Summary
Miljoner människor lider av retinal degenerativa sjukdomar som leder till irreversibel blindhet. Ett vanligt element i många av dessa sjukdomar är förlusten av retinala ganglionceller (RGC). Detta detaljerade protokoll beskriver isoleringen av primära murin RGC genom positivt och negativt urval med flödescytometri.
Abstract
Neurodegenerativa sjukdomar har ofta en förödande inverkan på de drabbade. Retinal ganglioncell (RGC) förlust är implicerad i en rad sjukdomar, inklusive diabetisk retinopati och glaukom, förutom normal åldrande. Trots deras betydelse har RGCs varit extremt svåra att studera hittills, delvis beroende på att de bara omfattar en liten andel av det stora antalet celler i näthinnan. Dessutom använder nuvarande isoleringsmetoder intracellulära markörer för att identifiera RGC, som producerar icke-levande celler. Dessa tekniker innefattar också långa isolationsprotokoll, så det finns brist på praktiska, standardiserade och pålitliga metoder för att erhålla och isolera RGC. Detta arbete beskriver en effektiv, omfattande och tillförlitlig metod för att isolera primära RGC från mus retinae med hjälp av ett protokoll baserat på både positiva och negativa urvalskriterier. De presenterade metoderna möjliggör den framtida studien av RGC, med målet att bättre förstå majorenMinskning av synskärpa som härrör från förlusten av funktionella RGC i neurodegenerativa sjukdomar.
Introduction
RGC är terminalt differentierade neuroner, och därför krävs primära celler för experiment. Utvecklingen av ett protokoll för isolering och berikning av primära murina retinala ganglionceller (RGC) är grundläggande för att avslöja mekanismerna för RGC-hälsa och degenerering in vitro . Detta är särskilt viktigt för studier som försöker generera potentiella terapier för att främja RGC-funktionen och för att minimera dödsfallet. Degenerationen av RGC är associerad med retinala degenerativa sjukdomar, såsom glaukom, diabetisk retinopati och normal åldrande. Även om de specifika cellulära mekanismer som ligger till grund för RGC-förlust är oklara, har en serie riskfaktorer identifierats. Mangel på syrebildning i det optiska nervhuvudet 1 , 2 , 3 orsakar RGC-död 4 och fungerar som störningen av homeostasen mellan aktiveringen av excitatoriska och iInhibitorer inom individuella RGC 5 , 6 . En rad utmaningar hindrar framsteg mot användningen av dessa celler för djupgående studier. För det första är antalet RGC närvarande i en murin retina liten. RGC: er svarar för mindre än 1% av de totala retinala cellerna 7 , 8 , 9 . För det andra är de flesta RGC-specifika markörer intracellulära proteiner 10 , 11 , 12 . Urval baserat på dessa markörer lämnar cellerna icke-genomförbara, vilket utesluter nedströms funktionella analyser. Slutligen är nu tillgängliga protokoll långa och saknar standardisering 13 , 14 . Tidiga RGC-isolationsprotokoll baserades på immunopanningsmetoder. Barres et al. 15 Anpassade den klassiska immunopenAnningsteknik och tillsatte ett andra steg som uteslutde monocyter och endotelceller från huvuddelen av retinala celler före positivt urval baserat på immunopositivitet mot anti-tymocytantigen (aka Thy1), en cellytmarkör. År senare, Hong et al. Kombinerade magnetiska pärlisoleringstekniker med cellsorteringsstrategier för att isolera RGC med högre renhet 16 . Användningen av magnetiska pärlor används fortfarande i många vetenskapliga tillämpningar. Tillsammans förbättrade magnetiska pärlor och flödescytometriprotokoll renheten hos isolerade celler. Emellertid har dessa reningssystem ännu inte standardiserats för isolering av murina RGC från dissocierad retinae.
Flödescytometri är en kraftfull analysmetod som mäter optiska och fluorescensegenskaper hos cellsuspensioner. Celler analyseras både kvantitativt och kvalitativt med en hög känslighetsnivå, vilket ger en mångdimensionell analys av cellföljenation. Celldiskriminering baseras på två huvudsakliga fysikaliska egenskaper: cellstorlek eller ytarea och granularitet eller intern komplexitet 17 . En mångdimensionell analys kan utföras genom att kombinera antikroppar märkta med fluorokrom som har liknande exciteringsvåglängder och olika utsläpp. Flödescytometri är snabb, reproducerbar och känslig. Multiteplaser tillåter ännu större multidimensionella analyser av enskilda celler genom flödescytometri. Det är således en attraktiv metod för studier av cytologiska prover. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) använder de multidimensionella fenotypiska skillnaderna identifierade med flödescytometri för att sortera enskilda celler i olika subpopuleringar.
Under det senaste decenniet har flera yt- och intracellulära proteiner identifierats som potentiella biomarkörer för valet av celler, inklusive neuroner. Initiala studier som försökte isolera RGC från råttor använde Thy1 som en ganglioncellL markör. Tyvärr har Thy1, aka CD90, flera isoformer i andra gnagarearter 18 , 19 , 20 och uttrycks av flera retinala celltyper 19 , 20 , vilket gör den till en icke-specifik markör för RGC. En annan ytmarkör, CD48, finns på monocytiska populationer i näthinnan, inklusive makrofager och microglia. Med användning av dessa två ytmarkörer utvecklades en modifierad RGC signatur-Thy1 + och CD48 negceller 15 , 16 , 21 , 22 . Tyvärr är dessa två urvalskriterier inte tillräckliga för att välja en mycket berikad RGC-population. För att hantera detta ouppfyllda behov utvecklades ett flödescytometriprotokoll 23 baserat på flera lager positiva och negativa urvalskriterier usiNg kända cellyta markörer för att berika och rena primära murin RGCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer som beskrivs i följande protokoll godkändes av Institutet för djurvård och användningskommitté (IACUC) vid University of Tennessee Health Science Center (UTHSC) och följde ARVO-uttalandena för användningen för användning Av Djur i Oftalmisk och Visionsforskning, utöver riktlinjerna för laboratoriedjurförsök (Institutet för laboratorie djurresurser, folkhälsopolitiken för humanvård och användning av laboratoriedjur).
