in organo vitro / organoide applicazioni di sviluppo.

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Disclosures

Il Chang Cardiac Research Institute Victor non svolge, né perdona, la distruzione di embrioni umani per la ricerca. Il suo contributo a questo studio è stato limitato a lavorare sulle cellule staminali pluripotenti indotte umane.

Gli autori dichiarano che non hanno interessi finanziari in conflitto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Knockout DMEM Life Technologies 10829018
Knockout Serum Replacement (KO-SR) Life Technologies 10828028
Glutamax Life Technologies 35050061
MEM Non-essential Amino Acids Life Technologies 11140-050
β-Mercaptoethanol Life Technologies 21985-023
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) Miltenyi Biotec 130-093-843
RPMI1640 Life Technologies 11875093
DPBS, no calcium, no magnesium Life Technologies 14190144
DPBS Life Technologies 14287072
Attachment Factor (AF) Life Technologies S006100
ECM Gel Sigma-Aldrich E1270
Laminin Invitrogen 23017-015
DMEM Life Technologies 11965-092                                                                                                       
Fatal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16140-071
B27 minus insulin Gibco A18956-01
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070063
0.05% Trypsin/EDTA Life Technologies 25300-054
Collagenase Type IV Life Technologies 17140-019
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C7902
Mitomycin C Bioaustralis BIA-M1183
CHIR99021 Miltenyi Biotec 130-104-172
IWP2 Miltenyi Biotec 130-105-335
SB431542 Miltenyi Biotec 130-095-561
Purmorphamine Miltenyi Biotec 130-104-465
ROCK inhibitor Y-27632 Miltenyi Biotec 130-104-169
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E6758
Poly Vinyl Alcohol (PVA) Sigma-Aldrich 363073
Gelatin Sigma-Aldrich G1890
Trypan Blue Bio-Rad 145-0013
Accumax  Innovative Cell Technologies Inc. AM105
Sigmacote  Sigma-Aldrich SL2 
CELLSPIN Integra Biosciences 183 001
Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml  Integra Biosciences 182 023
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) Prepared in-house (or commercially available)
Human pluripotent stem cell (hPSC) lines Prepared in-house (or commercially available)

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References

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Produzione su larga scala dei cardiomiociti da cellule staminali umane pluripotenti usando un altamente riproducibile piccole molecole-Based Differenziazione protocollo
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Fonoudi, H., Ansari, H., Abbasalizadeh, S., Blue, G. M., Aghdami, N., Winlaw, D. S., Harvey, R. P., Bosman, A., Baharvand, H. Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol. J. Vis. Exp. (113), e54276, doi:10.3791/54276 (2016).

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