Summary
何百万人もの人々が不可逆的な失明をもたらす網膜変性疾患に苦しんでいます。これらの疾患の多くの共通要素は、網膜神経節細胞（RGC）の喪失である。この詳細なプロトコールは、フローサイトメトリーによる陽性および陰性選択による原発性ネズミRGCの単離を記載する。
Abstract
神経変性疾患は、しばしば影響を受ける人々に壊滅的な影響を与える。網膜神経節細胞（RGC）の喪失は、正常な老化に加えて、糖尿病性網膜症および緑内障を含む一連の疾患に関係している。彼らの重要性にもかかわらず、RGCは網膜内の多種多様な細胞のわずかな割合しか占めないという事実のために今まで研究することは極めて困難であった。さらに、現在の単離方法は、細胞内マーカーを使用して、非生存細胞を産生するRGCを同定する。これらの手法には長時間の分離プロトコルも含まれるため、RGCを取得して分離するための実用的で標準化された信頼できる方法が欠けています。この研究は、ポジティブおよびネガティブ選択基準に基づくプロトコールを用いて、マウス網膜から一次RGCを単離するための、効率的で包括的で信頼できる方法を記載する。提示された方法は、RGCの将来の研究を可能にし、主要な神経変性疾患における機能性RGCの喪失に起因する視力の低下。
Introduction
RGCは最終的に分化したニューロンであるため、実験には一次細胞が必要である。原発性ネズミ網膜神経節細胞（RGC）の単離および濃縮のためのプロトコールの開発は、 インビトロでのRGCの健康および変性の機序を明らかにする上で基本的なものである。これは、RGC機能を促進し、その死を最小限に抑えるための潜在的な治療法を生み出そうとする研究にとって特に重要です。 RGCの変性は、緑内障、糖尿病性網膜症および正常な老化などの網膜変性疾患に関連する。 RGC喪失の根底にある特定の細胞機構は不明であるが、一連の危険因子が同定されている。視神経乳頭1、2、3での酸素供給の欠如は、 RGC死を引き起こし、興奮性物質とiの活性化との間のホメオスタシスの障害として作用する個々のRGC内の阻害性受容体5,6 。一連の課題は、詳細な研究のためにこれらの細胞の使用への進展を妨げる。第1に、ネズミ網膜に存在するRGCの数は少ない。 RGCは全網膜細胞の7 ％ 、 8,9 ％未満を占める。第二に、ほとんどのRGC特異的マーカーは細胞内タンパク質10,11,12である。これらのマーカーに基づく選択は、細胞を生存不能にし、下流の機能的分析を排除する。最後に、現在利用可能なプロトコルは長く、標準化が不十分である 13,14 。初期のRGC単離プロトコールはイムノパニング法に基づいていた。 Barres et al。 15 古典的なイムノープを適応させた細胞表面マーカーである抗胸腺細胞抗原（別名Thy1）に対する免疫陽性に基づくポジティブ選択の前に網膜細胞の大部分から単球および内皮細胞を除外した第2段階を加えた。数年後、香港らは、純度の高いRGCを分離するためのセルソーティング戦略と組み合わせた磁気ビーズ分離技術16磁気ビーズの使用は、多くの科学的用途において依然として使用されている。一緒に、磁気ビーズおよびフローサイトメトリープロトコルは、単離された細胞の純度を改善した。しかし、これらの精製システムは、解離した網膜からのネズミRGCの単離のためにまだ標準化されていない。
フローサイトメトリーは、細胞懸濁液の光学特性および蛍光特性を測定する強力な分析方法です。細胞を高レベルの感度で定量的および定性的に分析して、細胞集団の多次元分析を提供するation。細胞の識別は、細胞の大きさまたは表面積、粒状性または内部の複雑さの2つの主要な物理的特性に基づいています。類似の励起波長および異なる放出を有する蛍光色素で標識された抗体を組み合わせることによって、多次元分析を行うことができる。フローサイトメトリーは、迅速で、再現性があり、感度が高い。マルチタイプレーザーは、フローサイトメトリーによる単一細胞のより大きな多次元分析を可能にする。したがって、それは細胞学的標本の研究のための魅力的な方法論である。蛍光活性化細胞選別（FACS）は、フローサイトメトリーによって同定された多次元表現型の差異を用いて、個々の細胞を異なる亜集団に分類する。
過去10年間に、複数の表面タンパク質および細胞内タンパク質が、ニューロンを含む細胞の選択のための潜在的なバイオマーカーとして同定されている。ラットからRGCを単離することを試みた最初の研究は、Th1を神経節細胞として使用したlマーカー。残念ながら、Thy1、 別名 CD90は、他のげっ歯類種18,19,20に複数のアイソフォームを有し、RGCの非特異的マーカーとなる複数の網膜細胞タイプ19,20によって発現される。別の表面マーカー、CD48は、マクロファージおよびミクログリアを含む網膜の単球集団に見出される。これらの2つの表面マーカーを用いて、改変RGCシグネチャー-Thy1 +およびCD48ネガティブ細胞が開発された（15,16,21,22）。残念なことに、これらの2つの選択基準は、高度に濃縮されたRGC集団を選択するのに十分ではない。この満たされていないニーズに対処するために、フローサイトメトリープロトコルが、多層陽性選択基準および陰性選択基準に基づいて開発された一次ネズミRGCを富化および精製するための既知の細胞表面マーカーを提供する。
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Protocol
以下のプロトコールに詳述されている全ての手順は、テネシー州保健科学センター（UTHSC）の機関動物管理および使用委員会（IACUC）の審査委員会によって承認され、使用のためのビジョンアンド眼科研究協会（ARVO）実験動物実験のガイドラインに加えて、眼科および視覚研究における動物の研究（実験動物学研究所、人間のケアと実験動物の使用に関する公衆衛生サービス政策）。
1.機器、ソリューション、およびメディアの準備
注記：プロトコールで報告された材料、試薬、ツール、および機器に関するすべての情報は、材料表に明記されています。
- すべての解剖器具をオートクレーブし、無菌領域に保管します。次の機器を使用してください：4つの標準的な鉗子（2つの長いと2つの短い）と2つのハサミ、切開のための2つの鉗子（1つの長いと1つの短い）と1つのはさみ;余分なセットをバックアップとして保管してください。
- 洗浄中、免疫標識手順、および細胞選別ステップの間に使用する滅菌PBS / 1％FBS溶液100 mLを調製する。溶液を4℃で冷却したままにする。
注：溶液にはアジ化ナトリウム（NaN 3 ）を添加しないでください。生きた細胞に有毒である可能性があります。- 99mLのPBSおよび1mLのFBSを含む100mLのPBS / 1％FBSを調製する。
- 収集および培地として使用するために、3％FBS（ 材料の表を参照）を補充した100mLの無菌神経細胞培地を調製する。細胞培養液を4℃で無菌状態に保つ。使用前には室温（RT）まで暖めてください。
