Summary
Miljoenen mensen lijden aan retinale degeneratieve ziekten die leiden tot onomkeerbare blindheid. Een gemeenschappelijk element van veel van deze ziekten is het verlies van retinale ganglioncellen (RGC's). Dit gedetailleerde protocol beschrijft de isolatie van primaire murine RGC's door positieve en negatieve selectie met flowcytometrie.
Abstract
Neurodegeneratieve ziekten hebben vaak een verwoestende invloed op de getroffen personen. Retinal ganglion cell (RGC) verlies is betrokken bij een reeks ziektes, waaronder diabetische retinopathie en glaucoom, naast normale veroudering. Ondanks hun belang zijn RGC's tot nu toe extreem moeilijk te bestuderen, onder meer doordat ze slechts een klein percentage van de grote verscheidenheid van cellen in het netvlies bevatten. Bovendien gebruiken huidige isolatiemethoden intracellulaire markers om RGC's te identificeren, die niet-levensvatbare cellen produceren. Deze technieken omvatten ook lange isolatieprotocollen, zodat er geen praktische, gestandaardiseerde en betrouwbare methoden zijn om RGC's te verkrijgen en te isoleren. Dit werk beschrijft een efficiënte, uitgebreide en betrouwbare methode om primaire RGC's van muizenretinae te isoleren met behulp van een protocol gebaseerd op zowel positieve als negatieve selectiecriteria. De gepresenteerde methodes maken het mogelijk om de toekomstige studie van RGC's te beantwoorden, met als doel het beter te begrijpen van de hoofdvakDaling van de gezichtsscherpte die voortvloeit uit het verlies van functionele RGC's in neurodegeneratieve ziekten.
Introduction
RGC's zijn terminale gedifferentieerde neuronen, en daarom zijn primaire cellen nodig voor experimenten. De ontwikkeling van een protocol voor het isoleren en verrijken van primaire murine retinale ganglioncellen (RGC's) is essentieel om de mechanismen van RGC gezondheid en degeneratie in vitro te onthullen. Dit is vooral belangrijk voor studies die proberen potentiële therapieën te genereren om de RGC-functie te bevorderen en hun dood te minimaliseren. De degeneratie van RGC's is geassocieerd met retinale degeneratieve ziekten, zoals glaucoom, diabetische retinopathie en normale veroudering. Hoewel de specifieke cellulaire mechanismen die het RGC-verlies hebben, onduidelijk zijn, zijn er een aantal risicofactoren geïdentificeerd. Gebrek aan zuurstof bij de optische zenuwkop 1 , 2 , 3 veroorzaakt RGC-dood 4 en fungeert als de verstoring van de homeostase tussen de activatie van excitatoire en iInhibitorische receptoren binnen individuele RGC's 5 , 6 . Een reeks uitdagingen belemmert de vooruitgang naar het gebruik van deze cellen voor diepgaande studies. Ten eerste is het aantal RGC's aanwezig in een murina retina klein. RGC's vertegenwoordigen minder dan 1% van de totale retinale cellen 7 , 8 , 9 . Ten tweede zijn de meeste RGC-specifieke markers intracellulaire eiwitten 10 , 11 , 12 . Selectie op basis van deze markers laat de cellen niet levensvatbaar, wat de stroomafwaartse functionele analyses uitsluit. Tenslotte zijn de beschikbare protocollen langdurig en ontbreken standaardisatie 13 , 14 . Vroege RGC isolatieprotocollen waren gebaseerd op immunopanning methoden. Barres et al. 15 Aangepast aan de klassieke immuunAnningstechniek en voegde een tweede stap toe, die monocyten en endotheelcellen uit het grootste deel van retinale cellen uitgesloten voorafgaand aan positieve selectie op basis van immunopositiviteit tegen anti-thymocytantigeen (aka Thy1), een celoppervlakmarkering. Jaren later, Hong et al. Gecombineerde magnetische kraal isolatie technieken met cel sortering strategieën om RGC's te isoleren met hogere zuiverheid 16 . Het gebruik van magnetische kralen wordt nog steeds in veel wetenschappelijke toepassingen gebruikt. Samen verbeterden magnetische kralen en flowcytometrieprotocollen de zuiverheid van geïsoleerde cellen. Echter, deze zuiveringssystemen zijn nog niet gestandaardiseerd voor de isolatie van murine RGC's uit gedissocieerde retinae.
Flowcytometrie is een krachtige analytische methode die de optische en fluorescentie eigenschappen van cel suspensies meet. Cellen worden zowel kwantitatief als kwalitatief geanalyseerd met een hoge mate van gevoeligheid, waardoor een multidimensionale analyse van de celbevolkingatie. Cellulaire discriminatie is gebaseerd op twee hoofd fysieke eigenschappen: celgrootte of oppervlakte en granulariteit of interne complexiteit 17 . Een multidimensionale analyse kan worden uitgevoerd door het combineren van antilichamen die zijn gemarkeerd met fluorochromen die soortgelijke excitatie golflengten en verschillende emissies hebben. Flowcytometrie is snel, reproduceerbaar en gevoelig. Multitpe lasers maken het mogelijk om nog meer multidimensionale analyses van enkele cellen door flowcytometrie toe te passen. Zo is het een aantrekkelijke methodologie voor de studie van cytologische monsters. Fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) gebruikt de multidimensionale fenotypische verschillen die zijn geïdentificeerd door flowcytometrie om individuele cellen te sorteren in verschillende subpopulaties.
In het laatste decennium zijn meerdere oppervlak- en intracellulaire eiwitten geïdentificeerd als potentiële biomarkers voor de selectie van cellen, inclusief neuronen. Aanvankelijke studies die RGC's van ratten wilden isoleren, gebruikt Thy1 als een ganglion celL marker. Helaas heeft Thy1, aka CD90, meerdere isoformen in andere knaagdier soorten 18 , 19 , 20 en wordt uitgedrukt door meerdere retinale cel typen 19 , 20 , waardoor het een niet-specifieke marker voor RGC's is. Een andere oppervlakte marker, CD48, is gevonden op monocytische populaties in het netvlies, waaronder macrofagen en microglia. Met behulp van deze twee oppervlaktemerkers werd een gewijzigde RGC-handtekening-Thy1 + en CD48 negcellen ontwikkeld 15 , 16 , 21 , 22 . Helaas zijn deze twee selectiecriteria niet voldoende om te kiezen voor een zeer verrijkte RGC-populatie. Om deze onvervulde behoefte aan te pakken, werd een flow cytometry protocol ontwikkeld 23 gebaseerd op multi-layered positieve en negatieve selectiecriteria usiNg bekende celoppervlakmarkers om primaire murine RGC's te verrijken en te zuiveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures die in het volgende protocol zijn beschreven, werden goedgekeurd door het Inspectie Comité voor de Diervoeding en -gebruik (IACUC) bij het University of Tennessee Health Science Center (UTHSC) en volgden de ARVO-verklaringen voor het gebruik voor gebruik in de visie- en oogheelkunde (ARVO) Van dieren in oogheelkunde en visie onderzoek, naast de richtlijnen voor laboratoriumdierproeven (Instituut voor Laboratorium Diervoeder, Volksgezondheidszorgbeleid inzake Humane Verzorging en Gebruik van Laboratoriumdieren).
1. Voorbereiding van instrumenten, oplossingen en media
Opmerking: Alle informatie over materialen, reagentia, gereedschappen en instrumenten die in het protocol zijn vermeld, worden vermeld in de Tabel .
- Autoclaaf alle dissectie-instrumenten en sla ze op in een steriel gebied. Gebruik de volgende instrumenten: 4 standaardpincen (2 lange en 2 korte) en 2 scharen,Evenals 2 tang (1 lang en 1 kort) en 1 schaar voor de dissectie; Houd een extra set als back-up.