1. Förberedelse av instrument, lösningar och media
Obs! All information om material, reagenser, verktyg och instrument som rapporteras i protokollet anges i materialet .
- Autoklavera alla dissektionsinstrument och förvara dem i ett sterilt område. Använd följande instrument: 4 standardpincetter (2 långa och 2 korta) och 2 saxar,Samt 2 tangar (1 lång och 1 kort) och 1 sax för dissektion; Behåll en extra uppsättning som backup.
- Förbered 100 ml steril PBS / 1% FBS-lösning för användning under tvättar, immunförlängningsförfaranden och cellsorteringssteg. Håll lösningen kyld vid 4 ° C.
Obs: Lägg inte natriumazid (NaN 3 ) i lösningen, eftersom det kan vara giftigt för levande celler.- Bered 100 ml PBS / 1% FBS med 99 ml PBS och 1 ml FBS.
- Förbered 100 ml sterilt neuralt cellmedium kompletterat med 3% FBS (se Materialetabell ) för användning som insamlings- och odlingsmedium. Håll cellodlingsmediet sterilt vid 4 ° C. Värm upp det till rumstemperatur (RT) före användning.
- Förbered 100 ml neuralt cellmedium kompletterat med 3% FBS med användning av 97 ml neuralt cellmedium och 3 ml FBS.
- Pre-chill-samlingsrör (15 ml rör) förbehandlade med 5 ml uppsamlingsmedium genom att placera tHem i en ishink. Använd endast polypropenrör för att förhindra att cellerna klistrar på rörytan.
- Placera 40 mm rätter, 70 μm nylonfiltrare, sprutor, pistlar för cellfilen och sterila polypropenrör i biosäkerhetskåpan. Sterilisera alla föremål före procedurerna och behåll dem på ett sterilt sätt under hela förfarandet.
Obs! Alla steg efter samlingen av retinae kommer att utföras i biosäkerhetskåpan.
2. Enukleation
Obs! Totalt 10 unga (5-7 veckor gamla) C57BL / 6J möss användes i detta experiment för att isolera 1,0 x 106 RGCs med fenotypen CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg .
- Euthanisera mössen med hjälp av CO 2 -inhalation följt av cervikal dislokation. Använd alltid en sekundär eutanasi-metod för att säkerställa att det dödade djuret är dött.
- Sätt in pincett under ögonlocket, grip den optiska nerven och dra upp; Globen kommer att vara enukleerad, med den optiska nerven intakt. Placera uppsamlade ögon i en injektionsflaska innehållande PBS och förvara injektionsflaskan på is tills nästa steg.
Obs! Varje personal kan utföra detta steg efter att ha fått lämplig utbildning från Laboratory Animal Care Unit (LACU).
3. Framställning av retinalcellssuspensionen
- Placera det uppsamlade ögat på basplattan i ett dissektionsmikroskop för att påbörja hornhinnedissektion. Utsöndra varje öga individuellt.
- Håll försiktigt klotet på optiska nervbasen med hjälp av pincett. För detta steg, använd en lonG och en kort standard tangent.
- Använd en 30-gängig skarp nål för att punktera hornhinnan för att vattenhuman ska kunna evakueras från ögat, vilket gör det lättare att hålla ögat med tången.
- Håll hornhinnan med tången och använd sax för att göra ett litet snitt i hornhinnan. Skölj försiktigt hornhinnan och sclera med hjälp av tången. När jordklotet skalas halvvägs, rulla näthinnan och linsen med hjälp av tången. Kassera hornhinnan, sclera och linsen.
Obs! Denna metod säkerställer att näthinnan helt lossnar från resten av ögat. - Placera näthinnan i en liten 40 mm petriskål innehållande PBS / 1% FBS.
Obs! Som ett alternativ till Petriskålen kan en cellkulturskål användas. Se till att alltid hålla näthinnan fuktig, som i fysiologiska förhållanden.- Tvätta varje näthinna tre gånger med färsk steril PBS / 1% FBS inom biosäkerhetskåpan.
- Placera upp till 12 retinae påEn steril 70 μm nylonfilter fuktad med PBS / 1% FBS. Med hjälp av bakre änden av en 10 ml spruta macereras försiktigt näthinnan med en cirkelrörelse för att lossna cellerna.
- Alternativt, använd en pestle för cellstimemerering eller använd enzymatisk digestion med en kombination av 15 IE / ml papain, 5 mM L-cystein och 200 U / ml DNas I i 15 minuter vid 37 ° C följt av inaktivering med PBS / 10% FBS.
Obs! Inga förändringar i procentsatsen av de återvunna cellerna observerades när enzymatisk digestion jämfördes med maceration med antingen bakre änden av sprutan eller stammen.
- Alternativt, använd en pestle för cellstimemerering eller använd enzymatisk digestion med en kombination av 15 IE / ml papain, 5 mM L-cystein och 200 U / ml DNas I i 15 minuter vid 37 ° C följt av inaktivering med PBS / 10% FBS.
- För att överföra de isolerade cellerna placerar du den sterila 70 μm nylonfiltret över polypropenuppsamlingsröret. Passera de uppsamlade cellerna genom silen med en P1000 pipett. Skölj silen ( steg 3.6 ) med PBS / 1% FBS för att släppa kvar resterande celler och överföra dem till uppsamlingsröret.
- Tillsätt PBS / 1% FBS till achEn slutlig volym på 1 ml per näthinna. Centrifugera cellsuspensionen i 7 minuter vid 200 xg och RT.
Obs: Cellpelleten kan vara för liten för att vara synlig beroende på antalet makarerade retinae (<6 retinae).- Kassera cellens supernatant och resuspendera cellpelleten i PBS / 1% FBS med ett förhållande av 1 ml per 5 retinae.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer.
- Rengör en glashemocytometer och täckglas med 70% alkohol. Vrid försiktigt röret som innehåller cellerna för att säkerställa att näthinnescellssuspensionen är jämnt fördelad. Placera 20 | il av 0,4% trypanblått i ett mikrocentrifugrör och blanda med 20 | il av cellsuspensionen.
