Summary
Des millions de personnes souffrent de maladies dégénératives de la rétine qui entraînent une cécité irréversible. Un élément commun de nombreuses de ces maladies est la perte de cellules ganglionnaires de la rétine (RGC). Ce protocole détaillé décrit l'isolement des RGC murins primaires par sélection positive et négative avec cytométrie de flux.
Abstract
Les maladies neurodégénératives ont souvent un impact dévastateur sur les personnes touchées. La perte de cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) est impliquée dans une série de maladies, y compris la rétinopathie diabétique et le glaucome, en plus du vieillissement normal. Malgré leur importance, les RGC ont été extrêmement difficiles à étudier jusqu'à maintenant en raison en partie du fait qu'ils ne comprennent qu'un faible pourcentage de la grande variété de cellules de la rétine. En outre, les méthodes d'isolement actuelles utilisent des marqueurs intracellulaires pour identifier les RGC, qui produisent des cellules non viables. Ces techniques impliquent également de longs protocoles d'isolement, de sorte qu'il existe un manque de méthodes pratiques, normalisées et fiables pour obtenir et isoler les RGC. Ce travail décrit une méthode efficace, complète et fiable pour isoler les RGC primaires des rétines de souris en utilisant un protocole basé sur des critères de sélection positifs et négatifs. Les méthodes présentées permettent l'étude future des RGC, dans le but de mieux comprendre les grandsDéclin de l'acuité visuelle résultant de la perte de RGC fonctionnels dans les maladies neurodégénératives.
Introduction
Les RGC sont des neurones à différenciation terminale et, par conséquent, les cellules primaires sont nécessaires à l'expérimentation. Le développement d'un protocole pour l'isolement et l'enrichissement des cellules ganglionnaires rétiniennes murines primaires (RGC) est fondamental pour révéler les mécanismes de la santé et de la dégénérescence du RGC in vitro . Ceci est particulièrement important pour les études qui cherchent à générer des thérapies potentielles pour promouvoir la fonction RGC et pour minimiser leur décès. La dégénérescence des RGC est associée à des maladies dégénératives de la rétine, telles que le glaucome, la rétinopathie diabétique et le vieillissement normal. Bien que les mécanismes cellulaires spécifiques sous-jacents à la perte de RGC ne soient pas clairs, une série de facteurs de risque ont été identifiés. Le manque d'oxygénation à la tête du nerf optique 1 , 2 , 3 provoque la mort de RGC 4 et agit comme la perturbation de l'homéostasie entre l'activation de l'excitation et iRécepteurs nhibiteurs dans les RGC individuels 5 , 6 . Une série de défis empêchent les progrès vers l'utilisation de ces cellules pour des études approfondies. Tout d'abord, le nombre de RGC présents dans une rétine murine est faible. Les RGC représentent moins de 1% des cellules rétiniennes totales 7 , 8 , 9 . Deuxièmement, la plupart des marqueurs spécifiques de RGC sont des protéines intracellulaires 10 , 11 , 12 . La sélection basée sur ces marqueurs laisse les cellules non viables, ce qui empêche les analyses fonctionnelles en aval. Enfin, les protocoles actuellement disponibles sont longs et manquent de standardisation 13 , 14 . Les premiers protocoles d'isolement RGC étaient basés sur les méthodes d'immunopanning. Barres et al. 15 Adapté l'immunop classiqueEt a ajouté une deuxième étape, qui exclut les monocytes et les cellules endothéliales de l'essentiel des cellules rétiniennes avant une sélection positive basée sur l'immunopostivité à l'antigène anti-thymocyte (aka Thy1), un marqueur de surface cellulaire. Des années plus tard, Hong et al. Techniques combinées d'isolation des perles magnétiques avec des stratégies de tri cellulaire pour isoler les RGC avec une pureté supérieure 16 . L'utilisation de perles magnétiques est toujours utilisée dans de nombreuses applications scientifiques. Ensemble, les perles magnétiques et les protocoles de cytométrie de flux ont amélioré la pureté des cellules isolées. Cependant, ces systèmes de purification n'ont pas encore été normalisés pour l'isolement des RGC murins à partir de la rétine dissociée.
La cytométrie de flux est une méthode analytique puissante qui mesure les caractéristiques optiques et de fluorescence des suspensions cellulaires. Les cellules sont analysées quantitativement et qualitativement avec un niveau élevé de sensibilité, fournissant une analyse multidimensionnelle de la population cellulaireAtion. La discrimination cellulaire repose sur deux propriétés physiques principales: la taille de la cellule ou la surface et la granularité ou la complexité interne 17 . Une analyse multidimensionnelle peut être réalisée en combinant des anticorps marqués avec des fluorochromes ayant des longueurs d'onde d'excitation similaires et des émissions différentes. La cytométrie de flux est rapide, reproductible et sensible. Les lasers Multitpe permettent des analyses multidimensionnelles encore plus importantes de cellules simples par cytométrie de flux. Ainsi, c'est une méthodologie attrayante pour l'étude de spécimens cytologiques. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) utilise les différences phénotypiques multidimensionnelles identifiées par la cytométrie de flux pour trier les cellules individuelles en sous-populations distinctes.
Au cours de la dernière décennie, de multiples protéines superficielles et intracellulaires ont été identifiées comme biomarqueurs potentiels pour la sélection des cellules, y compris les neurones. Les études initiales visant à isoler les RGC des rats ont utilisé Thy1 comme un ganglion celL marqueur. Malheureusement, Thy1, aka CD90, a plusieurs isoformes dans d'autres espèces de rongeurs 18 , 19 , 20 et est exprimé par plusieurs types de cellules rétiniennes 19 , 20 , ce qui en fait un marqueur non spécifique pour les RGC. Un autre marqueur de surface, CD48, se trouve sur des populations monocytaires dans la rétine, y compris les macrophages et la microglie. En utilisant ces deux marqueurs de surface, une signature RGC modifiée - Thy1 + et CD48 cellules négatives - a été développée 15 , 16 , 21 , 22 . Malheureusement, ces deux critères de sélection ne suffisent pas à choisir pour une population RGC très enrichie. Pour répondre à ces besoins non satisfaits, un protocole de cytométrie de flux a été développé 23 en fonction de critères de sélection positifs et négatifs multicouches usiNg marqueurs de surface cellulaire connus pour enrichir et purifier les RGC murins primaires.
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Protocol
Toutes les procédures détaillées dans le protocole suivant ont été approuvées par le comité de révision institutionnel du Comité des soins et de l'utilisation des animaux (IACUC) au Centre de sciences de la santé de l'Université du Tennessee (UTHSC) et ont suivi l'Association pour la recherche en vision et ophtalmologie (ARVO) Déclarations pour l'utilisation Des animaux dans la recherche ophtalmique et de la vision, en plus des lignes directrices pour les expériences animales de laboratoire (Institut des ressources animales de laboratoire, Politique du service de santé publique sur les soins humains et l'utilisation des animaux de laboratoire).