- Bereid 100 ml steriele PBS / 1% FBS oplossing voor gebruik tijdens wasingen, immunolabeling procedures en celsorteringsstappen. Houd de oplossing bij 4 ° C gekoeld.
Opmerking: Voeg geen natriumazide (NaN 3 ) toe aan de oplossing, omdat het giftig is voor levende cellen.- Bereid 100 ml PBS / 1% FBS op met 99 ml PBS en 1 ml FBS.
- Bereid 100 ml steriele neurale celmedium aangevuld met 3% FBS (zie de Tabel van Materialen ) voor gebruik als verzamel- en cultuurmedium. Houd celcultuurmedium steriel bij 4 ° C. Verwarm het voor kamertemperatuur (RT) alleen voor gebruik.
- Bereid 100 ml neuraal celmedium aangevuld met 3% FBS aan met gebruik van 97 ml neurale celmedium en 3 ml FBS.
- Pre-chill collectie buizen (15 ml buizen) vooraf bedekt met 5 ml verzamelmedium door t te plaatsenZoom in een ijsemmer. Gebruik alleen polypropyleenbuizen om te voorkomen dat de cellen aan het buisoppervlak vastkomen.
- Plaats 40 mm schotels, 70 μm nylon snippers, spuiten, pestles voor de celsilinder en steriele polypropyleen buizen in de biosafety kast. Steriliseer alle items vóór de procedures en houd ze op een steriele manier door de procedures.
Opmerking: Alle stappen na de verzameling van de retinae worden uitgevoerd in de biosafety-kast.
2. Enucleatie
Opmerking: In dit experiment werden 10 jonge (5-7 weken oude) C57BL / 6J muizen gebruikt om 1,0 x 106 RGC's te isoleren met het fenotype CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg .
- Euthanize de muizen met behulp van CO 2 inhalatie gevolgd door cervicale dislocatie. Gebruik altijd een secundaire euthanasiemethode om ervoor te zorgen dat het gezochte dier dood is.
- Steek pincet onder de bol van het oog, grijp de optische zenuw en trek het op; De globe wordt geucleateerd, met de optische zenuw intact. Plaats de verzamelde ogen in een injectieflacon met PBS en houd de injectieflacon op ijs tot de volgende stap.
Opmerking: Iedere medewerker kan deze stap uitvoeren na ontvangst van de passende training van de Laboratorium voor dierenarts (LACU).
3. Bereiding van de retinale cel suspensie
- Plaats het verzamelde oog op de basisplaat van een dissectiemicroscoop om de hoornvliesdissectie te beginnen. Dissect elk oog individueel.
- Houd de klok voorzichtig vast op de optische zenuwbasis met behulp van tang. Voor deze stap, gebruik een lonG, en een korte standaardpincet.
- Gebruik een 30-gauge (30G) scherpe naald om de hoornvlies te punkeren om de waterige humor te laten evacueren vanuit het oog, waardoor het makkelijker wordt om het oog vast te houden met de tang.
- Houd de hoornvlies met de tang en gebruik een schaar om een kleine incisie in de hoornvlies te maken. Schud de hoornvlies en sclera voorzichtig met behulp van de tang. Wanneer de bol half wordt geschild, rol dan de retina en lens uit met behulp van de tang. Gooi de hoornvlies, sclera en lens weg.
Opmerking: deze methode zorgt ervoor dat het netvlies volledig loskomt van de rest van het oog. - Plaats het netvlies in een kleine 40 mm Petri-schotel met PBS / 1% FBS.
Opmerking: Als alternatief voor de Petri-schotel kan een celcultuurschotel gebruikt worden. Zorg ervoor dat de retinae altijd vochtig blijft, zoals bij fysiologische omstandigheden.- Was elk retina driemaal met verse steriele PBS / 1% FBS in de biosafety-kast.
- Plaats maximaal 12 retinae aanEen steriel 70 μm nylon straal bevochtigd met PBS / 1% FBS. Gebruik het achterkant van een 10 ml spuit, maak de retinae voorzichtig met behulp van een cirkelvormige beweging om de cellen los te maken.
- Als alternatief gebruik je een stamper voor de maceratie van de celstraal of gebruik enzymatische vertering met een combinatie van 15 IE / ml papain, 5 mM L-cysteïne en 200 U / ml DNase I gedurende 15 minuten bij 37 ° C, gevolgd door inactivering met PBS / 10% FBS.
Opmerking: Er werden geen veranderingen in het percentage teruggekomen cellen waargenomen wanneer enzymatische spijsvertering werd vergeleken met maceratie met het achterkant van de injectiespuit of de stamper.
- Als alternatief gebruik je een stamper voor de maceratie van de celstraal of gebruik enzymatische vertering met een combinatie van 15 IE / ml papain, 5 mM L-cysteïne en 200 U / ml DNase I gedurende 15 minuten bij 37 ° C, gevolgd door inactivering met PBS / 10% FBS.
- Om de geïsoleerde cellen over te brengen, plaats de steriele 70 μm nylon filter over de polypropyleen collectie buis. Pass de verzamelde cellen door de filter met een P1000 pipet. Spoel de zeef ( stap 3.6 ) met PBS / 1% FBS om eventuele resterende cellen vrij te geven en over te brengen naar de verzamelbuis.
- Voeg PBS / 1% FBS toe aan achEen eindvolume van 1 ml per netvlies. Centrifugeer de cel suspensie gedurende 7 minuten bij 200 xg en RT.
Opmerking: Afhankelijk van het aantal gesmolten retinae (<6 retinae), kan de celpelletje te klein zijn om zichtbaar te zijn.- Verwijder de cel supernatant en resuspendeer de celpellet in PBS / 1% FBS met een verhouding van 1 ml per 5 retinae.
- Tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
- Maak een glazen hemocytometer en deklaag met 70% alcohol schoon. Wissel de buis die de cellen bevat zorgvuldig om om ervoor te zorgen dat de retina cel suspensie gelijkmatig verdeeld is. Plaats 20 μL 0,4% trypan blauw in een microcentrifugebuis en meng met 20 μl van de celsuspensie.
- Meng zachtjes en voeg 10 μL van de 0,4% trypanblauw / cel suspensie mix toe aan de hemocytometer, vul beide kamers; Capillaire werking trekt de 0,4% trypan blauw / cel suspensie mix onder de deklaag. Met behulp van een microscoop tellen alle trypan-blauw-negatieve cellen; thiHet getal vertegenwoordigt de levende cellen.
- Bepaal de levensvatbaarheid van de cel met behulp van de volgende formule: aantal levende cellen / totale celtelling =% levensvatbaarheid.
Opmerking: Als de levensvatbaarheid van de cellen kleiner is dan 95%, is het gebruik van fluorescerende kleurstof voor discriminatie van celliviteit vereist tijdens FACS.
- Gebruik een fluorescerende levensvatbaarheid kleurstof die niet-permeant is voor levende cellen. Was de cellen met PBS om elke sporen van serum te verwijderen. Voeg 1 μL fluorescerende kleurstof toe voor discriminatie op cellevendigheid per 5,0 x 106 cellen in een 100 μl eindvolume. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten, beschermd tegen licht. Voeg 10x het volume PBS / 1% FBS toe. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 xg en RT.
- Incubeer de celsuspensie overnacht bij 4 ° C, indien nodig. Als dit gedaan is, vul de cel suspensie buis met neurale cel medium in plaats van PBS / 1% FBS. Plaats de buis horizontaal en houd deze bij 4 ° C.
4. Immunolabeling van de ReTinale cellen
- Gebruik de volgende omzetting om het volume van antilichaam per celnummer te bepalen: 2 μl antilichaam per 5,0 x 106 cellen in een volume van 100 μl.
- Was de cellen en houd ze in PBS / 1% FBS. Neem een kleine aliquot van cellen (5,0 x 10 6 cellen) om als negatieve controle (ongemerkt) te gebruiken op het moment van de sorteringsinstelling.