- Blanda försiktigt och applicera 10 | il av 0,4% trypanblå / cellsuspensionsblandningen till hemocytometern, fyll på båda kamrarna; Kapillärverkan kommer att dra 0,4% trypanblå / cellsuspensionsblandningen under täckglaset. Använd ett mikroskop, räkna alla trypanblå-negativa celler; thiS nummer representerar levande celler.
- Bestäm cellens livskraft med följande formel: levande cellantal / totalt antal celler =% viabilitet.
Obs! Om cellernas bärbarhet är mindre än 95%, krävs användning av fluorescerande färgämne för diskriminering av cellleabilitet under FACS.
- Använd ett fluorescerande bärbarhetsfärg som inte är permeant för levande celler. Tvätta cellerna med PBS för att avlägsna eventuella spår av serum. Tillsätt 1 μL fluorescerande färgämne för diskriminering av celllevnadsförmåga per 5,0 x 106 celler i en 100 μl slutvolym. Inkubera vid RT i 15 minuter, skyddad från ljus. Tillsätt 10x volymen PBS / 1% FBS. Centrifugera i 5 minuter vid 200 xg och RT.
- Inkubera cell-suspensionen över natten vid 4 ° C, om så är nödvändigt. Om detta är gjort fyller du upp cellsuspensionsröret med neuralt cellmedium i stället för PBS / 1% FBS. Placera röret horisontellt och håll det vid 4 ° C.
4. Immunolabeling ReTinalceller
- Använd följande omvandling för att bestämma volymen antikropp per cellnummer: 2 | il antikropp per 5,0 x 10 ^ celler i en 100 | il volym.
- Tvätta cellerna och bibehålla dem i PBS / 1% FBS. Ta en liten alikvot av celler (5,0 x 10 6 celler) för att använda som en negativ kontroll (omärkt) vid tidpunkten för sorteringsinställningen.
Obs! Denna negativa kontroll är kritisk för korrekt kalibrering av cell sorteraren. - För att minimera den icke-specifika bindningen av antikroppar mot celler som uttrycker Fcγ-receptorerna II och III, tillsätt 1 ^ il av en anti-mus CD16 / 32-antikropp per 1,0 x 106 celler i en 50 | il slutlig volym med användning av PBS / 1% FBS. Inkubera i 10 minuter vid RT.
- Tillsätt antikroppscocktailen till provet och blanda försiktigt med pipettering. Inkubera i 30 minuter i en ishink. Se till att ishinken är täckt, eftersom ljus kan kompromissa med experimentet på grund av fotobildning av den märkta fluorophores.
- Förbered antikroppscocktailen med hjälp av följande fluorescensmärkta anti-musantikroppar: CD90.2 AF-700, CD48 PE-Cyanin7, CD15 PE och otagmärkt CD57.
Obs! För varje antikropp använd följande koncentrationer per 5,0 x 106 celler: CD90.2 AF700, 1 μg; CD48 PE-cyanin7, 0,4 μg; CD15 PE, 0,02 | ig; Och icke-märkt CD57, 0,4 μg.- Använd volymer enligt följande beräkningar (baserat på de kommersiellt tillgängliga antikropparna som anges i materialet ): totalt 5,0 x 107 celler som ska märkas; 2 | il per 5,0 x 10 ^ celler = 20 | il av varje antikropp; 4 olika antikroppar = 80 pi antikroppscocktail; Slutvolym = [(5,0 x 10 7 totalt celler) / 5,0 x 106 celler] x 100 = 1000 μL; 80 | il Abs + 50 | il anti-mus CD16 / 32 + 870 | il PBS / 1% FBS = 1000 μL.
Obs: Den här kombinationen gavOptimal kombination av fluorokrom för instrumentkonfigurationen. Följande parametrar sammanfattar utsläpp och excitering: AF-700, emission av 719 nm när den exciteras med en 638 nm röddiodlaser; PE-Cyanine7, emission av 767 nm när den exciteras med en 488 nm blå diodlaser; Och PE, emission av 575 nm när den exciteras med en 488 nm blå diodlaser.
- Använd volymer enligt följande beräkningar (baserat på de kommersiellt tillgängliga antikropparna som anges i materialet ): totalt 5,0 x 107 celler som ska märkas; 2 | il per 5,0 x 10 ^ celler = 20 | il av varje antikropp; 4 olika antikroppar = 80 pi antikroppscocktail; Slutvolym = [(5,0 x 10 7 totalt celler) / 5,0 x 106 celler] x 100 = 1000 μL; 80 | il Abs + 50 | il anti-mus CD16 / 32 + 870 | il PBS / 1% FBS = 1000 μL.
- Förbered antikroppscocktailen med hjälp av följande fluorescensmärkta anti-musantikroppar: CD90.2 AF-700, CD48 PE-Cyanin7, CD15 PE och otagmärkt CD57.
- Efter 30 min inkubering, ta volymen upp till 5 ml med PBS / 1% FBS. Tvätta proven genom att centrifugera dem i 7 minuter vid 200 xg och RT. Upprepa proceduren en gång för att ta bort all obundet antikropp.
- Tillsätt 2 μL sekundär antikropp (0,1 μg), som kommer att binda CD57 av 5,0 x 106 celler. Inkubera i 30 minuter i en ishink, som i steg 4.4 . Tvätta cellerna två gånger, som i steg 4.5 .
- Märka cellerna med sekundär antikropp om en icke-märkt primär antikropp användes i steg 4.4 .
Obs! Den andraAry antikropp av valet för denna konfiguration är listad i materialet ; Den har en emissionsvåglängd av 421 nm. Använd den med ett bandpassfilter på 450/50 nm när du är upphetsad med violettdiodlasern vid 405 nm. - Använd volymer enligt följande beräkningar (baserat på den kommersiellt tillgängliga antikroppen som anges i materialet ): 2 | il per 5,0 x 106 celler = 20 | il sekundär antikropp; Slutvolym = [(5,0 x 10 7 totala celler) / 5,0 x 106 celler] x 50 = 500 | il; 20 | il Abs + 480 | il PBS / 1% FBS = 500 | il.
- Märka cellerna med sekundär antikropp om en icke-märkt primär antikropp användes i steg 4.4 .