- 97％の神経細胞培地と3mLのFBSを用いて、3％FBSを添加した100mLの神経細胞培地を調製する。
- pre-chill回収チューブ（15 mLチューブ）に、5 mLの回収培地でtアイスバケットの裾。チューブ表面に細胞が付着しないように、ポリプロピレンチューブのみを使用してください。
- 40 mmの皿、70μmのナイロンストレーナ、シリンジ、セルストレーナー用の乳棒、およびバイオセーフティキャビネット内の滅菌ポリプロピレンチューブを置きます。手順の前にすべての項目を滅菌し、手順全体を通して無菌状態で維持する。
注：網膜の収集後のすべての手順は、バイオセーフティキャビネットで行われます。
2.核融合
注：表現型CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 negと1.0×10 6個の RGCを単離するために、合計10匹の若い（5-7週齢）C57BL / 6Jマウスをこの実験に使用した。
- CO 2吸入を使用してマウスを安楽死させ、続いて頚部脱臼を行う。安楽死させた動物が死んでいることを確認するためには、必ず二次安楽死法を使用してください。
- 眼球の下に鉗子を挿入し、視神経をつかみ、引き上げます。眼球が完全な状態で地球が核から除核されます。 PBSを含むバイアルに採取した目を置き、次のステップまでバイアルを氷上に保つ。
注：どの人員も、実験動物管理ユニット（LACU）から適切な訓練を受けた後、このステップを実行することができます。
3.網膜細胞懸濁液の調製
- 収集した目を解剖顕微鏡のベースプレート上に置き、角膜切開を開始する。それぞれの目を個別に解剖する。
- 鉗子を使用して、視神経基部に注意深くグローブを保持する。この手順では、1つのlonを使用しますg、および1つの短い標準的な鉗子。
- 30ゲージ（30G）の鋭い針を使用して角膜を穿刺し、房水を目から排出させ、鉗子で眼を保持しやすくします。
- 鉗子で角膜を保持し、はさみを使用して角膜に小さな切開を作る。鉗子を使って角膜と強膜を静かにはがす。グローブを途中で剥がしたら、鉗子を使って網膜とレンズを外に出す。角膜、強膜、およびレンズを捨てる。
注：この方法は、網膜が眼の残りの部分から完全に離脱することを保証する。 - PBS / 1％FBSを含む小さな40mmペトリ皿に網膜を置く。
注：ペトリ皿の代わりに、細胞培養皿を使用することができます。生理学的条件と同様に、常に網膜を湿らせた状態に保つようにしてください。- バイオセーフティキャビネット内の新しい滅菌PBS / 1％FBSで各網膜を3回洗浄する。
- 最大12の網膜を置くPBS / 1％FBSで湿らせた滅菌70μmナイロン濾過器。 10 mLシリンジのバックエンドを使用して、円形の動きを使用して網膜を静かに浸軟させて細胞を剥離させます。
- または、細胞ストレーナー浸出に乳棒を使用するか、または15 IU / mLパパイン、5 mM L-システイン、および200 U / mL DNase Iの組み合わせを用いて酵素消化を37℃で15分間行い、続いてPBSで不活性化する/ 10％FBS。
注：酵素消化を、シリンジの後端または乳棒のいずれかを用いた浸軟と比較した場合、回収された細胞のパーセンテージの変化は観察されなかった。
- または、細胞ストレーナー浸出に乳棒を使用するか、または15 IU / mLパパイン、5 mM L-システイン、および200 U / mL DNase Iの組み合わせを用いて酵素消化を37℃で15分間行い、続いてPBSで不活性化する/ 10％FBS。
- 単離された細胞を移すために、滅菌70μmナイロンストレーナーをポリプロピレン収集チューブの上に置きます。収集した細胞をP1000ピペットを用いてストレーナーに通す。 PBS / 1％FBSでストレーナー（ ステップ3.6 ）をすすぎ、残りの細胞を解放し、収集チューブに移す。
- achにPBS / 1％FBSを加えるすなわち網膜あたり1mLの最終容量を有する。細胞懸濁液を200 xgおよび室温で7分間遠心分離する。
注：浸軟された網膜の数（<6網膜）によっては、細胞ペレットが小さすぎて目に見えないことがあります。- 細胞上清を捨て、細胞ペレットをPBS / 1％FBSに再懸濁させ、5網膜あたり1mLの比を使用する。
- 血球計数器を用いて細胞を数える。
- ガラスヘモサイトメーターと70％アルコールでカバースリップをきれいにします。細胞が入っているチューブを静かに旋回させ、網膜細胞懸濁液が均一に分布するようにします。 0.4％トリパンブルー20μLをマイクロ遠心チューブに入れ、細胞懸濁液20μLと混合する。
- 静かに混合し、0.4％トリパンブルー/細胞懸濁液10μLを血球計算盤に適用し、両方のチャンバーを満たす。毛細管作用により、カバースリップの下に0.4％トリパンブルー/細胞懸濁液混合物が得られる。顕微鏡を用いて、全てのトリパンブルー陰性細胞を計数する。ティsの数字は生きている細胞を表します。
- 以下の式を用いて細胞生存率を決定する：生細胞数/総細胞数=生存率。
注：細胞の生存率が95％未満である場合、FACSの間に細胞生存率の差別化のための蛍光色素の使用が必要である。
- 生きた細胞に浸透しない蛍光生存性色素を使用する。血清の痕跡を除去するためにPBSで細胞を洗浄する。最終体積100μL中、5.0×10 6個の細胞当たりの細胞生存率の識別のための1μLの蛍光色素を加える。光から保護し、RTで15分間インキュベートする。 10倍量のPBS / 1％FBSを加える。 200×gおよび室温で5分間遠心分離する。
- 必要に応じて、細胞懸濁液を4℃で一晩インキュベートする。これが完了した場合は、PBS / 1％FBSではなく神経細胞培地で細胞懸濁チューブを満たしてください。チューブを水平に置き、4℃に保ちます。
4.Reを免疫標識する樹状細胞
- 以下の変換を使用して、細胞数あたりの抗体量を決定する：100μL容量の5.0×10 6細胞あたり2μLの抗体。
- 細胞を洗浄し、PBS / 1％FBS中でそれらを維持する。ソートのセットアップ時に陰性対照（非標識）として使用するために、細胞の小さなアリコート（5.0×10 6細胞）を取る。
注：このネガティブコントロールは、セルソーターの適切な較正にとって重要です。 - Fcγ受容体IIおよびIIIを発現する細胞への抗体の非特異的結合を最小にするために、PBS / 1％BSAを用いて50μLの最終容量に1.0×10 6個の細胞あたり1μLの抗マウスCD16 / FBS。 RTで10分間インキュベートする。
- サンプルに抗体カクテルを加え、ピペッティングで穏やかに混合します。アイスバケットで30分間インキュベートする。アイスバケツが覆われていることを確認してください。タグ付きフルオロの光退色により、光が実験を危険にさらす可能性がありますphores。
- 以下の蛍光標識抗マウス抗体：CD90.2 AF-700、CD48 PE-シアニン7、CD15 PE、および非タグ化CD57を用いて抗体カクテルを調製する。