Opmerking: Deze negatieve controle is van cruciaal belang voor de juiste kalibratie van de celsoort. - Om de niet-specifieke binding van antilichamen tegen de cellen die de Fcγ-receptoren II en III uitdrukken te minimaliseren, voeg 1 μl van een anti-muis CD16 / 32-antilichaam per 1,0 x 106 cellen toe in een 50 μl eindvolume onder gebruikmaking van PBS / 1% FBS. Incubeer gedurende 10 minuten bij RT.
- Voeg de antilichaamcocktail toe aan het monster en meng zachtjes door pipettering. Incubeer gedurende 30 minuten in een ijsemmer. Zorg ervoor dat het ijsemmer is bedekt, omdat licht het experiment kan veroorzaken door het fotobakken van de gemarkeerde fluorphores.
- Bereid de antilichaamcocktail aan met behulp van de volgende fluorescente gelabelde anti-muis antilichamen: CD90.2 AF-700, CD48 PE-Cyanine7, CD15 PE en niet-gelabelde CD57.
Opmerking: Voor elk antilichaam gebruik de volgende concentraties per 5,0 x 106 cellen: CD90.2 AF700, 1 μg; CD48 PE-Cyanine7, 0,4 μg; CD15 PE, 0,02 μg; En ongecodeerde CD57, 0,4 μg.- Gebruik de volumes volgens de volgende berekeningen (gebaseerd op de in de tabel van materialen verkrijgbare antilichamen): totaal van 5,0 x 107 cellen die gemerkt moeten worden; 2 μL per 5,0 x 106 cellen = 20 μl van elk antilichaam; 4 verschillende antilichamen = 80 μl antilichaamcocktail; Eindvolume = [(5,0 x 10 7 totale cellen) / 5,0 x 10 6 cellen] x 100 = 1000 μL; 80 μl Abs + 50 μl anti-muis CD16 / 32 + 870 μl PBS / 1% FBS = 1.000 μl.
Opmerking: deze combinatie gaf deOptimale combinatie van fluorochromen voor de instrumentconfiguratie. De volgende parameters samenvatten de emissie en excitatie: AF-700, emissie van 719 nm wanneer opgewonden met een rode diode laser van 638 nm; PE-Cyanine7, emissie van 767 nm wanneer opgewonden met een 488 nm blauwe diode laser; En PE, emissie van 575 nm wanneer opgewonden met een 488 nm blauwe diode laser.
- Gebruik de volumes volgens de volgende berekeningen (gebaseerd op de in de tabel van materialen verkrijgbare antilichamen): totaal van 5,0 x 107 cellen die gemerkt moeten worden; 2 μL per 5,0 x 106 cellen = 20 μl van elk antilichaam; 4 verschillende antilichamen = 80 μl antilichaamcocktail; Eindvolume = [(5,0 x 10 7 totale cellen) / 5,0 x 10 6 cellen] x 100 = 1000 μL; 80 μl Abs + 50 μl anti-muis CD16 / 32 + 870 μl PBS / 1% FBS = 1.000 μl.
- Bereid de antilichaamcocktail aan met behulp van de volgende fluorescente gelabelde anti-muis antilichamen: CD90.2 AF-700, CD48 PE-Cyanine7, CD15 PE en niet-gelabelde CD57.
- Na de 30 minuten incubatie breng het volume tot 5 ml met PBS / 1% FBS. Was de monsters door ze gedurende 7 minuten bij 200 xg en RT te centrifugeren. Herhaal de procedure eenmalig om alle ongebonden antilichamen te verwijderen.
- Voeg 2 μL secundair antilichaam (0,1 μg) toe, dat de CD57 van 5,0 x 106 cellen bindt. Incubeer gedurende 30 minuten in een ijsbak, zoals in stap 4.4 . Was de cellen tweemaal, zoals in stap 4.5 .
- Benoem de cellen met secundair antilichaam als een un-tagged primair antilichaam werd gebruikt in stap 4.4 .
Opmerking: de tweedeAry antilichaam van de keuze voor deze configuratie is vermeld in de Tabel van Materialen ; Het heeft een emissie golflengte van 421 nm. Gebruik het met een bandpassfilter van 450/50 nm wanneer u op 405 nm opgewekt bent met de violette diode laser. - Gebruik volumes volgens de volgende berekeningen (gebaseerd op het in de tabel van materialen verkrijgbare antilichaam): 2 μL per 5,0 x 106 cellen = 20 μL secundair antilichaam; Eindvolume = [(5,0 x 10 7 totale cellen) / 5,0 x 106 cellen] x 50 = 500 μl; 20 μl Abs + 480 μl PBS / 1% FBS = 500 μl.
- Benoem de cellen met secundair antilichaam als een un-tagged primair antilichaam werd gebruikt in stap 4.4 .
- Houd de gelabelde cellen in PBS / 1% FBS. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer; Gebruik een definitieve retinale celconcentratie van 3,0 - 4,0 x 107 cellen / ml.
Opmerking: Gebruik geen celcultuurmedium om de cellen te verdunnen, omdat het fenolrode de autofluorescentie kan verhogen, waardoor de resolutie tussen de negatIve en positieve cellen. De uiteindelijke celconcentratie per volume hangt sterk af van de volumestroom van de instrumentconfiguratie. - Gebruik een-kleurcontroles tijdens het instellen om de fluorescentie te voorkomen.
Opmerking: Deze stap, ook wel compensatie genoemd, wordt toegepast om het geluid dat is gecreëerd door de combinatie van fluoroforen te corrigeren. Polystyreenmicrobolletjes in PBS / 0,1% BSA / 2 mM NaN3 met de capaciteit om fluorescent gemerkte immunoglobuline (Ig) isotypen van meerdere soorten te binden, bieden positieve controles om de compensatie in te stellen.- Plaats 3 druppels polystyreenmicrobolletjes in steriele FACS-buizen, waarbij één per fluorofoor wordt toegewezen. Voeg 1 μg van de respectieve fluorofoor aan elke buis toe. Incubeer gedurende 15 minuten bij RT, beschermd tegen licht. Voeg 3 ml PBS / 1% FBS toe aan de monsterbuizen. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 xg en RT. Verwijder het supernatant zorgvuldig en resuspendeer in 250 μl PBS / 1% FBS.
- Om de negatieve contr. Op te zettenOls, gebruik polystyreen microbolletjes die niet binden aan Ig. Voer deze stap de dag ervoor uit, indien nodig.
5. Cell Sortering Strategie
Opmerking: Specifieke instructies voor instrumentopstelling voor FACS met 355 nm, UV; 405 nm, violet; 488 nm, blauw; En 640 nm, rode lasers met respectievelijk 2, 2, 5 en 3 fluorescentie kanaalverdeling. De operating software was DIVA versie 8.0.1. Cellsortering werd uitgevoerd met een 70 μm spuitmond, 70 psi schede druk, 87,5 frequentie, 48,6 amplitude met eerste druppelafbreking bij 333, gapverdeling van 6, soort precisie ingesteld op vierwegzuiverheid met standaard (32) zuiverheidsmasker en druppel Vertraging aangepast aan 42,98 met behulp van kralen.
- Gebruik 15-ml conische buizen van polypropyleen als verzamelbak. Voeg 5 ml van het verzamelmedium (celcultuurmedium) toe aan elke buis en draai de buis om de muren te bekleden.
Opmerking: deze stap voorkomt dat de cellen aan de zijkant van t vallenHij verzamelbuis. Als alternatief kan de buis worden bekleed met onverdunde FBS. - Houd rekening met de efficiëntie van de cel sorteren om de uiteindelijke opbrengst van cellen te schatten.