- Förvara de märkta cellerna i PBS / 1% FBS. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer; Använd en slutlig cellhaltskoncentration på 3,0 - 4,0 x 10 7 celler / ml.
Obs! Använd inte cellodlingsmedium för att späda cellerna eftersom fenolröd kan öka autofluorescensen och därigenom minska upplösningen mellan negatIve och positiva celler. Den slutliga cellkoncentrationen per volym beror mycket på volymflödeshastigheten för instrumentkonfigurationen. - Använd enfärgskontroller under installationen för att minimera fluorescensutsläpp.
Obs! Det här steget, även känt som kompensation, tillämpas för att korrigera bruset som skapas av kombinationen av fluoroforer. Polystyrenmikrosfärer i PBS / 0,1% BSA / 2 mM NaN3 med förmågan att binda fluorescensmärkta immunoglobulin (Ig) isotyper från flera arter ger positiva kontroller för att ställa in kompensationen.- Placera 3 droppar av polystyrenmikrosfärerna i sterila FACS-rör, tilldela en per fluorofor. Tillsätt 1 μg av respektive fluorofor till varje rör. Inkubera i 15 minuter vid RT, skyddad från ljus. Tillsätt 3 ml PBS / 1% FBS till provrören. Centrifugera i 5 minuter vid 200 xg och RT. Avlägsna försiktigt supernatanten och resuspendera i 250 | il PBS / 1% FBS.
- För att ställa in den negativa kontrOls, använd polystyrenmikrosfärer som inte binder till Ig. Utför detta steg dagen innan, om det behövs.
5. Cellsorteringsstrategi
Obs! Specifika instruktioner för instrumentuppsättning för FACS med 355 nm, UV; 405 nm, violett; 488 nm, blå; Och 640 nm, röda lasrar med respektive 2, 2, 5 och 3 fluorescenskanalfördelning. Operativprogramvaran var DIVA version 8.0.1. Cellsortering utfördes med ett 70 μm munstycke, 70 psi manteltryck, 87,5 frekvens, 48,6 amplitud med första droppbrytning vid 333, gapfördelning av 6, sort precision satt till fyrvägs renhet med standard (32) renhetsmask och droppe Fördröjning justerad till 42,98 med användning av pärlor.
- Använd 15 ml polypropenkoniska rör som uppsamlingskärl. Tillsätt 5 ml av uppsamlingsmediet (cellodlingsmedium) till varje rör och rotera röret för att belägga väggarna.
Obs! Det här steget hindrar att cellerna sticker till sidorna av tHan samlingsrör. Som ett alternativ kan röret beläggas med outspädd FBS. - Ta hänsyn till effektiviteten hos cell sorteraren för att uppskatta det slutliga utbytet av celler.
Obs! Effektiviteten hos sorten varierar beroende på den använda flödescytometern. RGC med CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg fenotyp omfattar ca 1% av alla retinala celler. - Har cellsortering utförd av en utbildad operatör (vanligtvis i en kärnanläggning). Kontrollera att instrumentet är rengjort och steriliserat med 70% etanol före provupptagning. Torka försiktigt utsidan av uppsamlingsrören med 70% etanol också.
- Om cellerna har sedimenterat eller aggregerat pipetterar cellerna upp och ner och filtrerar suspensionen genom en steril 40 μm nylonfilter före förvärv. Se till att du kontrollerar temperaturen och håller den vid 4 ° C medan cellsorteringen utförs. Misslyckande att göra det kommer att minska cellenJag ger.
- Diskutera detaljerna i sorten med cellsorteringsoperatören före utförandet av experimenten.
Obs! Vid experimentets gång kommer operatören av cell sortera att ha klickat på en serie knappar från arbetsytans verktygsfält i förvärvsprogrammet för cytometern. Det här är Browser , Cytometer , Inspector , Worksheet och Acquisition Dashboard . Strategin för cellsortering som används här är känd som en 2-vägssort. Två populationer samlas in: de berikade RGC och alla andra celltyper. Om ytterligare populationer ska samlas upp kan upp till två ytterligare populationer isoleras som en 4-vägs sortering. Om ytterligare populationer samlas in kräver cell sorteraren olika uppsamlingsrör och inställningar. - Utför kompensation för att korrigera för spektral överlappning från fluoroforerna.
Obs! Denna process kan göras manuellt genom att justeraIng varje inställning, eller det kan ske automatiskt som en del av den programvara som används. De flesta programvara för cell sorteringsutrustning har möjlighet till en automatisk kompensation. Det betraktas som guldstandarden och den mest exakta typen av ersättning. Det negativa (ingen fluorofor) provet och de enda kontrollerna framställda med poly-stermikrosfärer (kompensationspärlor) som tillverkats specifikt för att binda alla relevanta monoklonala antikroppar som användes i experimentet kommer att användas i detta steg.- Välj Experiment> Kompensationsinställningar> Skapa kompensationskontroller . Lägg till fluorofor-specifika kontroller från listan som visas på skärmen. Klicka på OK .
Obs! Ett kompensationsrör för var och en av kontrollerna visas.- Använd en omärkt kontroll (ingen fluoroför, steg 4.2 ) för att verifiera det framåtriktade ljuset (FSC), det sidospridande ljuset (SSC) och för att granska den ursprungliga populationen (P1).
- Installera det negativa kontrollröret på cytometern och klicka på Ladda. Verifiera att intressebolaget visas och välj det. Detta är population 1 (P1). Högerklicka på P1-porten och välj Apply to All Compensation Controls . Klicka på Spela in data . När inspelningen är klar klickar du på Lossa och ta bort röret.
- Installera nästa rör på cytometern, som visas på skärmen. Upprepa steg 5.6.2 tills alla data från kontrollerna har spelats in.
- Välj Experiment> Kompensationsinställningar> Beräkna ersättning . Spara inställningen och namnge experimentet. Klicka på Länka och spara .
Obs! Kompensation är ett nödvändigt steg, eftersom det avlägsnar spektrumöverlapp mellan detektorerna. - Om manuell kompensation behövs, gör så genom att justera de positiva signalerna så att de motsvarar negativen för eacH av de använda fluorokromerna.