1. Préparation des instruments, des solutions et des médias
Remarque: Toutes les informations sur les matériaux, les réactifs, les outils et les instruments signalés dans le protocole sont spécifiées dans la Table des matières .
- Autoclavez tous les instruments de dissection et rangez-les dans une zone stérile. Utilisez les instruments suivants: 4 pinces standard (2 longues et 2 courtes) et 2 ciseaux,Ainsi que 2 pinces (1 long et 1 court) et 1 ciseau pour la dissection; Conservez un ensemble supplémentaire en sauvegarde.
- Préparer 100 ml de solution de PBS stérile / 1% de FBS à utiliser pendant les lavages, les procédures d'immunomarquage et les étapes de tri cellulaire. Garder la solution refroidie à 4 ° C.
Remarque: Ne pas ajouter d'azoture de sodium (NaN 3 ) à la solution car elle peut être toxique pour les cellules vivantes.- Préparer 100 mL de PBS / 1% de FBS avec 99 mL de PBS et 1 mL de FBS.
- Préparez 100 ml de milieu de cellules nerveuses stériles supplémenté avec 3% de FBS (voir la Table des matériaux ) pour une utilisation en tant que collecte et milieu de culture. Garder le milieu de culture cellulaire stérile à 4 ° C. Ne le chauffez qu'à température ambiante (RT) avant utilisation.
- Préparer 100 ml de milieu cellulaire neural complété par 3% de FBS en utilisant 97 ml de milieu neuronal et 3 ml de FBS.
- Tubes de pré-refroidissement (tubes de 15 ml) pré-revêtus de 5 ml de milieu de collecte en plaçant tOurlet dans un seau à glace. N'utilisez que des tubes en polypropylène pour empêcher les cellules d'adhérer à la surface du tube.
- Placez des plaques de 40 mm, des filtres en nylon de 70 μm, des seringues, des pilons pour le filtre cellulaire et des tubes de polypropylène stériles dans l'armoire de sécurité biologique. Stériliser tous les articles avant les procédures et les maintenir de manière stérile tout au long des procédures.
Remarque: Toutes les étapes après la collecte de la rétine seront effectuées dans le cabinet de sécurité biologique.
2. Enucleation
Note: Au total, 10 souris jeunes (5-7 semaines) C57BL / 6J ont été utilisées dans cette expérience pour isoler 1,0 x 10 6 RGC avec le phénotype CD90.2 + CD48 nég CD15 neg CD57 neg .
- Euthaniser les souris en utilisant une inhalation de CO 2 suivie d'une dislocation cervicale. Toujours utiliser une méthode secondaire d'euthanasie pour s'assurer que l'animal euthanasié est mort.
- Insérer une pince sous le globe de l'œil, saisir le nerf optique et tirer vers le haut; Le globe sera énucléé, avec le nerf optique intact. Placez les yeux recueillis dans un flacon contenant du PBS et gardez le flacon sur la glace jusqu'à l'étape suivante.
Remarque: Tout personnel peut effectuer cette étape après avoir reçu la formation appropriée de l'Unité de soin des animaux de laboratoire (LACU).
3. Préparation de la suspension de la cellule rétinienne
- Placez l'oeil recueilli sur la plaque de base d'un microscope à dissection pour commencer la dissection cornéenne. Dissectez chaque oeil individuellement.
- Tenir soigneusement le globe à la base du nerf optique en utilisant des pinces. Pour cette étape, utilisez une longueG, et une courte pincée standard.
- Utilisez une aiguille pointue à 30 calibres (30G) pour percer la cornée pour permettre à l'humeur aqueuse d'évacuer de l'œil, ce qui facilite la tenue de l'œil avec la pince.
- Tenir la cornée avec la pince et utiliser des ciseaux pour faire une petite incision dans la cornée. Épluchez doucement la cornée et la scléroe à l'aide de la pince. Lorsque le globe est épluché à mi-chemin, roulez la retina et la lentille à l'aide de la pince. Jeter la cornée, la sclérotique et la lentille.
Note: Cette méthode garantit que la rétine se détache complètement du reste de l'œil. - Placez la rétine dans une petite boîte de Petri de 40 mm contenant du PBS / 1% de FBS.
Remarque: En alternative à la boîte de Petri, un plat de culture cellulaire peut être utilisé. Assurez-vous de conserver toujours la rétine humide, comme dans les conditions physiologiques.- Laver chaque rétine trois fois avec du PBS stérile frais / 1% de FBS dans le cabinet de sécurité biologique.
- Placez jusqu'à 12 retina surUne passoire de nylon stérile de 70 μm humidifiée avec du PBS / 1% de FBS. À l'aide de l'extrémité arrière d'une seringue de 10 ml, macérer doucement la rétine à l'aide d'un mouvement circulaire pour détacher les cellules.
- Alternativement, utilisez un pilon pour la macération des tampons cellulaires ou utilisez une digestion enzymatique avec une combinaison de 15 UI / mL de papaïne, 5 mM de L-cystéine et 200 U / ml de DNase I pendant 15 minutes à 37 ° C, puis une inactivation avec du PBS / 10% FBS.
Remarque: Aucun changement dans le pourcentage de cellules récupérées n'a été observé lorsque la digestion enzymatique a été comparée à la macération avec l'extrémité arrière de la seringue ou le pilon.
- Alternativement, utilisez un pilon pour la macération des tampons cellulaires ou utilisez une digestion enzymatique avec une combinaison de 15 UI / mL de papaïne, 5 mM de L-cystéine et 200 U / ml de DNase I pendant 15 minutes à 37 ° C, puis une inactivation avec du PBS / 10% FBS.
- Pour transférer les cellules isolées, placez la passoire de nylon stérile de 70 μm sur le tube de collecte de polypropylène. Passez les cellules collectées à travers la crépine en utilisant une pipette P1000. Rincez la crépine ( étape 3.6 ) avec PBS / 1% de FBS pour libérer les cellules restantes et transférez-les au tube de collecte.
- Ajouter PBS / 1% FBS à achUn volume final de 1 mL par rétine. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 7 min à 200 xg et RT.
Note: Selon le nombre de retinaes macérées (<6 retinae), la pastille cellulaire peut être trop petite pour être visible.- Jeter le surnageant cellulaire et remettre en suspension le culot cellulaire dans du PBS / 1% de FBS en utilisant un rapport de 1 mL par 5 rétines.
- Comptez les cellules en utilisant un hémocytomètre.
- Nettoyer un hemocytomètre en verre et une lamelle coulissante avec 70% d'alcool. Tournez doucement le tube contenant les cellules pour s'assurer que la suspension de la cellule de la rétine est uniformément répartie. Placer 20 μL de 0,2% de trypan bleu dans un tube de microcentrifugeuse et mélanger avec 20 μL de suspension cellulaire.
- Mélanger doucement et appliquer 10 μL du mélange de suspension trypan bleu / cellule à 0,4% à l'hémocytomètre, en remplissant les deux chambres; L'action capillaire entraînera le mélange de 0,4% de trypan bleu / cellule sous la lamelle. À l'aide d'un microscope, compter toutes les cellules trypan bleu-négatives; ThiLe numéro de s représente les cellules en direct.