注：各抗体について、5.0×10 6個の細胞につき以下の濃度を使用する：CD90.2AF700,1μg; CD48 PE-シアニン7,0.4μg; CD15 PE、0.02μg;および標識されていないCD57,0.4μg。- 次の計算（ 表の材料に列挙されている市販の抗体に基づく）に従って、容量を使用する：合計5.0×10 7個の細胞を標識する; 5.0×10 6細胞あたり2μL=各抗体20μL; 4種類の抗体=80μLの抗体カクテル;最終体積= [（5.0×10 7個の全細胞）/5.0×10 6細胞]×100 =1,000μL; 80μLのAbs +50μLの抗マウスCD16 / 32 +870μLPBS / 1％FBS =1,000μL。
注：この組み合わせにより、機器構成のための蛍光色素の最適な組み合わせ。 AF-700、638nm赤色ダイオードレーザーで励起したときの719nmの発光、 PE-Cyanine7、488nmの青色ダイオードレーザーで励起した場合の767nmの発光、 488nmの青色ダイオードレーザで励起したときの575nmの発光を示す。
- 次の計算（ 表の材料に列挙されている市販の抗体に基づく）に従って、容量を使用する：合計5.0×10 7個の細胞を標識する; 5.0×10 6細胞あたり2μL=各抗体20μL; 4種類の抗体=80μLの抗体カクテル;最終体積= [（5.0×10 7個の全細胞）/5.0×10 6細胞]×100 =1,000μL; 80μLのAbs +50μLの抗マウスCD16 / 32 +870μLPBS / 1％FBS =1,000μL。
- 以下の蛍光標識抗マウス抗体：CD90.2 AF-700、CD48 PE-シアニン7、CD15 PE、および非タグ化CD57を用いて抗体カクテルを調製する。
- 30分のインキュベーション後、PBS / 1％FBSを使用して容量を最大5 mLにする。試料を200 xgおよび室温で7分間遠心分離することによって洗浄する。この手順を1回繰り返して、結合していない抗体をすべて除去する。
- 二次抗体（0.1μg）2μLを加え、5.0×10 6細胞のCD57に結合する。 ステップ4.4のように氷バケツで30分間インキュベートする。 ステップ4.5のように細胞を2回洗浄する。
- 標識されていない一次抗体が工程4.4で使用された場合、細胞を二次抗体で標識する。
注： 2番目のこの構成のために選択された抗体は、 表の表に記載されている。発光波長は421nmである。 405nmのバイオレットダイオードレーザーで励起すると、450 / 50nmのバンドパスフィルターで使用してください。 - 次の計算（ 表の材料に記載されている市販の抗体に基づく）に従った容量を使用します：5.0 x 10 6細胞あたり2μL= 2次抗体20μL;最終体積= [（5.0×10 7個の全細胞）/5.0×10 6細胞]×50 =500μL; 20μLのAb +480μLPBS / 1％FBS =500μL。
- 標識されていない一次抗体が工程4.4で使用された場合、細胞を二次抗体で標識する。
- 標識された細胞をPBS / 1％FBSに保つ。血球計数器を用いて細胞を計数する; 3.0〜4.0×10 7細胞/ mLの最終網膜細胞濃度を使用する。
注：フェノールレッドは自己蛍光を増加させることができるので、細胞培養培地を細胞の希釈に使用しないでください。これによりネガットiveおよび陽性細胞。容量当たりの最終的な細胞濃度は、機器構成の体積流量に大きく依存する。 - 蛍光スピルオーバーを最小限に抑えるために、セットアップ中に単色のコントロールを使用してください。
注：このステップは、補正とも呼ばれ、フルオロフォアの組み合わせによって生成されるノイズを補正するために適用されます。複数の種からの蛍光標識された免疫グロブリン（Ig）アイソタイプに結合する能力を有するPBS / 0.1％BSA / 2mM NaN 3中のポリスチレンミクロスフェアは、補償を設定する陽性対照を提供する。- 3滴のポリスチレンミクロスフェアを滅菌FACSチューブに入れ、1つの蛍光体あたり1つを割り当てます。 1μgのそれぞれのフルオロフォアを各チューブに加える。光から保護し、室温で15分間インキュベートする。サンプルチューブに3 mLのPBS / 1％FBSを加えます。 200×gおよび室温で5分間遠心分離する。慎重に上清を除去し、250μLのPBS / 1％FBS中に再懸濁する。
- 負の値を設定するにはIgに結合しないポリスチレンミクロスフェアを使用する。必要に応じて前日にこの手順を実行します。
5.セルソート戦略
注：355 nm、FACSの機器設定の具体的な手順; 405nm、バイオレット; 488nm、青色; 2つ、2つ、5つ、および3つの蛍光チャネル分布を有する赤色レーザ、および640nmの赤色レーザである。オペレーティングソフトウェアはDIVAバージョン8.0.1でした。 70μmのノズル、70psiのシース圧力、87.5度の周波数、48.6の振幅、333の最初の落下分裂、6のギャップアスセッティング、デフォルト（32）の純度のマスクを用いた4方向純度に設定されたソート精度、ビーズを用いて遅延を42.98に調整した。
- 15 mLポリプロピレンコニカルチューブを採取容器として使用する。収集培地（細胞培養培地）5 mLを各チューブに加え、チューブを回転させて壁をコートする。
注：この手順は、細胞がtの両側にくっつかないようにします彼はコレクションチューブ。代わりに、チューブを原液FBSでコーティングすることができます。 - 細胞の最終収量を推定するための細胞選別装置の効率を考慮する。
注：並べ替えの効率は、使用されるフローサイトメーターに応じて異なります。 CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg表現型を有するRGCは、全ての網膜細胞の約1％を構成する。 - 訓練を受けたオペレーター（通常は中核施設内）がセルソーティングを実行してください。サンプルを採取する前に、装置を洗浄し、70％エタノールで滅菌してください。注意深く、70％エタノールでもコレクションチューブの外側を拭きます。
- 細胞が沈降または凝集している場合は、細胞をピペットで上下に振り、取得する前に滅菌40μmナイロンストレーナーで懸濁液をろ過する。細胞のソーティングが行われている間は、温度を制御して4℃に保つようにしてください。そうしなければ、セルを減らすことができますl収率。
- 実験を行う前に、細胞選別作業員でこの種の細部について話し合う。
注：実験の時点で、細胞選別オペレーターは、サイトメーターの獲得ソフトウェアのワークスペースツールバーから一連のボタンをクリックします。これらは、 ブラウザ 、 サイトメーター 、 インスペクタ 、 ワークシート 、および獲得ダッシュボードです。ここで使用されているセルソートの戦略は、2ウェイソートとして知られています。豊富なRGCおよび他のすべての細胞型の2つの集団が収集される。追加の集団を集める場合、最大2つの集団を4方向ソートとして分離することができます。追加の集団が収集される場合、細胞選別器は異なる収集チューブおよびセットアップを必要とする。 - フルオロフォアからのスペクトルオーバーラップを補正するための補正を行います。