Obs! Det här steget görs genom cell sorteringsoperationen och kan ta 30 minuter.
- Välj Experiment> Kompensationsinställningar> Skapa kompensationskontroller . Lägg till fluorofor-specifika kontroller från listan som visas på skärmen. Klicka på OK .
- Gating strategi ( Figur 3A ).
- Ställ in P1 genom att plotta FSC mot SSC; FSC indikerar storleken och SSC indikerar cellernas interna komplexitet. Se figur 3A .
- Rita en pseudocolor-plot av SSC-H (höjd) mot SSC-W (bredd) med användning av den valda populationen i steg 5.7.1 (Pl); Pseudocolor-plot möjliggör den visuella representationen av densiteten hos celler i förhållande till varandra.
Obs! En lägre celltäthet representeras av blå och grön, medan röda och orange områden representerar högcellstäthet.- Utför detta steg för att bara samla enskilda celler; Den enda cellgrinden heter P2. Se figur 3A .
- Upprepa steg 5.7.2 tillPlott FSC-H kontra FSC-W med användning av P2. Se till att valet av enskilda celler som "dubletter" eller cellklumpar innehåller både en positiv och en negativ markör, vilket ger falsk positivitet.
- Rita en pseudocolor plot av CD90.2 mot CD48. Välj alla CD90.2 + CD48 negceller för att eliminera monocyter från RGC-anrikningen; Ring denna grind CD90.2 + CD48 neg , eller P3. Se figur 3A .
- Använd den valda CD90.2 + CD48 negpopulationen eller P3-porten genom att dra en pseudocolorplot av CD57 mot CD15 för att eliminera amakrina cellföroreningar från RGC-anrikningen. Gate CD15 neg CD57 neg befolkningen. Se figur 3A .
- Definiera de populationer som ska samlas in för provet i fönstret "Sortera layout" och fortsätt med cellsorteringen. Provet att samla är CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg p>.
Obs! Den population som ska sorteras väljs från rullgardinsmenyn Lägg till i sorteringsfönstret. Efter att ha lagt till befolkningen kommer det att be om målhändelser eller hur många händelser som ska samlas in. Sorteringslayouten kan när som helst redigeras genom att klicka på fältet Sortera plats som innehåller befolkningen. 0,9% ± 0,3 av RGC med fenotypen CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg erhålls från unga (5-7 veckor gamla) och 0,5% ± 0,3 och gamla (> 12 månader gamla) C57BL / 6J möss 23 . - Använd 25 000 celler genom att utföra en renhetskontroll 23 . Se figur 3B- E.
Obs! Renhetskontrollen är processen att reanalysera de sorterade cellerna för att verifiera korrektheten hos cellsorten. En liten alikvot av sorterade celler laddas på cytometern för att verifiera effektiviteten hos sorten.
- Intracellulär märkning.
- Fixa sorterade celler i 1 h och permeabilisera vid 4 ° C för att göra cellerna metaboliskt inaktiva och för att möjliggöra penetrering av intracellulära antikroppar.
- Tillsätt följande antikroppar i permeabiliseringslösningen: anti-RNA-bindande protein med multipel skarvning (RBPMS) vid en 1: 100-spädning i en 100 | ig / ml stam; Anti-synuclein gamma (SNCG), 1: 100 i en 1 mg / ml stam; Hjärnspecifik homobox / POU-domänprotein 3A (BRN3A), 1: 100 i en 200 | ig / ml stam; Och anti-neuron-specifik klass III beta-tubulin (TUJ1), 1: 100 i en 1 mg / ml stam. Inkubera cellerna och antikroppslösningarna under 1 timme i en täckt ishink.
- Tvätta proverna två gånger med PBS / 1% FBS.
- Resuspendera cellerna i den lämpliga AF488-märkta sekundära antikroppen vid en 1: 200-spädning i 30 minuter i en ishink.
- Tvätta proverna som i steg 6.1.3. Håll cellerna iPBS / 1% FBS (250 μl) tills redo att analysera.
7. Validering av cellen Sortera genom qPCR-analys
Anm .: Se figur 4 .
- RNA-extraktion 23 .
- Extrahera RNA från 5,0 x 10 ^ sorterade celler genom celllys och homogenisering följt av tillsats av kloroform.
- Överför den övre, färglösa fasen till en ren mikrotub för alkoholutfällning följt av extraktkoncentration i en spinnkolonn. Utför DNAs-digestion på kolonnen.
- Tvätta kolonnen med RNas-fritt vatten för RNA-eluering.
- Bedöm RNA-koncentrationen genom spektrofotometri.
- CDNA-syntes och preamplifiering.
- Använd 100 ng RNA-material och blanda med en lösning innehållande omvänt transkriptasenzym, rekombinant ribonukleasinhibitor (för att undvika RNA-nedbrytning), magnesiumklorid (MgCL2) och deoxinukleotider.
- Blanda rörinnehållet och inkubera i 10 minuter vid 25 ° C följt av 60 minuter vid 42 ° C. Avsluta reaktionen med en 5-minuters inkubation vid 85 ° C. Förvara det resulterande cDNA vid -20 ° C tills det är färdigt att använda.
Anm .: cDNA-materialet kan lagras vid -20 ° C i upp till en månad om förförstärkningsteget inte kan utföras omedelbart.
- Förförstärkning av cDNA.
- Förförstärkande cDNA-material med användning av en serie primers specifika för flera retinala celltyper innefattande: retinala ganglionceller, amakrina celler, astrocyter, Müller, bipolära, horisontella, fotoreceptorer och retinalpigmentepitelceller, såsom beskrivs i Referens 23 och i tabellen Av material .
Anm .: Förförstärkningsreaktionen är beredd att öka känsligheten för detektion för kvantifiering. Pre-amplifieringsreaktionen innehåller en blandning av primernBlandar från materialet ; 2,5 | il av cDNA, som startade vid 100 ng RNA; Omvänt transkriptasenzym; Och nukleasfritt vatten i en slutlig volym av 10 | il. - Utför enzymaktiveringssteget vid 95 ° C i 10 minuter, följt av 14 cykler vid 95 ° C under 15 s, följt av 60 ° C i 4 min. Späd det förförstärkta materialet 1:10 i Tris EDTA-bufferten och håll det vid -20 ° C tills det är klart för användning.