Opmerking: De efficiëntie van het soort is afhankelijk van de gebruikte flowcytometer. RGC's met het CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg fenotype omvatten ongeveer 1% van alle retinale cellen. - Laat de celsortering uitvoeren door een opgeleide operator (meestal in een kernfaciliteit). Zorg ervoor dat het instrument voorafgaand aan de aankoop van het monster wordt gereinigd en gesteriliseerd met 70% ethanol. Veeg de buitenkant van de collectiebuisjes met 70% ethanol ook voorzichtig af.
- Als de cellen zijn opgelost of geaggregeerd, pipetteer de cellen omhoog en omlaag en filter de suspensie door een steriele 40-nm nylon zeef voorafgaand aan de overname. Zorg ervoor dat u de temperatuur controleert en het bij 4 ° C houdt terwijl de celsortering wordt uitgevoerd; Als u dit niet doet, zal de cel verminderenIk geef.
- Bespreek de details van het soort met de cel sorteringsoperator voorafgaand aan het uitvoeren van de experimenten.
Opmerking: op het moment van het experiment heeft de cel sorteringsoperator een reeks knoppen geklikt van de werkbalk werkbalk van de acquisitie software voor de cytometer. Dit zijn de Browser- , Cytometer- , Inspector- , Worksheet- en Acquisition Dashboard . De strategie die hier gebruikt wordt, is bekend als een 2-weg sorteren. Er worden twee populaties verzameld: de verrijkte RGC's en alle andere celtypen. Als er extra populaties worden verzameld, kunnen maximaal twee extra populaties worden geïsoleerd als een 4-weg sorteren. Als er extra populaties worden verzameld, vereist de cel sorteren verschillende verzamelbuizen en opstelling. - Compensatie uitvoeren om te corrigeren voor spectrale overlap van de fluorophoren.
Opmerking: dit proces kan handmatig worden gedaan door aan te passenElke instelling, of het kan automatisch worden gedaan als onderdeel van de software die in gebruik is. De meeste software voor celsorteringsapparatuur heeft de mogelijkheid tot automatische compensatie. Het wordt beschouwd als de gouden standaard en het meest nauwkeurige type compensatie. Het negatieve (geen fluorofoor) monster en de enkele controles die zijn bereid met polysterenmikrobolletjes (Compensatiekralen) die specifiek zijn vervaardigd om alle relevante monoklonale antilichamen die in het experiment werden gebruikt, zullen in deze stap worden gebruikt.- Selecteer Experiment> Compensatieinstellingen> Compensatiecontroles maken . Voeg de fluorofoor-specifieke controles toe van de lijst die op het scherm wordt weergegeven. Klik op OK .
Opmerking: een compensatiebuis voor elk van de bedieningselementen wordt weergegeven.- Gebruik een niet-gemarkeerde controle (geen fluorofoor, stap 4.2 ) om het voorgestrooide licht (FSC), het zijdestrooide licht (SSC) te controleren en de initiële populatie (P1) te verzekeren.
- Installeer de negatieve controlebuis op de cytometer en klik op Load. Controleer of de populatie van interesse wordt weergegeven en selecteer het. Dit is populatie 1 (P1). Klik met de rechtermuisknop op de P1-poort en kies Apply to All Compensation Controls . Klik op Record Data . Zodra de opname is gedaan, klik op Unload en verwijder de buis.
- Installeer de volgende buis op de cytometer, zoals weergegeven op het scherm. Herhaal stap 5.6.2 totdat alle gegevens van de bedieningselementen zijn opgenomen.
- Selecteer Experiment> Compensatieinstelling> Compensatie berekenen . Sla de setup op en noem het experiment. Klik op Koppeling en opslaan .
Opmerking: Compensatie is een noodzakelijke stap, omdat het de overlapping van het spectrum tussen de detectors verwijdert. - Als handmatige compensatie nodig is, doe dit door de middelen van de positieve signalen aan te passen, zodat ze de negatieven voor eac gelijkenH van de gebruikte fluorochromen.
Opmerking: deze stap wordt gedaan door de cel sorteringsoperatie en kan 30 minuten duren.
- Selecteer Experiment> Compensatieinstellingen> Compensatiecontroles maken . Voeg de fluorofoor-specifieke controles toe van de lijst die op het scherm wordt weergegeven. Klik op OK .
- Gatingstrategie ( Figuur 3A ).
- Stel P1 op door FSC versus SSC te plotten; De FSC is indicatief voor de grootte en het SSC geeft de interne complexiteit van de cellen aan. Zie figuur 3A .
- Teken een pseudocolor plot van SSC-H (hoogte) versus SSC-W (breedte) met de geselecteerde populatie in stap 5.7.1 (P1); Het pseudocolor plot zorgt voor de visuele weergave van de dichtheid van cellen ten opzichte van elkaar.
Opmerking: een lagere celdichtheid wordt weergegeven door blauw en groen, terwijl rode en oranje gebieden hoge celdichtheid vertegenwoordigen.- Voer deze stap uit om alleen enkele cellen te verzamelen; De enkele celpoort heet P2. Zie figuur 3A .
- Herhaal stap 5.7.2 totPlot FSC-H versus FSC-W met P2. Zorg ervoor dat de selectie van enkele cellen als "doublets" of cell clumps zowel een positieve als een negatieve markering bevat, waardoor valse positiviteit wordt gegeven.
- Teken een pseudocolour plot van CD90.2 versus CD48. Selecteer alle CD90.2 + CD48 negcellen om monocyten uit de RGC-verrijking te elimineren; Bel deze poort CD90.2 + CD48 neg , of P3. Zie figuur 3A .
- Gebruik de geselecteerde CD90.2 + CD48 neg populatie of P3 poort, teken een pseudocolor plot van CD57 versus CD15 om amacriene celverontreinigingen uit de RGC verrijking te elimineren. Poort de CD15 neg CD57 neg populatie. Zie figuur 3A .
- Definieer de populaties die voor het monster moeten worden verzameld in het venster 'Sorteren layout' en ga verder met de celsortering; Het monster dat u verzamelt is CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg p>.
Opmerking: de te sorteren populatie is geselecteerd in het vervolgkeuzemenu Toevoegen in het sorteervenster. Na het toevoegen van de populatie zal het vragen om doelgebeurtenissen of hoeveel gebeurtenissen moeten worden verzameld. Op elk gewenst moment kan de soort layout worden bewerkt door te klikken op het sorteerveld met de populatie. 0,9% ± 0,3 van RGC's met het fenotype CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg worden verkregen bij jonge (5-7 weken oud) en 0,5% ± 0,3 en oude (> 12 maanden oude) C57BL / 6J muizen 23 . - Gebruik 25.000 cellen, voer een zuiverheidscontrole uit 23 . Zie figuur 3B -E.
Opmerking: de zuiverheidscontrole is het proces om de gesorteerde cellen opnieuw te analyseren om de nauwkeurigheid van de celsoort te verifiëren. Een kleine aliquot van gesorteerde cellen zal op de cytometer geladen worden om de effectiviteit van het soort te verifiëren.
- Intracellulaire etikettering.
- Fixeer gesorteerde cellen gedurende 1 uur en permeabiliseer bij 4 ° C om de cellen metabolisch inactief te maken en de penetratie van intracellulaire antilichamen mogelijk te maken.
- Verdun de volgende antilichamen in de permeabiliseringsoplossing: anti-RNA bindend eiwit met meerdere splitsing (RBPMS) bij een verdunning van 1: 100 in een 100 μg / ml voorraad; Anti-synucleine gamma (SNCG), 1: 100 in een 1 mg / ml voorraad; Hersenspecifieke homeobox / POU domein eiwit 3A (BRN3A), 1: 100 in een 200 μg / ml voorraad; En anti-neuron-specifieke klasse III bèta tubuline (TUJ1), 1: 100 in een 1 mg / ml voorraad. Incubeer de cellen en antilichaamoplossingen gedurende 1 uur in een overdekte ijsemmer.