- Déterminer la viabilité cellulaire en utilisant la formule suivante: nombre de cellules vivantes / nombre total de cellules =% de viabilité.
Remarque: Si la viabilité des cellules est inférieure à 95%, l'utilisation de colorants fluorescents pour la discrimination viabilité cellulaire est requise pendant FACS.
- Utilisez un colorant de viabilité fluorescente non perméable aux cellules vivantes. Lavez les cellules avec du PBS pour éliminer toute trace de sérum. Ajouter 1 μl de colorant fluorescent pour la discrimination de viabilité cellulaire par 5,0 x 10 6 cellules dans un volume final de 100 μL. Incuber à la température ambiante pendant 15 minutes, protégé de la lumière. Ajouter 10 fois le volume de PBS / 1% FBS. Centrifuger pendant 5 min à 200 xg et RT.
- Incuber la suspension cellulaire pendant une nuit à 4 ° C, si nécessaire. Si cela est fait, remplissez le tube de suspension de cellules avec un milieu de cellules neurales plutôt que PBS / 1% de FBS. Placez le tube horizontalement et maintenez-le à 4 ° C.
4. Immunomarquage du ReTinal Cells
- Utilisez la conversion suivante pour déterminer le volume d'anticorps par numéro de cellule: 2 μL d'anticorps par 5,0 x 10 6 cellules dans un volume de 100 μL.
- Lavez les cellules et maintenez-les dans du PBS / 1% de FBS. Prenez une petite aliquote de cellules (5,0 x 10 6 cellules) pour utiliser comme témoin négatif (non marqué) au moment de la configuration de tri.
Remarque: Ce contrôle négatif est essentiel pour l'étalonnage correct du trieur de cellule. - Pour minimiser la liaison non spécifique des anticorps aux cellules qui expriment les récepteurs Fcγ II et III, ajouter 1 μL d'un anticorps CD16 / 32 anti-souris par 1,0 x 10 6 cellules dans un volume final de 50 μL en utilisant PBS / 1% FBS. Incuber pendant 10 min à la RT.
- Ajouter le cocktail d'anticorps à l'échantillon et mélanger doucement en pipettant. Incuber pendant 30 minutes dans un seau à glace. Assurez-vous que le seau à glace est recouvert, car la lumière pourrait compromettre l'expérience en raison du photoblanchage du fluoro marquéPhores.
- Préparez le cocktail d'anticorps en utilisant les anticorps suivants anti-souris marqués par fluorescence: CD90.2 AF-700, CD48 PE-Cyanine7, CD15 PE et CD57 non marqué.
Note: Pour chaque anticorps, utilisez les concentrations suivantes pour 5,0 x 10 6 cellules: CD90.2 AF700, 1 μg; CD48 PE-Cyanine7, 0,4 μg; CD15 PE, 0,02 μg; Et CD57 non marqué, 0,4 μg.- Utilisez les volumes selon les calculs suivants (en fonction des anticorps disponibles dans le commerce dans la Table des matériaux ): total de 5,0 x 10 7 cellules à étiqueter; 2 μL par 5,0 x 10 6 cellules = 20 μL de chaque anticorps; 4 anticorps différents = 80 μl de cocktail d'anticorps; Volume final = [(5,0 x 10 7 cellules totales) /5,0 x 10 6 cellules] x 100 = 1000 μL; 80 μL d'Abs + 50 μL de CD16 anti-souris / 32 + 870 μL de PBS / 1% de FBS = 1 000 μL.
Note: Cette combinaison a fourni leCombinaison optimale de fluorochromes pour la configuration de l'instrument. Les paramètres suivants résument l'émission et l'excitation: AF-700, émission de 719 nm lorsqu'elle est excitée avec un laser à diode rouge de 638 nm; PE-Cyanine7, émission de 767 nm lorsqu'elle est excitée avec un laser à diodes bleues de 488 nm; Et PE, émissions de 575 nm lorsqu'elles sont excitées avec un laser à diodes bleues de 488 nm.
- Utilisez les volumes selon les calculs suivants (en fonction des anticorps disponibles dans le commerce dans la Table des matériaux ): total de 5,0 x 10 7 cellules à étiqueter; 2 μL par 5,0 x 10 6 cellules = 20 μL de chaque anticorps; 4 anticorps différents = 80 μl de cocktail d'anticorps; Volume final = [(5,0 x 10 7 cellules totales) /5,0 x 10 6 cellules] x 100 = 1000 μL; 80 μL d'Abs + 50 μL de CD16 anti-souris / 32 + 870 μL de PBS / 1% de FBS = 1 000 μL.
- Préparez le cocktail d'anticorps en utilisant les anticorps suivants anti-souris marqués par fluorescence: CD90.2 AF-700, CD48 PE-Cyanine7, CD15 PE et CD57 non marqué.
- Après l'incubation de 30 minutes, amener le volume jusqu'à 5 mL en utilisant du PBS / 1% de FBS. Lavez les échantillons en les centrifugant pendant 7 min à 200 xg et à la RT. Répétez la procédure une fois pour supprimer tous les anticorps non liés.
- Ajouter 2 μl d'anticorps secondaire (0,1 μg), qui lieront le CD57 de 5,0 x 10 6 cellules. Incuber pendant 30 min dans un seau à glace, comme à l' étape 4.4 . Lavez les cellules deux fois, comme à l' étape 4.5 .
- Étiquetez les cellules avec un anticorps secondaire si un anticorps primaire non marqué a été utilisé à l' étape 4.4 .
Remarque: le deuxièmeL'anticorps choisi pour cette configuration est indiqué dans la Table des matières ; Il a une longueur d'onde d'émission de 421 nm. Utilisez-le avec un filtre passe-bande de 450/50 nm lorsqu'il est excité avec le laser à diode violette à 405 nm. - Utilisez les volumes selon les calculs suivants (en fonction de l'anticorps disponible dans le commerce dans la Table des matériaux ): 2 μL par 5,0 x 10 6 cellules = 20 μL d'anticorps secondaire; Volume final = [(5,0 x 10 7 cellules totales) /5,0 x 10 6 cellules] x 50 = 500 μL; 20 μL d'Abs + 480 μL de PBS / 1% FBS = 500 μL.
- Étiquetez les cellules avec un anticorps secondaire si un anticorps primaire non marqué a été utilisé à l' étape 4.4 .
- Conserver les cellules marquées dans PBS / 1% FBS. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre; Utiliser une concentration finale de cellules rétiniennes de 3,0 - 4,0 x 10 7 cellules / ml.
Remarque: N'utilisez pas de milieu de culture cellulaire pour diluer les cellules car le phénol rouge peut augmenter l'autofluorescence, réduisant ainsi la résolution entre le négatifDes cellules positives et positives. La concentration cellulaire finale par volume dépend fortement du débit volumique de la configuration de l'instrument. - Utilisez les contrôles à une seule couleur lors de l'installation pour minimiser les retombées de fluorescence.