- Förförstärkande cDNA-material med användning av en serie primers specifika för flera retinala celltyper innefattande: retinala ganglionceller, amakrina celler, astrocyter, Müller, bipolära, horisontella, fotoreceptorer och retinalpigmentepitelceller, såsom beskrivs i Referens 23 och i tabellen Av material .
- 7.4 qPCR-reaktion.
- Förbered alla qPCR-reaktioner i en 10 μl slutvolym med användning av det utspädda, förförstärkta cDNA (2,5 μl), primrar (listade i materialet ), nukleasfritt vatten och ett koncentrat med DNA-polymeras och deoxinukleotider.
- Använd följande instrumentförhållanden för att köra qPCR: ett hållsteg på 50 ° C under 2 min, följt av 95 ° C i 10 min. Kör totalt 40 cykler vid 95 ° C under 15 s följt av 60 ° C i 1 min. Utför alla mätningarEments i replikat av tre.
- Utför relativ kvantifiering med hjälp av komparativt tröskel (C T ) efter bestämning av värdena för C T för hushållsgenen och målgenerna i varje prov. Beräkna den relativa vikningsändringen (R q ) med följande ekvation: R q = 2 T- AC , där ΔC T = C T målgen - C T- referensgen 23 .
Anm: CT definieras som den PCR-cykel vid vilken fluorescenssignalen hos reporterfärgen korsar en godtyckligt placerad tröskel 26 . CT är omvänt relaterat till mängden amplicon (PCR-produkt) i reaktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den djupgående studien av RGCs hindras av många faktorer, inklusive deras låga frekvens och bristen på en robust och standardiserad metod för isolering. Figur 1 visar den metod som används för retinae-isolering. Variationer i enukleationsproceduren existerar baserat på typen av analys, såsom om enukleationen är en del av in vivo- experiment 27 . Enukleation i detta protokoll utförs på euthaniserade möss. Som visas i Figur 1A- B placeras tångar under ögat och dras upp för att orsaka minimal blödning och för att avlägsna en ögonklot med en intakt optisk nerv.
Skillnader finns i antalet RGC i olika musstammar, speciellt i genetiskt förändrade möss 23 , 28 ,Ef "> 29 , 30. Bevakning av dessa skillnader är viktigt vid bestämning av antalet möss som ska användas. Retinae från gamla C57BL / 6J möss har färre levande retinala celler än sina yngre motsvarigheter 23. Därför måste retinaldissektion noggrant utförs till Maximera cellutbytet. En steg-för-steg-procedur för retinaldissektion presenteras i Figur 1C- J . Retinala celler är sköra. Sålunda placeras dissekerade retinae i nylonstrimlare och macereras med antingen en bakre ände av en spruta, såsom Som visas i figur 2A eller med en pestle för cellstimulatorer. Maskering av celler direkt i cellsilen är snabb och reducerar cellklumpar. En representativ bild av cellsuspensionen illustreras i figur 2B . Flera inre retinala celler kan visualiseras. Vid denna tidpunkt har RGC: erna förlorat sin signatur morpholoGy på grund av axotomi under cellisolering och beredning av cellsuspensionen.
Det mest arbetsintensiva steget i denna metod är cellsorteringsinställningen. Denna fas är ett kritiskt steg under flerfärgade FACS, eftersom det maximerar signal-till-brusupplösningen. Figur 3A visar gatingstrategin som användes för isoleringen av RGC. Denna strategi riktar sig till avlägsnande av förorenande celler från cellsuspensionen, vilket innefattade monocyt-, glial-, amakrin- och fotoreceptorceller. Som en del av metoden bekräftades ytterligare ytmarkörer genom immunohistokemisk analys innan de användes som en del av uteslutningsstrategin. Tidigare data visade att en liten andel CD90.2 + celler är CD48 + . Uteslutning av dessa celler avlägsnades monocyter och möjligen microglia från retinae cell poolen. Det har tidigare visats att den klassiska Thy1 + CD48 neg 23 , eftersom dessa celler uttrycker gener associerade med amakrin, Müller, bipolär, horisontell fotoreceptor och retinalpigmentepitelceller ( Figur 4A ). Detta behandlas vidare genom att undersöka ytterligare markörer för cellutslagning. CD15 har beskrivits som en markör för amakrina och bipolära celler 31 , vilket föranleder dess användning som en ytterligare markör för negativt urval. Arbete från Uusitalo et al. 32 beskrev CD57 som en identifieringsmarkör för glialceller och fotoreceptorer. Därför tillsattes denna antikropp till cellsorteringsstrategin.
Därefter karakteriserades dessa celler för att validera metodiken för isolering av murina RGC. Fenotyperna för CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg- sorterade celler (<Stark klass = "xfig"> Figur 3B) utvärderades för uttrycket av följande intracellulära markörer associerade med RGCs 10 , 11 , 12 , 33 : SNCG, BRN3A, TUJ1 och RBPMS. Såsom visas i figur 3C uttryckte de sorterade cellerna alla fyra RGC-associerade intracellulära proteiner. Därefter användes bildningsflödescytometri i Figur 3D för att visa den intracellulära lokaliseringen av RBPMS och cellytaxpressionen av CD90.2. Dessa resultat testades i flera cytometersystem, vilket bekräftar reproducerbarheten och standardiseringen. Som visas i Figur 3E började några av de sorterade cellerna visa morfologin associerad med RGCs efter in vitro cellodling.
Slutligen, en jämförelse av celler före anrikning och post-ceLl-analys utfördes genom qPCR-analys. Jämförelse av Thy1 + CD48 neg- fenotypen till CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg- sorterade celler visade att Thy1 + CD48 neg- fenotypen uttrycker gener associerade med RGC, men också med andra retinala celler. Den högberikade sorterade cellpopulationen ( Figur 4B ) visade emellertid en multipel ökning i generna som kodar för de RGC-specifika intracellulära markörerna Sncg (SNCG), Pouf4l (BRN3A), Tubb3 (TUJ1) och Rbpms (RBPMS). Sammantaget validerade mRNA- och proteinbedömningarna metoden.