- Was de monsters tweemaal met PBS / 1% FBS.
- Resuspendeer de cellen in een geschikt AF488-getagd secundair antilichaam bij een 1: 200 verdunning gedurende 30 minuten in een ijsemmer.
- Was de monsters zoals in stap 6.1.3. Houd de cellen inPBS / 1% FBS (250 μL) tot klaar om te analyseren.
7. Validatie van de cel Sorteer op qPCR Analyse
Opmerking: zie figuur 4 .
- RNA-extractie 23 .
- Extracteer het RNA van 5,0 x 10 5 gesorteerd cellen door cellysis en homogenisatie gevolgd door de toevoeging van chloroform.
- Breng de bovenste kleurloze fase over naar een schone microtube voor alcoholafzetting, gevolgd door extractconcentratie in een spin kolom. Doe DNA-spijsvertering op de kolom.
- Was de kolom met RNase-vrij water voor RNA-elutie.
- Bepaal de RNA-concentratie door spectrofotometrie.
- CDNA synthese en pre-amplificatie.
- Gebruik 100 ng RNA materiaal en meng met een oplossing die reverse transcriptase enzym bevat, recombinante ribonuclease remmers (om RNA afbraak te voorkomen), magnesiumchloride (MgCL2) en deoxynucleotiden.
- Meng de buisinhoud en incubeer gedurende 10 minuten bij 25 ° C gevolgd door 60 minuten bij 42 ° C. Beëindig de reactie met een 5 minuten incubatie bij 85 ° C. Bewaar het resulterende cDNA bij -20 ° C tot klaar om te gebruiken.
Opmerking: cDNA-materiaal kan maximaal een maand bij -20 ° C worden opgeslagen als de pre-amplificatie stap niet onmiddellijk kan worden uitgevoerd.
- Pre-amplificatie van cDNA.
- Pre-amplificeren cDNA materiaal met behulp van een reeks primers die specifiek zijn voor meerdere retinale cel typen, waaronder: retinale ganglioncellen, amacrine cellen, astrocyten, Müller, bipolaire, horizontale, fotoreceptoren en epitheelcellen van retinale pigmenten, zoals gedetailleerd in Referentie 23 en in de tabel Van materialen .
Opmerking: De pre-amplificatiereactie is bereid om de gevoeligheid van detectie voor kwantificering te verhogen. De pre-amplificatiereactie bevat een mengsel van de primerMengt uit de tabel van materialen ; 2,5 μl cDNA, dat begon bij 100 ng RNA; Reverse transcriptase enzym; En nuclease-vrij water in een eindvolume van 10 μl. - Voer de enzymactiveringsstap bij 95 ° C gedurende 10 minuten uit, gevolgd door 14 cycli bij 95 ° C gedurende 15 s, gevolgd door 60 ° C gedurende 4 minuten. Verdun het voorversterkte materiaal 1:10 in Tris EDTA-buffer en hou het bij -20 ° C tot het klaar is voor gebruik.
- Pre-amplificeren cDNA materiaal met behulp van een reeks primers die specifiek zijn voor meerdere retinale cel typen, waaronder: retinale ganglioncellen, amacrine cellen, astrocyten, Müller, bipolaire, horizontale, fotoreceptoren en epitheelcellen van retinale pigmenten, zoals gedetailleerd in Referentie 23 en in de tabel Van materialen .
- 7.4 qPCR reactie.
- Bereid alle qPCR reacties op in een eindvolume van 10 μL met behulp van de verdunde, voorversterkte cDNA (2,5 μL), primers (vermeld in de Tabel van Materialen ), nuclease-vrij water en een concentraat met DNA-polymerase en deoxynucleotiden.
- Gebruik de volgende instrumentomstandigheden om de qPCR te laten draaien: een vasthoudstap van 50 ° C gedurende 2 minuten, gevolgd door 95 ° C gedurende 10 minuten. Loop in totaal 40 cycli bij 95 ° C gedurende 15 s gevolgd door 60 ° C gedurende 1 minuut. Voer alle maten uitEmenten in replicaten van drie.
- Bereken relatieve kwantificering met behulp van de vergelijkende drempel (C T ) na het bepalen van de waarden van C T voor het huishoudingsgen en de doelgenen in elk monster. Bereken de relatieve vouwverandering (R q ) aan de hand van de volgende vergelijking: R q = 2 T- AC , waar ΔC T = C T doelgenen - C T referentie gen 23 .
Opmerking: De CT wordt gedefinieerd als de PCR cyclus waarbij het fluorescerende signaal van de reporter kleurstof een willekeurig geplaatste drempel 26 overschrijdt. De C T is omgekeerd gerelateerd aan de hoeveelheid amplicon (PCR-product) in de reactie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De diepgaande studie van RGC's wordt belemmerd door vele factoren, waaronder hun lage frequentie en het ontbreken van een robuuste en gestandaardiseerde methodologie voor hun isolatie. Figuur 1 toont de methodologie die wordt gebruikt voor retinae isolatie. Variaties in de enucleatieprocedure bestaan op basis van het soort analyse, zoals als de enucleatie onderdeel uitmaakt van in vivo experimenten 27 . Enucleatie in dit protocol wordt uitgevoerd op euthanized muizen. Zoals getoond in Figuur 1A- B , worden tangen onder het oog geplaatst en getrokken om minimale bloeden te veroorzaken en een oogbol met een intacte optische zenuw te verwijderen.
Er bestaan verschillen in het aantal RGC's in verschillende muizenstammen, vooral in genetisch veranderde muizen 23 , 28 ,Ef "> 29 , 30. Bewustwording van deze verschillen is belangrijk bij het bepalen van het aantal muizen dat moet worden gebruikt. Retinae van oude C57BL / 6J muizen hebben minder levend retinale cellen dan hun jongere tegenhangers 23. Daarom moet retinale dissectie zorgvuldig worden uitgevoerd aan Een stap-voor-stap procedure voor retinale dissectie wordt weergegeven in Figuur 1C- J . Retinale cellen zijn breekbaar. Daardoor worden dissectieve retinae in nylonfilters geplaatst en gemerkt met ofwel het achterkant van een injectiespuit, zoals Getoond in Figuur 2A , of met een stamper voor celsusters. De maceratie van cellen direct in de celsilinder is snel en vermindert de cellencellen. Een representatief beeld van de celsuspensie wordt geïllustreerd in Figuur 2B . Meerdere binnenste retinale cellen kunnen worden geïllustreerd. Op dit punt hebben de RGC's hun handtekening morpholo verlorenGy als gevolg van axotomie tijdens celisolatie en de bereiding van de celsuspensie.
De meest arbeidsintensieve stap van deze methodologie is de celsorteringsinstelling. Deze fase is een kritische stap tijdens multicolor FACS, omdat het de signaal-ruisoplossing maximaliseert. Figuur 3A toont de gate strategie die wordt gebruikt voor de isolatie van RGC's. Deze strategie richtte op het verwijderen van verontreinigende cellen uit de cel suspensie, die monocyt-, glial-, amacrine- en fotoreceptorcellen omvatte. Als onderdeel van de methodologie werden aanvullende oppervlakmarkeringen bevestigd door immunohistochemische analyse voordat ze werden gebruikt als onderdeel van de uitsluitingstrategie. Vorige gegevens aangetoond dat een klein percentage CD90.2 + cellen CD48 + zijn . Uitsluiting van deze cellen verwijderde monocyten en eventueel microglia uit het retinae cel pool. Het is eerder aangetoond dat de klassieke Thy1 + CD48 neg 23 te identificeren en te isoleren, aangezien deze cellen genen uitmaken die verband houden met amacrine, Müller, bipolaire, horizontale fotoreceptor en epitheelcellen van retinale pigmenten ( Figuur 4A ). Dit wordt verder behandeld door aanvullende markers voor celuitsluiting te onderzoeken. CD15 is beschreven als een markering van amacrine en bipolaire cellen 31 , waardoor het gebruik daarvan als een aanvullende marker voor negatieve selectie wordt aangeduid. Werk van Uusitalo et al. 32 beschreef CD57 als een identificatiemerk voor gliale cellen en fotoreceptoren. Daarom werd dit antilichaam toegevoegd aan de celsorteringsstrategie.