Remarque: Cette étape, également appelée compensation, est appliquée pour corriger le bruit créé par la combinaison de fluorophores. Les microsphères de polystyrène dans le PBS / 0,1% de BSA / 2 mM de NaN3 avec la capacité de lier des isotypes d'immunoglobuline (Ig) marqués par fluorescence de multiples espèces fournissent des contrôles positifs pour établir la compensation.- Placez 3 gouttes de microsphères de polystyrène dans des tubes FACS stériles, en allouant un par fluorophore. Ajouter 1 μg du fluorophore correspondant à chaque tube. Incuber pendant 15 min à la température ambiante, protégé de la lumière. Ajouter 3 ml de PBS / 1% de FBS aux tubes d'échantillon. Centrifuger pendant 5 min à 200 xg et RT. Retirez soigneusement le surnageant et ré-endérez dans 250 μL de PBS / 1% de FBS.
- Pour configurer le contrôle négatifOls, utiliser des microsphères de polystyrène qui ne se lient pas aux Ig. Effectuez cette étape la veille, si nécessaire.
5. Stratégie de tri des cellules
Remarque: instructions spécifiques pour l'installation d'instruments pour FACS avec 355 nm, UV; 405 nm, violet; 488 nm, bleu; Et 640 nm, les lasers rouges avec une distribution de canal de fluorescence 2, 2, 5 et 3, respectivement. Le logiciel d'exploitation était DIVA version 8.0.1. Le tri cellulaire a été effectué avec une buse de 70 μm, une pression de gaine de 70 psi, une fréquence de 87,5, une amplitude de 48,6 avec une première rupture de chute à 333, un écart de 6, un tri de précision réglé sur une pureté à quatre points avec un masque de pureté par défaut (32) et une goutte Retard ajusté à 42,98 en utilisant des perles.
- Utiliser des tubes coniques en polypropylène à 15 ml comme récipients de collecte. Ajouter 5 ml du milieu de collecte (milieu de culture cellulaire) à chaque tube et faire pivoter le tube pour recouvrir les parois.
Remarque: Cette étape empêche les cellules de coller sur les côtés de tLe tube de collecte. En variante, le tube peut être revêtu de FBS non dilué. - Prendre en considération l'efficacité du trieur de cellule pour estimer le rendement final des cellules.
Remarque: L'efficacité du genre varie en fonction du cytomètre de flux utilisé. Les RGC avec CD90.2 + CD48 neg CD15 nég CD57 nég phénotype comprennent environ 1% de toutes les cellules de la rétine. - Faites passer le tri cellulaire par un opérateur qualifié (habituellement dans une installation centrale). Assurez-vous que l'instrument est nettoyé et stérilisé avec de l'éthanol à 70% avant l'acquisition de l'échantillon. Essuyez soigneusement l'extérieur des tubes de collecte avec 70% d'éthanol également.
- Si les cellules se sont installées ou agrégées, pipettez les cellules vers le haut et vers le bas et filtrez la suspension à travers un filtre de nylon stérile de 40 μm avant l'acquisition. Assurez-vous de contrôler la température et de la maintenir à 4 ° C pendant que le tri des cellules est en cours; Le fait de ne pas le faire réduira leJe cède.
- Discutez des détails du tri avec l'opérateur de tri des cellules avant d'effectuer les expériences.
Remarque: Au moment de l'expérimentation, l'opérateur de classement de cellule aura cliqué sur une série de boutons dans la barre d'outils Espace de travail du logiciel d'acquisition pour le cytomètre. Il s'agit du navigateur , du cytomètre , de l' inspecteur , de la feuille de travail et du tableau de bord d'acquisition . La stratégie de tri cellulaire utilisée ici est connue sous le nom de type 2 voies. Deux populations sont collectées: les RGC enrichis et tous les autres types de cellules. Si des populations supplémentaires doivent être collectées, jusqu'à deux populations supplémentaires peuvent être isolées à 4 voies. Si des populations supplémentaires seront collectées, le trieur de cellule nécessite différents tubes de collecte et configuration. - Effectuer une compensation pour corriger le chevauchement spectral des fluorophores.
Remarque: ce processus peut être effectué manuellement en ajustantChaque paramètre, ou il peut être fait automatiquement dans le cadre du logiciel en cours d'utilisation. La plupart des logiciels pour l'équipement de tri cellulaire ont la possibilité d'une compensation automatisée. Il est considéré comme l'étalon-or et le type de compensation le plus précis. L'échantillon négatif (sans fluorophore) et les contrôles individuels préparés avec des microsphères de polysterène (perles de compensation) spécialement fabriquées pour lier tous les anticorps monoclonaux pertinents utilisés dans l'expérience seront utilisés dans cette étape.- Sélectionnez Expérience> Configuration de la compensation> Créer des contrôles de compensation . Ajoutez les contrôles spécifiques au fluorophore de la liste affichée à l'écran. Cliquez sur OK .
Remarque: Un tube de compensation pour chacun des contrôles sera affiché.- Utilisez un contrôle non marqué (pas de fluorophore, étape 4.2 ) pour vérifier la lumière diffusée vers l'avant (FSC), la lumière diffusée latéralement (SSC) et la réception de la population initiale (P1).
- Installez le tube de contrôle négatif sur le cytomètre et cliquez sur Charger. Vérifiez que la population d'intérêt s'affiche et sélectionnez-la. Il s'agit de la population 1 (P1). Cliquez avec le bouton droit de la souris sur la porte P1 et sélectionnez Appliquer à Tous les contrôles de compensation . Cliquez sur Enregistrer les données . Une fois l'enregistrement terminé, cliquez sur Décharger et enlever le tube.
- Installez le tube suivant sur le cytomètre, tel qu'indiqué sur l'écran. Répétez l' étape 5.6.2 jusqu'à ce que toutes les données des contrôles aient été enregistrées.
- Sélectionnez Expérience> Configuration de la rémunération> Calculer la compensation . Enregistrez l'installation et nommez l'expérience. Cliquez sur Lien et Enregistrer .
Remarque: La compensation est une étape nécessaire car elle supprime le chevauchement du spectre entre les détecteurs. - Si une compensation manuelle est nécessaire, faites-en en ajustant les moyens des signaux positifs afin qu'ils soient égaux aux négatifs pour l'eacH des fluorochromes utilisés.
Remarque: Cette étape est effectuée par l'opération de trieur de cellule et peut durer 30 min.
- Sélectionnez Expérience> Configuration de la compensation> Créer des contrôles de compensation . Ajoutez les contrôles spécifiques au fluorophore de la liste affichée à l'écran. Cliquez sur OK .
- Stratégie de gating ( Figure 3A ).
- Configurez P1 en traçant FSC contre SSC; Le FSC est indicatif de la taille et le SSC indique la complexité interne des cellules. Voir la figure 3A .
- Dessinez un diagramme pseudocolor de SSC-H (hauteur) par rapport à SSC-W (largeur) en utilisant la population sélectionnée à l' étape 5.7.1 (P1); Le diagramme pseudocolor permet la représentation visuelle de la densité des cellules par rapport à l'autre.