Figur 1 . Enukleations- och okulärdissektion för retinalisolering. Unga C57BL / 6J möss euthaniserades före tO avlägsnande av ögonblocket med CO 2 och cervikal dislokation. A) Placera tångar under ögat och dra upp ögat i en rörelse. B) Ögonet tas bort, inklusive optisk nerv. CJ) Steg-för-steg guide för att ta bort näthinnan. C) En punktering utförs med användning av en 30G nål före kornealavlägsnande för att tillåta vattenhuman att lämna ögat. D) Hörnan hålls med tång för att göra ett litet snitt. EF) Användningen av tångar möjliggör avskalning av hornhinnan, retinal pigmentepitel, choroid och sclera. Näthinnan lossas från sclera, rullas och avlägsnas. G) Linsen tas bort och kasseras. HJ) Den samlade retinaen placeras i en liten skål innehållande PBS / 1% FBS för att hålla dem fuktiga hela tiden. Vänligen klicka här för att se en större version av dettafigur.
Figur 2 . Retinalcell Suspension efter Maceration av Collected Retinae. Den samlade retinaen placeras i en liten skål för att isolera cellerna. A) Näthinnan placeras i en 70 μm nylonfilm och macereras med hjälp av bakre änden av en spruta. B) Representativ bild av cellsuspensionen, där separata retinala celler observeras. Skalan är 10 μm.
Figur 3 . Sortering av strategi för isolering av celler med CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57
Figur 4 . Pre- och post-sortering mRNA-analys. Thy1 + CD48 neg och sorterade celler med fenotypen CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg bedömdes genom qPCR-analys med användning av en panel med 25 gener uttryckta av retinala celler. Målgenenekspressionnivåer presenteras som en Log 2- fällig förändring med användning av Hprt som en hushållsgen och vatten som en negativ kontroll. Beräkningen gjordes baserat på ΔC T- metoden. Medel ± SEM; N = 3 biologiska replikat utfördes i triplikat. Siffror erhållna från tidigare publicerat arbete med tillstånd 23 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FACS är den valfria tekniken för att rena cellpopulationer. Andra isoleringsmetoder innefattar immunopanning, magnetiska pärlor och komplementfixeringsdepletion. Fördelen med FACS över dessa andra metoder är baserad på samtidig identifiering av cellytmarkörer med varierande intensitetsnivåer. Molekylens fluorescerande intensitet är proportionell mot mängden proteinuttryck. Hittills baserades isoleringen av RGC endast på Thy1 (CD90) positivitet och CD48 negativitet 15 , 16 , 22 , 34 , oberoende av vilken isoleringsmetod som användes. Det har nyligen visats att Thy1 + CD48 neg- fenotypen inte är tillräcklig för att isolera en homogen population av celler som uttrycker RGC-intracellulära markörer 23 . Identifiering av RGC-populationen är väsentlig för deras isolering, särskiltY eftersom de innefattar en liten procentandel av retinala celler 7 , 8 , 9 . Majoriteten av RGC är belägna i näthinnets innersta skikt, medan ett litet antal är belägna i de inre plexiforma skikten (förskjutna RGC 35 ). Sålunda blev spårning av RGC från överlägsen colliculi genom stereotaktiska injektioner och spårning med hydroxistillbamidin (ett retrograd spårämne för att beskriva neuroner) attraktiva val för många laboratorier 36 , 37 , 38 . Dessa system kräver injicering av spårämne, vilket, om det inte utförs ordentligt, kan leda till att vissa retinala områden lämnas ospända. Dessutom är de mer tekniskt krävande och, liksom andra metoder som immunopanning, är de långa. Immunopanning med anti-Thy1- och -CD48-antikropparna tar 48 timmar att slutföra och uppnår inte mer än 95% Renhet. Detta arbete beskriver en FACS-baserad metod som erbjuder ett snabbt och reproducerbart protokoll för att isolera en homogen population av levande RGC med CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg fenotypen, utan användning av några spårämnen, magnetiska pärlor eller immunopanningstekniker .
Följande faktorer krävs för att framgångsrik isolering av rena RGC: er ska utföras av FACS: 1) sorteringseffektivitet, vilket i hög grad beror på vilken utrustning som används; 2) optimal kombination av antikropp-märkta fluorokrom, för att minimera brus Och 3) cell sortering setup. Sorteringseffektiviteten beräknas genom att man tar upp antalet målhändelser som valts för sortering dividerat med antalet upptäckta målhändelser, uttryckt som en procentandel. Sorteringseffektiviteten är en beräkning som tillhandahålls av utrustningen. Denna effektivitet beror på inställningen av sorteringssystemet och cellsorteringsläget. Att välja en optimal kombination av fluorokrom är en komplex process. Varje influensaOrochrome har distinkta egenskaper och kännetecknas av dess excitations- och emissionsvåglängder. Medan excitationen läses med en laser, läses emissionen av fotomultiplikatorrör, vilka begränsas av de optiska filtren som finns i FACS-sorteringsutrustningen. Här tillhandahålls en kombination av antikropp-märkta fluorokrom PE, PE-Cyanine7, AF700 och BV421. Detta bestämdes efter övervägande av flera fluorokromkombinationer som gav den bästa upplösningen samtidigt som spektralöverlappning reducerades. Slutligen är sorteringsinstallationen kritisk. I allmänhet är retinala celler bräckliga. Således är det bäst att använda ett lägre tryck för att köra proverna, för att minimera stressen på cellerna. Det är kritiskt att behålla provet vid 4 ° C, eftersom det är möjligt att hålla murin RGC under längre perioder vid rumstemperatur, vilket kan reducera cellutbytet, speciellt vid sortering av stora antal celler.