Vervolgens werden deze cellen gekenmerkt om de methodologie te valideren voor de isolatie van murine RGC's. De fenotypes van de CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg gesorteerde cellen (<Sterke klasse = "xfig"> Figuur 3B) werden geëvalueerd voor de expressie van de volgende intracellulaire markers geassocieerd met RGC's 10 , 11 , 12 , 33 : SNCG, BRN3A, TUJ1 en RBPMS. Zoals getoond in Figuur 3C , hebben de gesorteerde cellen alle vier RGC-geassocieerde intracellulaire eiwitten uitgedrukt. Vervolgens werd imaging flow cytometry gebruikt in Figuur 3D om de intracellulaire lokalisatie van RBPMS en de celoppervlak expressie van CD90.2 te tonen. Deze resultaten werden getest in meerdere cytometersystemen, die de reproduceerbaarheid en standaardisatie bevestigen. Zoals getoond in Figuur 3E , begonnen sommige van de gesorteerde cellen de morfologie die geassocieerd werd met RGC's na in vitro celcultuur.
Ten slotte, een vergelijking van cellen voorafgaand aan verrijking en post-ceLl analyse werd uitgevoerd door qPCR analyse. Vergelijking van het Thy1 + CD48 neg fenotype aan de CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg gesorteerde cellen bleek dat het Thy1 + CD48 neg fenotype genen geassocieerd met RGCs, maar ook met andere retinale cellen tot expressie brengt. De sterk verrijkte gesorteerd celpopulatie ( Figuur 4B ) vertoonde echter een veelvoudige toename in de genen die coderen voor de RGC-specifieke intracellulaire markers Sncg (SNCG), Pouf4l (BRN3A), Tubb3 (TUJ1) en Rbpms (RBPMS). Collectief hebben de mRNA en eiwitbeoordelingen de methodologie gevalideerd.
Figuur 1 . Enucleatie en Oculaire Dissectie voor Retinale Isolatie. Jonge C57BL / 6J-muizen werden geëuthaniseerd voorafgaande tO oog gloeilamp verwijderen met CO 2 en cervicale dislocatie. A) Plaats de tang onder het oog en trek het oog in één beweging op. B) Het oog wordt verwijderd, inclusief de optische zenuw. CJ) Stap-voor-stap gids om het netvlies te verwijderen. C) Een punctie wordt uitgevoerd met behulp van een 30G-naald voor de verwijdering van cornea om de waterige humor toe te laten om het oog te verlaten. D) De hoornvlies wordt gehouden met tang om een kleine incisie te maken. EF) Het gebruik van pincet maakt het mogelijk om de hoornvlies, retinale pigmentepitheel, choroid en sclera af te plakken. Het netvlies wordt losgemaakt van de sclera, gerold en verwijderd. G) De lens wordt verwijderd en weggegooid. HJ) De verzamelde retinae worden in een kleine schotel met PBS / 1% FBS geplaatst om te allen tijde vochtig te houden. Klik hier om een grotere versie van dit te zienfiguur.
Figuur 2 . Retinale cel suspensie na de maceratie van verzamelde retinae. De verzamelde retinae worden in een kleine schotel geplaatst om de cellen te isoleren. A) Retinae wordt in een 70 μm nylon zeef geplaatst en gemerkt met behulp van het achterkant van een injectiespuit. B) Representatief beeld van de celsuspensie, waar duidelijke retinale cellen worden waargenomen. De schaalbalk is 10 μm.
Figuur 3 . Sorteerstrategie voor de isolatie van cellen met de CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57
Figuur 4 . Pre- en post-sortering mRNA analyse. Thy1 + CD48 neg en gesorteerd cellen met het fenotype CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg werden beoordeeld door qPCR analyse onder gebruikmaking van een paneel van 25 genen uitgedrukt door retinale cellen. Doelgenenuitdrukkingsniveaus worden gepresenteerd als een log 2- voudige verandering met behulp van Hprt als een huishoudingsgen en water als een negatieve controle. De berekening is gedaan op basis van de ΔC T methode. Gemiddelde ± SEM; N = 3 biologische replicaten werden uitgevoerd in drievoud. Cijfers verkregen uit eerder gepubliceerd werk met toestemming 23 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FACS is de gewenste techniek om celpopulaties te zuiveren. Andere isolatiemethoden omvatten immunopanning, magnetische kralen en complement-fixatie-uitputting. Het voordeel van FACS over deze andere methodologieën is gebaseerd op de gelijktijdige identificatie van celoppervlakmarkers met verschillende intensiteitsgraden. De fluorescerende intensiteit van het molecuul is evenredig aan de hoeveelheid eiwituitdrukking. Tot nu toe was de isolatie van RGCs uitsluitend gebaseerd op Thy1 (CD90) positiviteit en CD48 negativiteit 15 , 16 , 22 , 34 , ongeacht de gebruikte isolatie methode. Recent is aangetoond dat het Thy1 + CD48 neg fenotype niet voldoende is om een homogene populatie van cellen te isoleren die RGC intracellulaire markers 23 uitdrukken. Identificatie van de RGC-bevolking is essentieel voor hun isolatie, in het bijzonderY omdat ze een klein percentage van retinale cellen 7 , 8 , 9 omvatten. De meeste RGC's bevinden zich in de binnenste laag van het netvlies, terwijl een klein aantal zich bevindt in de binnenste plexvormige lagen (verplaatsde RGC's 35 ). Zo werden aantrekkelijke keuzes voor veel laboratoria 36 , 37 , 38 , het traceren van RGC's van de superieure colliculi door stereotactische injecties en het traceren met hydroxystillbamidine (een retrograde tracer voor het omschrijven van neuronen). Deze systemen vereisen de injectie van tracer, die, indien niet goed uitgevoerd, kan leiden tot een aantal retinale gebieden die onopgelopen zijn. Bovendien zijn ze technischer veeleisend en zijn ze, zoals andere methoden zoals immunopanning, lang. Immunopanning met behulp van anti-Thy1 en -CD48 antilichamen duurt 48 uur om te voltooien en bereikt niet meer dan 95% puurheid. Dit werk beschrijft een FACS-gebaseerde methodologie die een snel en reproduceerbaar protocol biedt om een homogene populatie van levende RGC's te isoleren met het CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg fenotype, zonder gebruik te maken van tracers, magnetische kralen of immunopanning technieken .
De volgende factoren zijn vereist voor de succesvolle isolatie van zuivere RGC's door FACS: 1) sorteringsefficiëntie, die sterk afhankelijk is van de gebruikte apparatuur; 2) optimale combinatie van antilichaam-gelabelde fluorochromen, om geluid te minimaliseren; En 3) cel sortering setup. De soort efficiëntie wordt berekend door het aantal doelgebeurtenissen te selecteren die geselecteerd zijn voor sorteren, gedeeld door het aantal geconstateerde doelgebeurtenissen, uitgedrukt als percentage. De soort efficiëntie is een berekening die door de apparatuur wordt geleverd. Deze efficiëntie hangt af van de opstelling van het sorteringssysteem en de celsorteringsmodus. Het kiezen van een optimale combinatie van fluorochromen is een complex proces. Elke griepOrochroom heeft verschillende eigenschappen en wordt gekenmerkt door de excitatie- en emissiegolflengten. Terwijl de excitatie wordt gelezen met een laser, wordt de emissie gelezen door fotomultiplicatorbuizen, die beperkt zijn door de optische filters die beschikbaar zijn in de FACS sorteerapparatuur. Hier wordt een combinatie van antilichaam gemerkte fluorochromen PE, PE-Cyanine7, AF700 en BV421 verschaft. Dit werd bepaald na het overwegen van meerdere fluorochrome combinaties die de beste resolutie leverden terwijl spectrale overlap werd verminderd. Ten slotte is de soort setup kritisch. In het algemeen zijn retinale cellen fragiel. Zo is het best om een lagere druk te gebruiken om de monsters te rennen, om de stress op de cellen te minimaliseren. Het is cruciaal om het monster bij 4 ° C te houden, omdat het bij kamertemperatuur muizen RGC's gedurende langere tijd houden, kan de celopbrengst verminderen, vooral bij het sorteren van grote aantallen cellen.