注：このプロセスは、手動で調整することができます各設定を使用するか、使用中のソフトウェアの一部として自動的に実行することができます。細胞選別装置のためのほとんどのソフトウェアは、自動補償の選択肢を有する。それは金の基準と最も正確な補償の種類と考えられています。実験で使用したすべての関連するモノクローナル抗体に結合するように特異的に製造された負の（蛍光体なし）試料およびポリスチレン微小球（補償ビーズ）で調製した単一の対照をこの工程で使用する。- [ テスト]> [補償設定]> [補償コントロールの作成]を選択します 。画面に表示されたリストからフルオロフォア固有のコントロールを追加します。 [ OK]をクリックします。
注：各コントロールの補正チューブが表示されます。- 前方散乱光（FSC）、側方散乱光（SSC）を検証し、最初の集団（P1）をゲートするために、非標識対照（フルオロフォアなし、 ステップ4.2 ）を使用する。
- サイトメーター上にネガティブコントロールチューブを取り付け、ロードをクリックします。関心のある人口が表示されていることを確認し、それを選択します。これは母集団1（P1）です。 P1ゲートを右クリックし、 すべての補償コントロールに適用を選択します。 レコードデータをクリックします 。録音が完了したら、 Unloadをクリックしてチューブを取り外します。
- 画面に表示されているように、次のチューブをサイトメーターに取り付けます。コントロールからのすべてのデータが記録されるまで、 手順5.6.2を繰り返します。
- [ 実験]> [補償設定]> [補償計算]を選択します 。設定を保存し、実験の名前を付けます。 [ リンクと保存]をクリックします 。
注：補償は、検出器間のスペクトルの重複を除去するため、必要なステップです。 - 手作業による補償が必要な場合は、正の信号の平均値をeacのネガと等しくなるように調整してくださいhであった。
注：この手順はセルソーター操作で行い、30分かかります。
- [ テスト]> [補償設定]> [補償コントロールの作成]を選択します 。画面に表示されたリストからフルオロフォア固有のコントロールを追加します。 [ OK]をクリックします。
- ゲーティング戦略（ 図3A ）。
- FSC対SSCをプロットしてP1を設定する。 FSCはサイズを示し、SSCは細胞の内部複雑度を示す。 図3Aを参照のこと。
- ステップ5.7.1 （P1）で選択された集団を使用して、SSC-H（高さ）対SSC-W（幅）の疑似カラープロットを描きます。疑似カラープロットは、互いに対する細胞の密度の視覚的表現を可能にする。
注：低い細胞密度は青色と緑色で表され、赤色とオレンジ色の領域は高い細胞密度を表します。- 単一のセルのみを収集するには、この手順を実行します。単一セルゲートはP2と呼ばれる。 図3Aを参照のこと。
- 手順5.7.2を繰り返してP2を用いてFSC-H対FSC-Wをプロットする。 「ダブレット」または細胞塊としての単一細胞の選択に、陽性と陰性の両方のマーカーが含まれていることを確認し、偽陽性を確認する。
- CD90.2対CD48の疑似カラープロットを描く。 RGC濃縮から単球を除去するために、全てのCD90.2 + CD48陰性細胞を選択する;このゲートをCD90.2 + CD48 negまたはP3と呼ぶ。 図3Aを参照のこと。
- 選択されたCD90.2 + CD48陰性母集団またはP3ゲートを使用して、CD57対CD15の疑似カラープロットを描き、RGC濃縮からのアマクリン細胞汚染物質を排除する。 CD15陰性CD57ネガティブ集団をゲートする。 図3Aを参照のこと。
- 「ソート・レイアウト」ウィンドウでサンプル用に収集する集団を定義し、セルのソートを続行します。収集するサンプルはCD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg p>。
注意：ソートする集団は、ソートウィンドウのドロップダウンの[ 追加 ]メニューから選択します。母集団を追加した後、目標イベントまたは収集するイベントの数を尋ねます。母集団を含むSort Locationフィールドをクリックすると、いつでもソートレイアウトを編集できます。表現型CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 negを有するRGCの0.9％±0.3は、若年（5-7週齢）および0.5％±0.3および齢（> 12ヶ月齢）のC57BL / 6Jマウスから得られる23 。 - 25,000個のセルを使用して、純度チェック23を実行します。 図3B- Eを参照のこと。
注：純度チェックは、ソーティングされたセルを再分析してセルソートの精度を検証するプロセスです。ソートされた細胞の少量のアリコートが、ソートの有効性を検証するためにサイトメーターにロードされます。
- 細胞内標識。
- ソートした細胞を1時間固定し、細胞を代謝的に不活性にし、細胞内抗体の浸透を可能にするために4℃で透過性にする。
- 浸透化溶液中の以下の抗体を希釈する：100μg/ mLのストック中の1：100希釈での多重スプライシング（RBPMS）を伴う抗RNA結合タンパク質;抗シヌクレインガンマ（SNCG）、1mg / mLのストック中の1：100;脳特異的ホメオボックス/ POUドメインタンパク質3A（BRN3A）、200μg/ mLのストック中の1：100;および1mg / mLのストック中の抗ニューロン特異的クラスIIIベータチューブリン（TUJ1）（1：100）である。カバーされた氷のバケツで1時間細胞と抗体溶液をインキュベートする。
- PBS / 1％FBSで2回サンプルを洗浄する。
- 適切なAF488標識二次抗体中の細胞を、1：200希釈で30分間、アイスバケットで再懸濁する。
- ステップ6.1.3のようにサンプルを洗浄する。細胞をPBS / 1％FBS（250μL）で分析する。
7. qPCR解析によるセルソートの検証
注： 図4を参照してください。
- RNA抽出23 。
- 細胞溶解およびホモジナイゼーションに続いてクロロホルムを添加することによって5.0×10 5の選別された細胞からRNAを抽出する。
- 上の無色相をアルコール沈殿のために清潔なマイクロチューブに移し、続いてスピンカラムで濃縮物を抽出する。カラムでDNAse消化を行います。
- RNaseを含まない水でカラムを洗浄してRNAを溶出させます。
- 分光光度法によりRNA濃度を評価する。
- cDNA合成および前増幅。