Remarque: Une densité cellulaire inférieure est représentée par le bleu et le vert, alors que les zones rouge et orange représentent une forte densité cellulaire.- Effectuez cette étape pour collecter des cellules uniques uniquement; La porte de cellule unique s'appelle P2. Voir la figure 3A .
- Répétez l'étape 5.7.2 àParcelle FSC-H versus FSC-W en utilisant P2. Assurez-vous que la sélection de cellules individuelles en «doublets» ou en agglomérants contient à la fois un marqueur positif et un marqueur négatif, fournissant une fausse positivité.
- Dessinez un diagramme pseudocolor de CD90.2 versus CD48. Sélectionnez toutes les cellules négatives CD90.2 + CD48 pour éliminer les monocytes de l'enrichissement RGC; Appelez cette porte CD90.2 + CD48 neg , ou P3. Voir la figure 3A .
- À l'aide de la population négative CD90.2 + CD48 sélectionnée ou de la porte P3, dessinez un diagramme pseudocolor de CD57 versus CD15 pour éliminer les contaminants des cellules amacrine de l'enrichissement RGC. Placez la CD15 nég CD57 neg population. Voir la figure 3A .
- Définissez les populations à collecter pour l'échantillon dans la fenêtre "Trier la disposition" et procédez au tri des cellules; L'échantillon à collecter est CD90.2 + CD48 nég CD15 nég CD57 nég P>.
Remarque: La population à trier est sélectionnée dans le menu déroulant Ajouter dans la fenêtre de tri. Après avoir ajouté la population, il demandera des événements cibles ou le nombre d'événements à collecter. À tout moment, la mise en page de tri peut être modifiée en cliquant sur le champ Trier l'emplacement contenant la population. 0,9% ± 0,3 de RGC avec le phénotype CD90.2 + CD48 nég CD15 nég CD57 neg sont obtenus auprès de souris jeunes (5-7 semaines) et 0,5% ± 0,3 et anciennes (> 12 mois) C57BL / 6J 23 . - En utilisant 25 000 cellules, effectuez une vérification de la pureté 23 . Voir la figure 3B -E.
Remarque: La vérification de la pureté est le processus pour réanalyser les cellules triées afin de vérifier la précision du tri de la cellule. Une petite aliquote de cellules triées sera chargée sur le cytomètre pour vérifier l'efficacité du tri.
- Etiquetage intracellulaire.
- Fixer les cellules triées pendant 1 h et perméabiliser à 4 ° C pour rendre les cellules métaboliquement inactives et permettre la pénétration des anticorps intracellulaires.
- Diluer les anticorps suivants dans la solution de perméabilisation: protéine de liaison anti-ARN avec épissage multiple (RBPMS) à une dilution 1: 100 dans un stock de 100 μg / mL; Anti synucléine gamma (SNCG), 1: 100 dans un stock de 1 mg / mL; Protéine de domaine 3A (BRN3A) de type homeobox / POU spécifique au cerveau, 1: 100 dans un stock de 200 μg / mL; Et la tubuline beta de classe III anti-neuron spécifique (TUJ1), 1: 100 dans un stock de 1 mg / mL. Incuber les cellules et les solutions d'anticorps pendant 1 heure dans un seau à glace recouvert.
- Lavez les échantillons deux fois avec du PBS / 1% de FBS.
- Remettre en suspension les cellules dans l'anticorps secondaire marqué à l'AF488 approprié à une dilution de 1: 200 pendant 30 minutes dans un seau à glace.
- Lavez les échantillons comme à l' étape 6.1.3. Gardez les cellules dansPBS / 1% de FBS (250 μL) jusqu'à ce qu'ils soient prêts à analyser.
7. Validation de la cellule triée par qPCR Analyse
Remarque: voir la figure 4 .
- Extraction d'ARN 23 .
- Extraire l'ARN de 5,0 x 10 5 cellules triées par lyse cellulaire et homogénéisation suivie de l'addition de chloroforme.
- Transférer la phase supérieure, incolore à un microtube propre pour la précipitation d'alcool, puis la concentration d'extrait dans une colonne de spin. Effectuer une digestion ADNse sur la colonne.
- Lavez la colonne avec de l'eau sans RNase pour l'élution de l'ARN.
- Évaluer la concentration d'ARN par spectrophotométrie.
- La synthèse et la pré-amplification de l'ADNc.
- Utiliser 100 ng de matériau ARN et mélanger avec une solution contenant une enzyme de transcriptase inverse, un inhibiteur de ribonucléase recombinant (pour éviter la dégradation de l'ARN), le chlorure de magnésium (MgCL 2 ), et des désoxynucléotides.
- Mélanger le contenu du tube et incuber pendant 10 min à 25 ° C suivi de 60 min à 42 ° C. Terminer la réaction avec une incubation de 5 minutes à 85 ° C. Conservez l'ADNc résultant à -20 ° C jusqu'à ce qu'il soit prêt à l'emploi.
Remarque: le matériau d'ADNc peut être stocké à -20 ° C pendant un mois si l'étape de préamplification ne peut être effectuée immédiatement.
- Préamplification de l'ADNc.
- Préamplifier le matériel d'ADNc à l'aide d'une série d'amorces spécifiques pour les multiples types de cellules de la rétine, y compris: les cellules ganglionnaires de la rétine, les cellules amacrine, les astrocytes, les cellules épithéliales du pigment rétinien, bipolaire, horizontale, photorécepteurs et rétiniennes, comme indiqué dans la référence 23 et dans la table Des matériaux .
Note: La réaction de préamplification est préparée pour augmenter la sensibilité de la détection pour la quantification. La réaction de préamplification contient un mélange de l'amorceSe mélange à la table des matières ; 2,5 μl d'ADNc, qui a commencé à 100 ng d'ARN; Enzyme de transcriptase inverse; Et de l'eau libre de nuclease dans un volume final de 10 μL. - Effectuer l'étape d'activation de l'enzyme à 95 ° C pendant 10 min, suivie de 14 cycles à 95 ° C pendant 15 s, suivie de 60 ° C pendant 4 min. Diluer le matériau préampli 1:10 dans le tampon Tris EDTA et le garder à -20 ° C jusqu'à ce qu'il soit prêt à l'emploi.
- Préamplifier le matériel d'ADNc à l'aide d'une série d'amorces spécifiques pour les multiples types de cellules de la rétine, y compris: les cellules ganglionnaires de la rétine, les cellules amacrine, les astrocytes, les cellules épithéliales du pigment rétinien, bipolaire, horizontale, photorécepteurs et rétiniennes, comme indiqué dans la référence 23 et dans la table Des matériaux .
- 7,4 qPCR réaction.
- Préparez toutes les réactions de qPCR dans un volume final de 10 μL en utilisant l'ADNc dilué, préamplifié (2,5 μL), les amorces (listées dans la Table des matériaux ), l'eau exempte de nuclease et un concentré avec l'ADN polymérase et les désoxynucléotides.