FACS-gebaseerde sortering is een ideale methode voor het isoleren van cellen die samenkomenErie klein percentage van de cel suspensie. Het proces, van retinale dissectie tot het voltooien van celsortering, duurt ongeveer 5 - 6 uur, in vergelijking met immunopanning en tracer systemen, die dagen duren om te voltooien. De multidimensionale analyse van FACS en het vermogen van de apparatuur om verscheidene levensvatbare populaties te verzamelen maakt het mogelijk om verdere functionele analyses van cellen uit te voeren. Het hier beschreven protocol is een krachtig hulpmiddel voor het isoleren van primaire murine RGC's. Ondanks zijn meerdere voordelen, waaronder de gevoeligheid, reproduceerbaarheid en de directe identificatie van levensvatbare cellen, zijn er enkele beperkingen. Ten eerste vereist het dure instrumentatie en een hoog opgeleide operator. Meestal is de exploitant een immunoloog of een hoog opgeleid individu in het veld, met wie nodig is om te ontmoeten ten tijde van de experimentopstelling. Tegenwoordig beschikken de academische faciliteiten over meerdere kernfaciliteiten, waardoor dit soort experimenten kunnen worden vergemakkelijkt. Ten tweede verliezen RGC's hun tyPical morfologie als gevolg van atoxomie, waardoor ze zeer klein in grootte. Op dit moment is het niet bekend of sommige van hun genen gemoduleerd kunnen worden door atoxomie.
De methodologie die hier wordt gepresenteerd, zorgt voor de downstream analyse van de RGC functie in vitro en is een waardevol instrument dat gebruikt kan worden op het gebied van visuele en gezondheidswetenschappen. Het behoud van ganglionceluitgang naar de hersenen is nodig voor visuele waarneming en is in gevaar bij meerdere ziekten. Deze cellen kunnen gebruikt worden voor gecontroleerde in vitro- experimenten, zowel in gezonde als ziektebeelden. Elektrofysiologische, farmacologische, biochemische en moleculaire studies kunnen op deze cellen worden uitgevoerd, die ideaal is voor de ontwikkeling van toekomstige therapeutische doelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
De auteurs willen de heer Tim Higgins, Senior Illustrator van de afdeling Microbiologie, Immunologie en Biochemie, bedanken voor technische video assistentie; Dr. Matthew W. Wilson voor discussies en de leden van de laboratoria Jablonski en Morales-Tirado voor hun nuttige opmerkingen. Dit werk werd ondersteund door de Alcon Research Institute Young Onderzoeker Award (VMM-T), de Universiteit van Tennessee Research Foundation (VMM-T), het National Eye Institute EY021200 (MMJ), de Gerwin Fellowship (VMM-T); De Gerwin Pre-doctoral Society (ZKG), het ministerie van Defensie Army Medical Research and Materiel Command (VMM-T) en de onbeperkte subsidie van onderzoek om blindheid te voorkomen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse CD15 PE | BioLegend | 125606 | Clone MC-480 |
| Anti-mouse CD48 PE-Cy7 | BioLegend | 103424 | Clone HM48-1 |
| Anti-mouse CD57 | Sigma Aldrich | C6680-100TST | Clone VC1.1 |
| Anti-mouse CD90.2 AF700 | BioLegend | 105320 | Clone 30-H12 |
| Brilliant Violet 421 Goat Anti-mouse IgG | BioLegend | 405317 | Clone Poly4053 |
| Purified Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | FcgRII/III block, Clone 93 |
| Zombie Aqua | BioLegend | 423102 | Live cell/ Dead cell discrimination |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | U.S. origin |
| AbC Total Antibody Compensation Bead Kit | Thermo Fisher Scientific | A10497 | Multi-species Ig |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Add serum to media prior to culture. |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | Saline solution |
| Dissection Microscope | Olympus | SZ-PT Model | Stereo Microscope |
| Sorvall Centrifuge | Thermo Scientific | ST 16R | All centrifugation performed at RT |
| Base Plate – Dissection Pan | Fisher Scientific | SB15233FIM | A wax plate can also be used |
| Forceps | Aesculap | 5002-7 | 4 ½ inches |
| Iris Scissors, Straight | Aesculap | 1360 | 5 ½ inches |
| Falcon 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 352097 | Polypropylene tubes |
| Falcon 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 352098 | Polypropylene tubes |
| BD FACS Tubes | Fisher Scientific | 352003 | Polypropylene tubes |
| 40 mm dishes | MidSci | TP93040 | Tissue culture treated |
| 70 μm nylon strainer | MidSci | 70ICS | sterile |
| 40 μm nylon strainer | MidSci | 40ICS | sterile |
| BD 10 mL syringe | Fisher Scientific | 301604 | Disposable Syringe without needle |
| Pestles | MidSci | PEST | sterile |
| Wheaton Vials | Fisher Scientific | 986734 | No Liner |
| BD 30 G needle | Fisher Scientific | 305128 | 1 inch |
| Hausser Scientific Bright-Line Glass Counting Chamber | Fisher Scientific | 0267151B | Hemocytometer |
| Gibco Trypan blue 0.4% Solution | Fisher Scientific | 15250061 | Viability Dye |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | 1.5mL |
| EVOS Floid Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | 447113 | Fluorescence Imaging with a 20X objective |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-452 | Used to make 70% Ethanol |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | Rainin | 17014282 | LTS Pipette |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | Rainin | 17014391 | LTS Pipette |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | Rainin | 17014392 | LTS Pipette |
| Rack LTS 1000 mL – GPS-L1000S | Rainin | 17005088 | Blue Rack Sterile Tips |
| Rack LTS 250 mL – GPS-L250S | Rainin | 17005092 | Green Rack Sterile Tips |
| Rack LTS 20 mL – GPS-L10S | Rainin | 17005090 | Red Rack Sterile Tips |
| FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | N/A | Custom order |
| LSR II Cytometer | BD Biosciences | N/A | Custom order |
| Abca8a | Thermo Fisher Scientific | Mm00462440_m1 | Müller cells |
| Aldh1al | Thermo Fisher Scientific | Mm00657317_m1 | Müller cells |
| Aqp4 | Thermo Fisher Scientific | Mm00802131_m1 | Astrocytes |
| Calb2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00801461_m1 | Amacrine, Horizontal |
| Cd68 | Thermo Fisher Scientific | Mm03047340_m1 | Retinal Pigment Epithelial Cells |
| Gad2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00484623_m1 | Amacrine |
| Hprt | Thermo Fisher Scientific | Mm01545399_m1 | House keeping gene |
| Lhx1 | Thermo Fisher Scientific | Mm01297482_m1 | Horizontal |
| Lim2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00624623_m1 | Horizontal |
| Nrl | Thermo Fisher Scientific | Mm00476550_m1 | Photoreceptors |
| Ntrk1 | Thermo Fisher Scientific | Mm01219406_m1 | Horizontal |
| Pcp4 | Thermo Fisher Scientific | Mm00500973_m1 | Bipolar, Amacrine |
| Pou4f1 | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Prdx6 | Thermo Fisher Scientific | Mm00725435_s1 | Astrocytes |
| Prkca | Thermo Fisher Scientific | Mm00440858_m1 | Bipolar |
| Prox1 | Thermo Fisher Scientific | Mm00435969_m1 | Horizontal |
| Pvalb | Thermo Fisher Scientific | Mm00443100_m1 | Amacrine |
| Rbpms | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Rom1 | Thermo Fisher Scientific | Mm00436364_g1 | Photoreceptors |
| Rpe65 | Thermo Fisher Scientific | Mm00504133_m1 | Retinal Pigment Epithelial cells |
| Slc1a3 | Thermo Fisher Scientific | Mm00600697_m1 | Astrocytes |
| Slc6a9 | Thermo Fisher Scientific | Mm00433662_m1 | Amacrine |
| Sncg | Thermo Fisher Scientific | Mm00488345_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Tubb3 | Thermo Fisher Scientific | Mm00727586_s1 | Retinal Ganglion Cells |
| Vim | Thermo Fisher Scientific | Mm01333430_m1 | Müller cells |
| Taqman Universal Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4440047 | qPCR Reagent |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA Isolation |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | cDNA synthesis |
| Taqman PreAmp Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4391128 | Pre-Amplification step |
| BD Cytofix/ Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Fixation/ Permeabilization Buffer |
| BD Perm/ Wash | BD Biosciences | 554723 | Permeabilization Solution |
| RBPMS | Santa Cruz Biotechnology | sc-86815 | intracellular antibody |
| SNCG | Gene Tex | GTX110483 | intracellular antibody |
| BRN3A | Santa Cruz Biotechnology | sc-8429 | intracellular antibody |
| TUJ1 | BioLegend | 801202 | intracellular antibody |
References
- Flammer, J., Orgul, S. Optic nerve blood-flow abnormalities in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 17 (2), 267-289 (1998).