- 100ngのRNA材料を使用し、逆転写酵素、組換えリボヌクレアーゼ阻害剤（RNA分解を避けるため）、塩化マグネシウム（MgCl 2 ）、およびデオキシヌクレオチド。
- チューブの内容物を混合し、25℃で10分間インキュベートした後、42℃で60分間インキュベートする。 85℃で5分間インキュベートして反応を終了させる。得られたcDNAを使用するまで-20℃で保存する。
注： cDNA材料は、前増幅ステップを直ちに実施できない場合、-20℃で最大1ヶ月間保存することができます。
- cDNAの前増幅。
- 参考文献23および表2に記載されているように、網膜神経節細胞、アマクリン細胞、星状細胞、Muller、双極細胞、水平細胞、光受容体および網膜色素上皮細胞を含む複数の網膜細胞型に特異的な一連のプライマーを用いてcDNA材料を前増幅する。 材料の
注：前増幅反応は、定量のための検出感度を上げるために準備されています。前増幅反応は、プライマー材料の表からミックス。 100ngのRNAで開始した2.5μLのcDNA;逆転写酵素;およびヌクレアーゼを含まない水を最終容量10μLで添加した。 - 95℃で10分間、次に95℃で15秒間、続いて60℃で4分間、14サイクルの酵素活性化工程を実施する。予備増幅された物質をTris EDTAバッファーで1:10に希釈し、使用の準備ができるまで-20℃に保ちます。
- 参考文献23および表2に記載されているように、網膜神経節細胞、アマクリン細胞、星状細胞、Muller、双極細胞、水平細胞、光受容体および網膜色素上皮細胞を含む複数の網膜細胞型に特異的な一連のプライマーを用いてcDNA材料を前増幅する。 材料の
- 7.4qPCR反応。
- 希釈した前増幅cDNA（2.5μL）、プライマー（ 表の表に記載）、ヌクレアーゼフリー水、およびDNAポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチドを含む濃縮液を使用して、10μLの最終容量ですべてのqPCR反応を調製します。
- qPCRを実行するには、次の機器条件を使用します：50℃で2分間保持し、次に95℃で10分間保持するステップ。 95℃で15秒間、続いて60℃で1分間の計40サイクルを行う。すべてのmeasurを実行するementsは3つの複製である。
- ハウスキーピング遺伝子のC T値および各サンプルの標的遺伝子の値を決定した後、比較閾値（C T ）を用いて相対的定量を行う。 R q = 2 T - ΔC（ 式中 、 ΔCT = C T標的遺伝子-C T参照遺伝子23 ）を用いて、相対倍率変化（R q ）を計算する。
注： C Tは、レポーター色素の蛍光シグナルが任意に配置された閾値26を横切るPCRサイクルとして定義される。 C Tは、反応中のアンプリコン（PCR産物）の量に反比例する。
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Representative Results
RGCの徹底的な研究は、頻度が低く、分離のための堅牢で標準化された方法論の欠如を含む多くの要因によって妨げられています。 図1は、網膜の隔離のために使用される方法論を示す。除核処置のバリエーションは、除核が生体内実験の一部である場合など、分析のタイプに基づいて存在する（ 27） 。安楽死させたマウスでこのプロトコールにおける核除去を行う。 図1A〜図1Bに示すように、鉗子を眼の下に置き、引っ張って出血を最小限に抑え、完全な視神経を有する眼球を除去する。
異なるマウス系統、特に遺伝子改変マウスにおけるRGCの数に差異が存在する23,28,29 、これらの違いを認識することは、使用するマウスの数を決定する上で重要である。古いC57BL / 6Jマウスの網膜細胞は、若いマウスよりも網膜細胞の生存率が低いため、網膜の切開を注意深く行う必要がある網膜の解剖のための段階的手順が図1C- Jに示されている。網膜細胞は脆弱であるため、解剖された網膜をナイロンストレーナーに入れ、シリンジの後端細胞懸濁液の代表的な画像を図2Bに示し、複数の内側網膜細胞を視覚化することができる。この時点で、RGCは署名のモルフォロ細胞分離中の軸索切開および細胞懸濁液の調製のためにgyである。
この方法論の最も労働集約的なステップは、細胞選別設定である。このフェーズは、信号対雑音の分解能を最大にするため、多色FACSの重要なステップです。 図3Aは、RGCの単離に用いられるゲーティング戦略を示す。この戦略は、単球、グリア細胞、アマクリン細胞、および光受容体細胞を含む細胞懸濁液からの汚染細胞の除去を標的とした。方法論の一部として、追加の表面マーカーが、除外戦略の一部として使用される前に、免疫組織化学分析によって確認された。以前のデータは、CD90.2 +細胞のわずかな割合がCD48 +であることを実証した。これらの細胞の除外により、単球および場合によっては網膜細胞プールからの小膠細胞が除去された。これまでに、古典的Thy1 + CD48陰性図4A ）。これは、細胞排除のためのさらなるマーカーを調べることによってさらに対処される。 CD15は、アマクリンおよび双極細胞のマーカーとして記載されており、ネガティブ選択のための追加のマーカーとしてその使用を促している31 。 Uusitalo らによる研究32は、グリア細胞および光受容体の同定マーカーとしてCD57を記載している。したがって、この抗体は細胞選別戦略に加えられた。
次に、これらの細胞を、マウスRGCの単離のための方法論を立証するために特徴付けた。 CD90.2 + CD48ネガティブCD15ネガティブCD57ネガティブソーティング細胞の表現型（<SNCG、BRN3A、TUJ1およびRBPMSのRGCs 10,11,12,33に関連する以下の細胞内マーカーの発現について評価した。 図3Cに示すように、選別された細胞は、4つのRGC関連細胞内タンパク質をすべて発現した。次に、RBPMSの細胞内局在およびCD90.2の細胞表面発現を示すために、 図3Dにおいてイメージングフローサイトメトリーを使用した。これらの結果を、複数のサイトメーターシステムで試験し、再現性および標準化を確認した。 図3Eに示すように、選別された細胞のいくつかは、 インビトロ細胞培養後に RGCに関連する形態を示し始めた。
最後に、濃縮前および後期の細胞の比較II分析をqPCR分析によって行った。 Thy1 + CD48 neg表現型とCD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg選別細胞との比較は、Thy1 + CD48 neg表現型がRGCに関連する遺伝子を発現するが、他の網膜細胞も発現することを明らかにした。しかし、RGC特異的細胞内マーカーSncg （SNCG）、 Pouf4I （BRN3A）、 Tubb3 （TUJ1）、およびRbpms （RBPMS）をコードする遺伝子の高度に富化された選別細胞集団（ 図4B ）は、まとめると、mRNAおよびタンパク質の評価は方法論を立証した。