- Utilisez les conditions d'instrument suivantes pour exécuter le qPCR: une étape de maintien de 50 ° C pendant 2 min, suivie de 95 ° C pendant 10 min. Effectuer un total de 40 cycles à 95 ° C pendant 15 s suivi de 60 ° C pendant 1 min. Effectuer tous mesurDans des répliques de trois.
- Effectuer une quantification relative en utilisant le seuil comparatif (C T ) après avoir déterminé les valeurs de C T pour le gène ménager et les gènes cibles dans chaque échantillon. Calculez le changement de pli relatif (R q ) en utilisant l'équation suivante: R q = 2 T -ΔC , où ΔC T = gène C T - gène de référence C T 23 .
Remarque: Le C T est défini comme le cycle de PCR auquel le signal fluorescent du colorant rapporteur traverse un seuil arbitrairement placé 26 . Le C T est inversement lié à la quantité d'amplicon (produit de PCR) dans la réaction.
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Representative Results
L'étude approfondie des RGC est entravée par de nombreux facteurs, y compris leur faible fréquence et l'absence d'une méthodologie robuste et standardisée pour leur isolement. La figure 1 montre la méthodologie utilisée pour l'isolement des rétines. Les variations de la procédure d'énucléation existent en fonction du type d'analyse, comme si l'énucléation fait partie de l'expérimentation in vivo 27 . L'énucléation dans ce protocole est effectuée sur des souris euthanasiées. Comme le montre la figure 1A- B , les pinces sont placées sous l'œil et tirées vers le haut pour provoquer un saignement minimal et pour enlever un globe oculaire avec un nerf optique intact.
Des différences existent dans le nombre de RGC dans différentes souches de souris, en particulier chez les souris génétiquement modifiées 23 , 28 ,Effet> 29 , 30. La prise de conscience de ces différences est importante lors de la détermination du nombre de souris à utiliser. Les rétines provenant des vieilles souris C57BL / 6J ont moins de cellules rétiniennes vivantes que leurs homologues plus jeunes 23. Par conséquent, la dissection rétinienne doit être effectuée avec précaution Le processus de recouvrement de la rétine est présenté étape par étape pour la dissection de la rétine. Les cellules de la rétine sont fragiles. Ainsi, les rétines disséquées sont placées dans des filtres de nylon et sont macérées avec l'extrémité arrière d'une seringue. La maceration des cellules directement dans la crépine cellulaire est rapide et réduit les touffes cellulaires. Une image représentative de la suspension cellulaire est illustrée à la figure 2B . Des cellules rétiniennes internes multiples peuvent être visualisées. Figure 2A , ou avec un pilon pour les tamis cellulaires. À ce stade, les RGC ont perdu leur morpholo signatureEn raison de l'axotomie lors de l'isolement cellulaire et de la préparation de la suspension cellulaire.
L'étape la plus intensive en main-d'œuvre de cette méthodologie est la configuration du tri cellulaire. Cette phase est une étape critique lors des FACS multicolores, car elle maximise la résolution du signal sur le bruit. La figure 3A montre la stratégie de gating utilisée pour l'isolement des RGC. Cette stratégie visait l'élimination des cellules contaminantes de la suspension cellulaire, incluant les cellules monocytes, gliaires, amacrines et photoréceptrices. Dans le cadre de la méthodologie, des marqueurs de surface supplémentaires ont été confirmés par une analyse immunohistochimique avant d'être utilisés dans le cadre de la stratégie d'exclusion. Les données précédentes ont démontré qu'un faible pourcentage de cellules CD90.2 + sont CD48 + . L'exclusion de ces cellules a éliminé les monocytes et éventuellement la microglie du groupe de cellules retinae. On a déjà montré que le classique Thy1 + CD48 neg 23 , car ces cellules expriment des gènes associés à des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes rétiniennes ( Figure 4A ) amacrine, Müller, bipolaire, photorécepteur horizontal. Ceci est également abordé en étudiant les marqueurs supplémentaires pour l'exclusion des cellules. CD15 a été décrit comme un marqueur de cellules amacrine et bipolaires 31 , incitant à son utilisation comme marqueur supplémentaire pour une sélection négative. Travaux d'Uusitalo et al. 32 ont décrit le CD57 comme un marqueur d'identification pour les cellules gliales et les photorécepteurs. Par conséquent, cet anticorps a été ajouté à la stratégie de tri cellulaire.
Ensuite, ces cellules ont été caractérisées pour valider la méthodologie pour l'isolement des RGC murins. Les phénotypes du CD90.2 + CD48 nég CD15 nég CD57 nég triés les cellules (<Strong class = "xfig"> Figure 3B) ont été évalués pour l'expression des marqueurs intracellulaires suivants associés aux RGC 10 , 11 , 12 , 33 : SNCG, BRN3A, TUJ1 et RBPMS. Comme le montre la figure 3C , les cellules triées ont exprimé les quatre protéines intracellulaires associées au RGC. Ensuite, la cytométrie de flux d'imagerie a été utilisée dans la figure 3D pour montrer la localisation intracellulaire de RBPMS et l'expression de la surface cellulaire de CD90.2. Ces résultats ont été testés dans des systèmes de cytomètres multiples, confirmant la reproductibilité et la standardisation. Comme le montre la figure 3E , certaines cellules triées ont commencé à montrer la morphologie associée aux RGC après culture cellulaire in vitro .
Enfin, une comparaison des cellules avant l'enrichissement et le post-ceL'analyse de qPCR a été analysée. La comparaison du phénotype négatif Thy1 + CD48 aux CD90.2 + CD48 nég CD15 nég CD57 nég classé a révélé que le phénotype négatif Thy1 + CD48 exprime des gènes associés aux RGC, mais aussi à d'autres cellules rétiniennes. Cependant, la population cellulaire triée hautement enrichie ( figure 4B ) a montré une multiplicité d'augmentation des gènes codant pour les marqueurs intracellulaires spécifiques à la RGC Sncg (SNCG), Pouf4l (BRN3A), Tubb3 (TUJ1) et Rbpms (RBPMS). Collectivement, les évaluations d'ARNm et de protéines ont validé la méthodologie.
Figure 1 . Enucleation et dissection oculaire pour l'isolement rétinien. Les jeunes souris C57BL / 6J ont été euthanasiées avant tO suppression du globe de l'oeil avec CO 2 et dislocation cervicale. A) Placez la pince sous l'œil et tirez l'oeil dans un mouvement. B) L'œil est enlevé, y compris le nerf optique. CJ) Guide étape par étape pour enlever la rétine. C) Une ponction est effectuée à l'aide d'une aiguille 30G avant l'élimination de la cornée pour permettre à l'humeur aqueuse de sortir de l'œil. D) La cornée est maintenue avec une pince pour faire une petite incision. EF) L'utilisation de pince permet d'éliminer la cornée, l'épithélium pigmentaire rétinien, la choroïde et la sclérotique. La rétine est détachée de la sclérotique, roulée et enlevée. G) L'objectif est retiré et mis au rebut. HJ) Les rétines collectées sont placées dans un petit plat contenant du PBS / 1% de FBS pour les garder humides en tout temps. Cliquez ici pour voir une version plus grande de cettefigure.