- Bathija, R. Optic nerve blood flow in glaucoma. Clin Exp Optom. 83 (3), 180-184 (2000).
- Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P. A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implication for the treatment of glaucoma. Br J Ophthalmol. 85 (10), 1252-1259 (2001).
- Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye (Lond). 18 (11), 1089-1095 (2004).
- Tian, N., Hwang, T. N., Copenhagen, D. R. Analysis of excitatory and inhibitory spontaneous synaptic activity in mouse retinal ganglion cells. J Neurophysiol. 80 (3), 1327-1340 (1998).
- Schmidt, K. G., Bergert, H., Funk, R. H. Neurodegenerative diseases of the retina and potential for protection and recovery. Curr Neuropharmacol. 6 (2), 164-178 (2008).
- Dreher, B., Sefton, A. J., Ni, S. Y., Nisbett, G. The morphology, number, distribution and central projections of Class I retinal ganglion cells in albino and hooded rats. Brain Behav Evol. 26 (1), 10-48 (1985).
- Williams, R. W., Strom, R. C., Rice, D. S., Goldowitz, D. Genetic and environmental control of variation in retinal ganglion cell number in mice. J Neurosci. 16 (22), 7193-7205 (1996).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Surgucheva, I., Weisman, A. D., Goldberg, J. L., Shnyra, A., Surguchov, A. Gamma-synuclein as a marker of retinal ganglion cells. Mol Vis. 14, 1540-1548 (2008).
- Nadal-Nicolas, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3860-3868 (2009).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Van Bergen, N. J., et al. Recharacterization of the RGC-5 retinal ganglion cell line. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (9), 4267-4272 (2009).
- Wood, J. P., Chidlow, G., Tran, T., Crowston, J. G., Casson, R. J. A comparison of differentiation protocols for RGC-5 cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (7), 3774-3783 (2010).
- Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1 (9), 791-803 (1998).
- Hong, S., Iizuka, Y., Kim, C. Y., Seong, G. J. Isolation of primary mouse retinal ganglion cells using immunopanning-magnetic separation. Mol Vis. 18, 2922-2930 (2012).
- Julius, R. S. The sensitivity of exponentials and other curves to their parameters. Comput Biomed Res. 5 (5), 473-478 (1972).
- Reif, A. E., Allen, J. M. The Akr Thymic Antigen and Its Distribution in Leukemias and Nervous Tissues. J Exp Med. 120, 413-433 (1964).
- Watanabe, M., Noguchi, T., Tsukada, Y. Regional, cellular, and subcellular distribution of Thy-1 antigen in rat nervous tissues. Neurochem Res. 6 (5), 507-519 (1981).
- Haeryfar, S. M., Hoskin, D. W. Thy-1: more than a mouse pan-T cell marker. J Immunol. 173 (6), 3581-3588 (2004).
- Sahagun, G., Moore, S. A., Fabry, Z., Schelper, R. L., Hart, M. N. Purification of murine endothelial cell cultures by flow cytometry using fluorescein-labeled griffonia simplicifolia agglutinin. Am J Pathol. 134 (6), 1227-1232 (1989).
- Shoge, K., et al. Rat retinal ganglion cells culture enriched with the magnetic cell sorter. Neurosci Lett. 259 (2), 111-114 (1999).
- Chintalapudi, S. R., et al. Isolation and Molecular Profiling of Primary Mouse Retinal Ganglion Cells: Comparison of Phenotypes from Healthy and Glaucomatous Retinas. Front Aging Neurosci. 8, 93 (2016).
- Nagdeve, N. G., Yaddanapudi, S., Pandav, S. S. The effect of different doses of ketamine on intraocular pressure in anesthetized children. J Pediatr Ophthalmol Strabismus. 43 (4), 219-223 (2006).
- Ding, C., Wang, P., Tian, N. Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model. Exp Eye Res. 92 (6), 512-520 (2011).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Aerts, J., Nys, J., Arckens, L. A highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening. J Vis Exp. (92), e51936 (2014).
- Li, X., et al. Loss of AP-2delta reduces retinal ganglion cell numbers and axonal projections to the superior colliculus. Mol Brain. 9 (1), 62 (2016).
- Moshiri, A., et al. Near complete loss of retinal ganglion cells in the math5/brn3b double knockout elicits severe reductions of other cell types during retinal development. Dev Biol. 316 (2), 214-227 (2008).
- Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (12), 5151-5162 (2003).
- Jakobs, T. C., Ben, Y., Masland, R. H. CD15 immunoreactive amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 465 (3), 361-371 (2003).
- Uusitalo, M., Schlotzer-Schrehardt, U., Kivela, T. Ultrastructural localization of the HNK-1 carbohydrate epitope to glial and neuronal cells of the human retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (3), 961-964 (2003).
- Jackson, C. J., Garbett, P. K., Nissen, B., Schrieber, L. Binding of human endothelium to Ulex europaeus I-coated Dynabeads: application to the isolation of microvascular endothelium. J Cell Sci. 96 ( Pt 2), 257-262 (1990).
- Pennartz, S., Perraut, M., Pfrieger, F. Purification of retinal ganglion cells from postnatal rats by magnetic cell sorting. MACSmore. 12 (2), 16-18 (2010).
- Nadal-Nicolas, F. M., et al. Displaced retinal ganglion cells in albino and pigmented rats. Front Neuroanat. 8, 99 (2014).
- Nadal-Nicolas, F. M., Salinas-Navarro, M., Vidal-Sanz, M., Agudo-Barriuso, M. Two methods to trace retinal ganglion cells with fluorogold: from the intact optic nerve or by stereotactic injection into the optic tract. Exp Eye Res. 131, 12-19 (2015).
- Barnstable, C. J., Drager, U. C. Thy-1 antigen: a ganglion cell specific marker in rodent retina. Neuroscience. 11 (4), 847-855 (1984).
- Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. (16), (2008).