図1 。網膜分離のための核摘出および眼球解離。若いC57BL / 6Jマウスをt時間前に安楽死させたo CO 2および頚部脱臼を伴う眼球の除去。 A）鉗子を目の下に置き、一回の動きで目を引き上げます。 B）視神経を含む目が除去される。 CJ）網膜を取り除くためのステップバイステップのガイド。 C）角膜除去の前に30G針を用いて穿刺を行い、房水が眼から出るようにする。 D）小さな切開を作るために角膜を鉗子で保持する。 EF）鉗子の使用は、角膜、網膜色素上皮、脈絡膜および強膜を剥がすことを可能にする。網膜は強膜から分離され、圧延され、除去される。 G）レンズを取り出して廃棄する。 HJ）収集した網膜をPBS / 1％FBSを含む小さな皿に入れ、常に湿らせておく。 このより大きなバージョンを見るにはここをクリックしてください数字。
図2 収集された網膜の浸潤後の網膜細胞懸濁液。収集した網膜を小さな皿に入れて細胞を単離する。 A）網膜を70μmナイロンストレーナーに入れ、シリンジのバックエンドを用いて浸軟させる。 B）異なる網膜細胞が観察される細胞懸濁液の代表的な画像。スケールバーは10μmです。
図3 CD90.2 + CD48陰性 CD15 陰性CD57を用いた細胞の単離のための選別戦略
図4 mRNA分析前および後のソーティング。表現型CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 negを有するThy1 + CD48 negおよび選別細胞を、網膜細胞によって発現される25の遺伝子のパネルを用いてqPCR分析によって評価した。標的遺伝子発現レベルはハウスキーピング遺伝子としてHprtを用い、ネガティブコントロールとして水を用いたLog 2倍変化として示す。計算はΔCT法に基づいて行った。平均±SEM; n = 3の生物学的複製を三重に行った。許可を得て以前に公表された作業から得られた数字23 。
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Discussion
FACSは、細胞集団を精製するために選択される技術である。他の単離方法には、免疫パンニング、磁気ビーズ、および補体固定枯渇が含まれる。これらの他の方法に対するFACSの利点は、様々な程度の強度を有する細胞表面マーカーの同時同定に基づく。分子の蛍光強度はタンパク質発現量に比例する。今まで、RGCの単離は、使用した単離方法にかかわらず、 Thy1（CD90）陽性およびCD48陰性15,16,22,34にのみ基づいていた。 Thy1 + CD48 neg表現型は、RGC細胞内マーカーを発現する細胞の均質な集団を単離するのに十分ではないことが最近示されている23 。 RGC集団の同定は、それらの単離に必須であり、具体的には、彼らは網膜細胞7,8,9の小さなパーセンテージを構成しているからです。大部分のRGCは網膜の最内層に位置し、少数は内網状層に位置する（置換されたRGC 35 ）。したがって、定位注射およびヒドロキシスチルバミジン（ニューロンを概説するための逆行性トレーサー）による追跡による上丘からのRGCの追跡は、多くの研究室にとって魅力的な選択肢となった36,37,38 。これらのシステムはトレーサの注入を必要とし、適切に実施されないと、網膜領域がトレースされずに残ることがある。さらに、それらは技術的に要求が厳しく、イムノパンニングのような他の方法と同様に、時間がかかる。抗Thy1および-CD48抗体を用いたイムノパニングは48時間で完了し、95を超えない純度％。この研究は、トレーサー、磁気ビーズ、または免疫パンニング技術を使用せずに、CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg表現型を有する生存RGCの均質な集団を単離するための迅速かつ再現性のあるプロトコールを提供するFACSベースの方法を記載する。
FACSによる純粋なRGCの単離が成功するためには、以下の要素が必要です。1）ソート効率。使用する機器に大きく依存します。 2）ノイズを最小限にするために、抗体タグ付き蛍光色素の最適な組み合わせ; 3）細胞ソーティングのセットアップ。ソート効率は、ソートのために選択されたターゲットイベントの数を、検出されたターゲットイベントの数で割ったものをパーセンテージで表すことによって計算されます。ソート効率は、装置によって提供される計算である。この効率は、選別システムの設定および細胞選別モードに依存する。蛍光色素の最適な組み合わせを選択することは複雑なプロセスである。各インフルエンザオルクロムは、異なる特性を有し、その励起波長および発光波長によって特徴付けられる。励起がレーザーで読み取られている間、FACS選別装置で利用可能な光学フィルターによって制限される光電子増倍管によって発光が読み取られる。ここでは、抗体標識された蛍光色素PE、PE-シアニン7、AF700、およびBV421の組み合わせが提供される。これは、スペクトルの重なりを低減しながら最高の解像度を提供する複数の蛍光色素の組み合わせを考慮した後に決定された。最後に、並べ替え設定が重要です。一般に、網膜細胞は脆弱である。したがって、細胞へのストレスを最小限に抑えるために、試料を流すために、より低い圧力を使用することが最良である。 4℃でサンプルを維持することは非常に重要です。なぜなら、室温で長時間マウスRGCを保つと、特に多数の細胞を選別する際に細胞収量が減少するからです。
FACSベースのソーティングは、avを構成する細胞の単離のための理想的な方法論です細胞懸濁液の少量の割合である。網膜解剖から細胞選別の完了までのプロセスは、完了まで数日かかるイムノパニングおよびトレーサーシステムと比較して、約5-6時間かかる。 FACSの多次元分析およびいくつかの生存個体群を収集するための装置の能力は、細胞のさらなる機能解析を可能にする。ここに記載されたプロトコルは、一次ネズミRGCの単離のための強力なツールである。感度、再現性、および生存細胞の即時同定を含む複数の利点にもかかわらず、いくつかの制限がある。まず、高価な計装と高度に訓練されたオペレータが必要です。通常、オペレータは免疫学者またはフィールド内の高度に訓練された個人であり、実験のセットアップ時に会う必要がある。現在、学術施設には複数の中核施設があり、これらのタイプの実験を容易に行うことができます。第二に、RGCは、アトモミーが原因で体格が非常に小さくなります。現時点では、アトモミーに起因して遺伝子のいくつかが調節されるかどうかは知られていない。
ここに示された方法論は、 インビトロでのRGC機能の下流分析を可能にし、視覚および健康科学の分野で使用される貴重なツールである。脳への神経節細胞出力を維持することは、視覚的知覚のために必要であり、複数の疾患において危険にさらされている。これらの細胞は、健常モデルおよび疾患モデルの両方において 、制御されたin vitro実験に使用することができる。電気生理学的、薬理学的、生化学的および分子生物学的研究をこれらの細胞に対して行うことができ、将来の治療標的の開発に理想的である。