Figure 2 . Suspension de cellules rétiniennes après la macération de rétine collectée. Les rétines collectées sont placées dans un petit plat pour isoler les cellules. A) Les récipients sont placés dans une crépine en nylon de 70 μm et macérés à l'aide de l'extrémité arrière d'une seringue. B) Image représentative de la suspension cellulaire, où des cellules rétiniennes distinctes sont observées. La barre d'échelle est de 10 μm.
Figure 3 . Stratégie de tri pour l'isolement des cellules avec CD90.2 + CD48 nég CD15 nég CD57
Figure 4 . Analyse d'ARNm pré et post-tri. Thy1 + CD48 nég et les cellules triées avec le phénotype CD90.2 + CD48 nég CD15 nég CD57 nég ont été évaluées par analyse qPCR en utilisant un panel de 25 gènes exprimés par des cellules rétiniennes. Les niveaux d'expression des gènes cibles sont présentés sous la forme d'un changement de Log 2 en utilisant Hprt comme un gène ménager et l'eau comme témoin négatif. Le calcul a été effectué en fonction de la méthode ΔC T. Moyenne ± SEM; N = 3 répétitions biologiques ont été effectuées en triple. Les chiffres obtenus à partir du travail précédemment publié avec autorisation 23 .
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Discussion
FACS est la technique de choix pour purifier les populations cellulaires. D'autres méthodes d'isolement comprennent l'immunopanning, les perles magnétiques et l'appauvrissement de la fixation du complément. L'avantage de FACS par rapport à ces autres méthodes est basé sur l'identification simultanée des marqueurs de surface cellulaire avec des degrés d'intensité variables. L'intensité fluorescente de la molécule est proportionnelle à la quantité d'expression protéique. Jusqu'à présent, l'isolement des RGC était basé uniquement sur la positivité ThY1 (CD90) et la négativité CD48 15 , 16 , 22 , 34 , indépendamment de la méthode d'isolement utilisée. On a récemment montré que le phénotype négatif Thy1 + CD48 ne suffit pas pour isoler une population homogène de cellules exprimant des marqueurs intracellulaires RGC [ 23] . L'identification de la population RGC est essentielle pour leur isolement, en particulierY parce qu'ils comprennent un petit pourcentage de cellules rétiniennes 7 , 8 , 9 . La majorité des RGC sont situés dans la couche la plus interne de la rétine, alors qu'un petit nombre est situé dans les couches plexiformes internes (RGC 35 déplacés). Ainsi, le traçage des RGC des coliques supérieurs par des injections stéréotaxiques et un traçage avec l'hydroxystillbamidine (un traceur rétrograde pour décrire les neurones) est devenu des choix attractifs pour de nombreux laboratoires 36 , 37 , 38 . Ces systèmes nécessitent l'injection de traceur qui, s'il n'est pas effectué correctement, peut conduire à l'absence de certaines régions rétiniennes. De plus, ils sont plus exigeants sur le plan technique et, comme d'autres méthodes comme l'immunopanning, sont longs. L'immunopanning utilisant les anticorps anti-Thy1 et -CD48 prend 48 h pour compléter et ne réalise pas plus de 95% De pureté. Ce travail décrit une méthodologie basée sur FACS qui offre un protocole rapide et reproductible pour isoler une population homogène de RGC en direct avec CD90.2 + CD48 nég CD15 nég CD57 nég phénotype, sans l'utilisation de traceurs, de perles magnétiques ou de techniques d'immunopanning .
Les facteurs suivants sont nécessaires pour l'isolement réussi des RGC purs par FACS: 1) l'efficacité de tri, qui dépend fortement de l'équipement utilisé; 2) combinaison optimale de fluorochromes marqués par des anticorps, pour minimiser le bruit; Et 3) configuration de tri de cellules. L'efficacité de tri est calculée en prenant le nombre d'événements cibles sélectionnés pour le tri divisé par le nombre d'événements cibles détectés, exprimés en pourcentage. L'efficacité de tri est un calcul fourni par l'équipement. Cette efficacité dépend de la configuration du système de tri et du mode de tri cellulaire. Choisir une combinaison optimale de fluorochromes est un processus complexe. Chaque grippeL'orochrome a des propriétés distinctes et se caractérise par ses longueurs d'onde d'excitation et d'émission. Alors que l'excitation est lue avec un laser, l'émission est lue par des tubes photomultiplicateurs, qui sont limités par les filtres optiques disponibles dans l'équipement de tri FACS. Ici, on fournit une combinaison de fluorochromes à l'anticorps PE, PE-Cyanine7, AF700 et BV421. Ceci a été déterminé après avoir examiné plusieurs combinaisons de fluorochrome qui ont fourni la meilleure résolution tout en réduisant le chevauchement spectral. Enfin, l'installation de tri est critique. En général, les cellules de la rétine sont fragiles. Ainsi, il est préférable d'utiliser une pression plus faible pour exécuter les échantillons, afin de minimiser le stress sur les cellules. Il est essentiel de maintenir l'échantillon à 4 ° C, car garder les RGC murins pendant des périodes plus longues à température ambiante peut réduire le rendement cellulaire, en particulier lors du triage d'un grand nombre de cellules.
Le triage basé sur FACS est une méthodologie idéale pour l'isolement des cellules qui composent avUn petit pourcentage de la suspension cellulaire. Le processus, de la dissection de la rétine à l'achèvement du tri des cellules, prend environ 5 à 6 h, par rapport aux systèmes d'immunopanning et de traçage, qui prennent des jours à compléter. L'analyse multidimensionnelle de FACS et la capacité de l'équipement à collecter plusieurs populations viables permettent d'effectuer d'autres analyses fonctionnelles des cellules. Le protocole décrit ici est un outil puissant pour l'isolement des RGC murins primaires. Malgré ses multiples avantages, y compris sa sensibilité, sa reproductibilité et l'identification immédiate de cellules viables, il existe certaines limites. Tout d'abord, il nécessite une instrumentation coûteuse et un opérateur hautement qualifié. Habituellement, l'opérateur est un immunologiste ou un individu hautement qualifié sur le terrain, avec lequel il faut se réunir au moment de la mise en place de l'expérience. De nos jours, les établissements universitaires disposent de multiples installations de base, ce qui peut faciliter l'exécution de ces types d'expériences. Deuxièmement, les RGC perdent leur intérêtMorphologie optique due à l'atoxomie, ce qui les rend très faibles. À l'heure actuelle, on ne sait pas si certains de leurs gènes peuvent être modulés en raison de l'atoxomie.