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Disclosures
著者らは競合する金銭的利益がないと宣言している。
Acknowledgments
著者はテクニカルビデオアシスタンスのための免疫学および生化学の微生物学部門のシニアイラストレーター、ティムヒギンズ氏に感謝したい。 Matthew W. Wilson博士とJablonskiとMorales-Tiradoラボのメンバーの皆さんにお話を伺いました。この研究は、アルコン研究所の若手研究者賞（VMM-T）、テネシー大学研究財団（VMM-T）、国立眼科研究所EY021200（MMJ）、ゲーウィンフェローシップ（VMM-T） Gerwin Pre-doctoral Fellowship（ZKG）、国防総省陸軍医学研究院（VMM-T）、および無防備失調症研究のための無制限助成金などが含まれます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse CD15 PE | BioLegend | 125606 | Clone MC-480 |
| Anti-mouse CD48 PE-Cy7 | BioLegend | 103424 | Clone HM48-1 |
| Anti-mouse CD57 | Sigma Aldrich | C6680-100TST | Clone VC1.1 |
| Anti-mouse CD90.2 AF700 | BioLegend | 105320 | Clone 30-H12 |
| Brilliant Violet 421 Goat Anti-mouse IgG | BioLegend | 405317 | Clone Poly4053 |
| Purified Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | FcgRII/III block, Clone 93 |
| Zombie Aqua | BioLegend | 423102 | Live cell/ Dead cell discrimination |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | U.S. origin |
| AbC Total Antibody Compensation Bead Kit | Thermo Fisher Scientific | A10497 | Multi-species Ig |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Add serum to media prior to culture. |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | Saline solution |
| Dissection Microscope | Olympus | SZ-PT Model | Stereo Microscope |
| Sorvall Centrifuge | Thermo Scientific | ST 16R | All centrifugation performed at RT |
| Base Plate – Dissection Pan | Fisher Scientific | SB15233FIM | A wax plate can also be used |
| Forceps | Aesculap | 5002-7 | 4 ½ inches |
| Iris Scissors, Straight | Aesculap | 1360 | 5 ½ inches |
| Falcon 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 352097 | Polypropylene tubes |
| Falcon 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 352098 | Polypropylene tubes |
| BD FACS Tubes | Fisher Scientific | 352003 | Polypropylene tubes |
| 40 mm dishes | MidSci | TP93040 | Tissue culture treated |
| 70 μm nylon strainer | MidSci | 70ICS | sterile |
| 40 μm nylon strainer | MidSci | 40ICS | sterile |
| BD 10 mL syringe | Fisher Scientific | 301604 | Disposable Syringe without needle |
| Pestles | MidSci | PEST | sterile |
| Wheaton Vials | Fisher Scientific | 986734 | No Liner |
| BD 30 G needle | Fisher Scientific | 305128 | 1 inch |
| Hausser Scientific Bright-Line Glass Counting Chamber | Fisher Scientific | 0267151B | Hemocytometer |
| Gibco Trypan blue 0.4% Solution | Fisher Scientific | 15250061 | Viability Dye |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | 1.5mL |
| EVOS Floid Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | 447113 | Fluorescence Imaging with a 20X objective |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-452 | Used to make 70% Ethanol |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | Rainin | 17014282 | LTS Pipette |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | Rainin | 17014391 | LTS Pipette |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | Rainin | 17014392 | LTS Pipette |