La méthodologie présentée ici permet l'analyse en aval de la fonction RGC in vitro et est un outil précieux à utiliser dans les domaines des sciences visuelles et de la santé. Le maintien de la production de ganglions cellulaires dans le cerveau est nécessaire pour la perception visuelle et est à risque dans de multiples maladies. Ces cellules peuvent être utilisées pour une expérimentation in vitro contrôlée, tant dans les modèles sains que dans les modèles de maladies. Des études électrophysiologiques, pharmacologiques, biochimiques et moléculaires peuvent être réalisées sur ces cellules, ce qui est idéal pour le développement de futures cibles thérapeutiques.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier M. Tim Higgins, Illustrateur principal du Département de microbiologie, d'immunologie et de biochimie, pour l'assistance vidéo technique; Dr. Matthew W. Wilson pour les discussions et les membres des laboratoires Jablonski et Morales-Tirado pour leurs commentaires utiles. Ce travail a été soutenu par le Prix du jeune chercheur de l'Institut de recherche d'Alcon (VMM-T), la Fondation de recherche de l'Université de Tennessee (VMM-T), l'Institut national des yeux EY021200 (MMJ), Gerwin Fellowship (VMM-T); La bourse pré-doctorale Gerwin (ZKG), la recherche médicale et le commandement du matériel du ministère de la Défense (VMM-T) et la subvention sans restriction de la recherche pour prévenir la cécité.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse CD15 PE | BioLegend | 125606 | Clone MC-480 |
| Anti-mouse CD48 PE-Cy7 | BioLegend | 103424 | Clone HM48-1 |
| Anti-mouse CD57 | Sigma Aldrich | C6680-100TST | Clone VC1.1 |
| Anti-mouse CD90.2 AF700 | BioLegend | 105320 | Clone 30-H12 |
| Brilliant Violet 421 Goat Anti-mouse IgG | BioLegend | 405317 | Clone Poly4053 |
| Purified Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | FcgRII/III block, Clone 93 |
| Zombie Aqua | BioLegend | 423102 | Live cell/ Dead cell discrimination |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | U.S. origin |
| AbC Total Antibody Compensation Bead Kit | Thermo Fisher Scientific | A10497 | Multi-species Ig |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Add serum to media prior to culture. |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | Saline solution |
| Dissection Microscope | Olympus | SZ-PT Model | Stereo Microscope |
| Sorvall Centrifuge | Thermo Scientific | ST 16R | All centrifugation performed at RT |
| Base Plate – Dissection Pan | Fisher Scientific | SB15233FIM | A wax plate can also be used |
| Forceps | Aesculap | 5002-7 | 4 ½ inches |
| Iris Scissors, Straight | Aesculap | 1360 | 5 ½ inches |
| Falcon 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 352097 | Polypropylene tubes |
| Falcon 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 352098 | Polypropylene tubes |
| BD FACS Tubes | Fisher Scientific | 352003 | Polypropylene tubes |
| 40 mm dishes | MidSci | TP93040 | Tissue culture treated |
| 70 μm nylon strainer | MidSci | 70ICS | sterile |
| 40 μm nylon strainer | MidSci | 40ICS | sterile |
| BD 10 mL syringe | Fisher Scientific | 301604 | Disposable Syringe without needle |
| Pestles | MidSci | PEST | sterile |
| Wheaton Vials | Fisher Scientific | 986734 | No Liner |
| BD 30 G needle | Fisher Scientific | 305128 | 1 inch |
| Hausser Scientific Bright-Line Glass Counting Chamber | Fisher Scientific | 0267151B | Hemocytometer |
| Gibco Trypan blue 0.4% Solution | Fisher Scientific | 15250061 | Viability Dye |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | 1.5mL |
| EVOS Floid Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | 447113 | Fluorescence Imaging with a 20X objective |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-452 | Used to make 70% Ethanol |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | Rainin | 17014282 | LTS Pipette |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | Rainin | 17014391 | LTS Pipette |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | Rainin | 17014392 | LTS Pipette |
| Rack LTS 1000 mL – GPS-L1000S | Rainin | 17005088 | Blue Rack Sterile Tips |
| Rack LTS 250 mL – GPS-L250S | Rainin | 17005092 | Green Rack Sterile Tips |
| Rack LTS 20 mL – GPS-L10S | Rainin | 17005090 | Red Rack Sterile Tips |
| FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | N/A | Custom order |
| LSR II Cytometer | BD Biosciences | N/A | Custom order |
| Abca8a | Thermo Fisher Scientific | Mm00462440_m1 | Müller cells |
| Aldh1al | Thermo Fisher Scientific | Mm00657317_m1 | Müller cells |
| Aqp4 | Thermo Fisher Scientific | Mm00802131_m1 | Astrocytes |
| Calb2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00801461_m1 | Amacrine, Horizontal |
| Cd68 | Thermo Fisher Scientific | Mm03047340_m1 | Retinal Pigment Epithelial Cells |
| Gad2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00484623_m1 | Amacrine |
| Hprt | Thermo Fisher Scientific | Mm01545399_m1 | House keeping gene |
| Lhx1 | Thermo Fisher Scientific | Mm01297482_m1 | Horizontal |
| Lim2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00624623_m1 | Horizontal |
| Nrl | Thermo Fisher Scientific | Mm00476550_m1 | Photoreceptors |
| Ntrk1 | Thermo Fisher Scientific | Mm01219406_m1 | Horizontal |
| Pcp4 | Thermo Fisher Scientific | Mm00500973_m1 | Bipolar, Amacrine |
| Pou4f1 | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Prdx6 | Thermo Fisher Scientific | Mm00725435_s1 | Astrocytes |
| Prkca | Thermo Fisher Scientific | Mm00440858_m1 | Bipolar |
| Prox1 | Thermo Fisher Scientific | Mm00435969_m1 | Horizontal |
| Pvalb | Thermo Fisher Scientific | Mm00443100_m1 | Amacrine |
| Rbpms | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Rom1 | Thermo Fisher Scientific | Mm00436364_g1 | Photoreceptors |
| Rpe65 | Thermo Fisher Scientific | Mm00504133_m1 | Retinal Pigment Epithelial cells |
| Slc1a3 | Thermo Fisher Scientific | Mm00600697_m1 | Astrocytes |
| Slc6a9 | Thermo Fisher Scientific | Mm00433662_m1 | Amacrine |
| Sncg | Thermo Fisher Scientific | Mm00488345_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Tubb3 | Thermo Fisher Scientific | Mm00727586_s1 | Retinal Ganglion Cells |
| Vim | Thermo Fisher Scientific | Mm01333430_m1 | Müller cells |
| Taqman Universal Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4440047 | qPCR Reagent |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA Isolation |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | cDNA synthesis |
| Taqman PreAmp Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4391128 | Pre-Amplification step |
| BD Cytofix/ Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Fixation/ Permeabilization Buffer |
| BD Perm/ Wash | BD Biosciences | 554723 | Permeabilization Solution |
| RBPMS | Santa Cruz Biotechnology | sc-86815 | intracellular antibody |
| SNCG | Gene Tex | GTX110483 | intracellular antibody |
| BRN3A | Santa Cruz Biotechnology | sc-8429 | intracellular antibody |
| TUJ1 | BioLegend | 801202 | intracellular antibody |
References
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