| Rack LTS 1000 mL – GPS-L1000S | Rainin | 17005088 | Blue Rack Sterile Tips |
| Rack LTS 250 mL – GPS-L250S | Rainin | 17005092 | Green Rack Sterile Tips |
| Rack LTS 20 mL – GPS-L10S | Rainin | 17005090 | Red Rack Sterile Tips |
| FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | N/A | Custom order |
| LSR II Cytometer | BD Biosciences | N/A | Custom order |
| Abca8a | Thermo Fisher Scientific | Mm00462440_m1 | Müller cells |
| Aldh1al | Thermo Fisher Scientific | Mm00657317_m1 | Müller cells |
| Aqp4 | Thermo Fisher Scientific | Mm00802131_m1 | Astrocytes |
| Calb2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00801461_m1 | Amacrine, Horizontal |
| Cd68 | Thermo Fisher Scientific | Mm03047340_m1 | Retinal Pigment Epithelial Cells |
| Gad2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00484623_m1 | Amacrine |
| Hprt | Thermo Fisher Scientific | Mm01545399_m1 | House keeping gene |
| Lhx1 | Thermo Fisher Scientific | Mm01297482_m1 | Horizontal |
| Lim2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00624623_m1 | Horizontal |
| Nrl | Thermo Fisher Scientific | Mm00476550_m1 | Photoreceptors |
| Ntrk1 | Thermo Fisher Scientific | Mm01219406_m1 | Horizontal |
| Pcp4 | Thermo Fisher Scientific | Mm00500973_m1 | Bipolar, Amacrine |
| Pou4f1 | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Prdx6 | Thermo Fisher Scientific | Mm00725435_s1 | Astrocytes |
| Prkca | Thermo Fisher Scientific | Mm00440858_m1 | Bipolar |
| Prox1 | Thermo Fisher Scientific | Mm00435969_m1 | Horizontal |
| Pvalb | Thermo Fisher Scientific | Mm00443100_m1 | Amacrine |
| Rbpms | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Rom1 | Thermo Fisher Scientific | Mm00436364_g1 | Photoreceptors |
| Rpe65 | Thermo Fisher Scientific | Mm00504133_m1 | Retinal Pigment Epithelial cells |
| Slc1a3 | Thermo Fisher Scientific | Mm00600697_m1 | Astrocytes |
| Slc6a9 | Thermo Fisher Scientific | Mm00433662_m1 | Amacrine |
| Sncg | Thermo Fisher Scientific | Mm00488345_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Tubb3 | Thermo Fisher Scientific | Mm00727586_s1 | Retinal Ganglion Cells |
| Vim | Thermo Fisher Scientific | Mm01333430_m1 | Müller cells |
| Taqman Universal Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4440047 | qPCR Reagent |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA Isolation |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | cDNA synthesis |
| Taqman PreAmp Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4391128 | Pre-Amplification step |
| BD Cytofix/ Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Fixation/ Permeabilization Buffer |
| BD Perm/ Wash | BD Biosciences | 554723 | Permeabilization Solution |
| RBPMS | Santa Cruz Biotechnology | sc-86815 | intracellular antibody |
| SNCG | Gene Tex | GTX110483 | intracellular antibody |
| BRN3A | Santa Cruz Biotechnology | sc-8429 | intracellular antibody |
| TUJ1 | BioLegend | 801202 | intracellular antibody |
References
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