FACS-baserad sortering är en ideell metod för isolering av celler som utgörs avRadera liten procentandel av cellsuspensionen. Processen, från retinal dissektion till slutförandet av cellsortering, tar ungefär 5 - 6 timmar jämfört med immunopanning och spårningssystem, vilket tar dagar att slutföra. Den multidimensionella analysen av FACS och förmågan hos utrustningen att samla flera levande populationer möjliggör ytterligare funktionella analyser av celler. Protokollet som beskrivs här är ett kraftfullt verktyg för isolering av primära murin RGC. Trots dess flera fördelar, inklusive dess känslighet, reproducerbarhet och den omedelbara identifieringen av livskraftiga celler, finns det vissa begränsningar. För det första krävs det dyr instrumentering och en välutbildad operatör. Vanligtvis är operatören en immunolog eller en högt utbildad individ i fältet, med vilken det är nödvändigt att träffas vid experimentet. Idag har akademiska faciliteter flera kärnanställningar, vilket kan underlätta utförandet av dessa typer av experiment. För det andra förlorar RGC sina tyPikal morfologi på grund av atoxomi, vilket gör dem väldigt små i storlek. Vid denna tidpunkt är det inte känt om några av deras gener kan moduleras på grund av atoxomi.
Metoden som presenteras här möjliggör nedströmsanalys av RGC-funktionen in vitro och är ett värdefullt verktyg som ska användas inom områdena visuell och hälsovetenskap. Att upprätthålla ganglioncellutgången i hjärnan krävs för visuell perception och är i riskzonen vid flera sjukdomar. Dessa celler kan användas för kontrollerat in vitro- experiment, både i friska och sjukdomsmodeller. Elektrofysiologiska, farmakologiska, biokemiska och molekylära studier kan utföras på dessa celler, vilket är idealiskt för utvecklingen av framtida terapeutiska mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Tim Higgins, Senior Illustrator från Institutionen för Mikrobiologi, Immunologi och Biochemistry, för teknisk videohjälp; Dr Matthew W. Wilson för diskussioner och medlemmarna av laboratorierna Jablonski och Morales-Tirado för deras hjälpsamma kommentarer. Detta arbete stöddes av Alcon Research Institute Young Investigator Award (VMM-T), University of Tennessee Research Foundation (VMM-T), National Eye Institute EY021200 (MMJ), Gerwin Fellowship (VMM-T); Gerwin Pre-doctoral fellowship (ZKG), Institutionen för försvarsmaktens medicinska forskning och materielkommando (VMM-T) och det obegränsade bidraget från forskning för att förebygga blindhet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse CD15 PE | BioLegend | 125606 | Clone MC-480 |
| Anti-mouse CD48 PE-Cy7 | BioLegend | 103424 | Clone HM48-1 |
| Anti-mouse CD57 | Sigma Aldrich | C6680-100TST | Clone VC1.1 |
| Anti-mouse CD90.2 AF700 | BioLegend | 105320 | Clone 30-H12 |
| Brilliant Violet 421 Goat Anti-mouse IgG | BioLegend | 405317 | Clone Poly4053 |
| Purified Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | FcgRII/III block, Clone 93 |
| Zombie Aqua | BioLegend | 423102 | Live cell/ Dead cell discrimination |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | U.S. origin |
| AbC Total Antibody Compensation Bead Kit | Thermo Fisher Scientific | A10497 | Multi-species Ig |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Add serum to media prior to culture. |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | Saline solution |
| Dissection Microscope | Olympus | SZ-PT Model | Stereo Microscope |
| Sorvall Centrifuge | Thermo Scientific | ST 16R | All centrifugation performed at RT |
| Base Plate – Dissection Pan | Fisher Scientific | SB15233FIM | A wax plate can also be used |
| Forceps | Aesculap | 5002-7 | 4 ½ inches |
| Iris Scissors, Straight | Aesculap | 1360 | 5 ½ inches |
| Falcon 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 352097 | Polypropylene tubes |
| Falcon 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 352098 | Polypropylene tubes |
| BD FACS Tubes | Fisher Scientific | 352003 | Polypropylene tubes |
| 40 mm dishes | MidSci | TP93040 | Tissue culture treated |
| 70 μm nylon strainer | MidSci | 70ICS | sterile |
| 40 μm nylon strainer | MidSci | 40ICS | sterile |
| BD 10 mL syringe | Fisher Scientific | 301604 | Disposable Syringe without needle |
| Pestles | MidSci | PEST | sterile |
| Wheaton Vials | Fisher Scientific | 986734 | No Liner |
| BD 30 G needle | Fisher Scientific | 305128 | 1 inch |
| Hausser Scientific Bright-Line Glass Counting Chamber | Fisher Scientific | 0267151B | Hemocytometer |
| Gibco Trypan blue 0.4% Solution | Fisher Scientific | 15250061 | Viability Dye |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | 1.5mL |
| EVOS Floid Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | 447113 | Fluorescence Imaging with a 20X objective |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-452 | Used to make 70% Ethanol |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | Rainin | 17014282 | LTS Pipette |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | Rainin | 17014391 | LTS Pipette |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | Rainin | 17014392 | LTS Pipette |
| Rack LTS 1000 mL – GPS-L1000S | Rainin | 17005088 | Blue Rack Sterile Tips |
| Rack LTS 250 mL – GPS-L250S | Rainin | 17005092 | Green Rack Sterile Tips |
| Rack LTS 20 mL – GPS-L10S | Rainin | 17005090 | Red Rack Sterile Tips |
| FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | N/A | Custom order |
| LSR II Cytometer | BD Biosciences | N/A | Custom order |
| Abca8a | Thermo Fisher Scientific | Mm00462440_m1 | Müller cells |
| Aldh1al | Thermo Fisher Scientific | Mm00657317_m1 | Müller cells |
| Aqp4 | Thermo Fisher Scientific | Mm00802131_m1 | Astrocytes |
| Calb2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00801461_m1 | Amacrine, Horizontal |
| Cd68 | Thermo Fisher Scientific | Mm03047340_m1 | Retinal Pigment Epithelial Cells |
| Gad2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00484623_m1 | Amacrine |
| Hprt | Thermo Fisher Scientific | Mm01545399_m1 | House keeping gene |
| Lhx1 | Thermo Fisher Scientific | Mm01297482_m1 | Horizontal |
| Lim2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00624623_m1 | Horizontal |
| Nrl | Thermo Fisher Scientific | Mm00476550_m1 | Photoreceptors |
| Ntrk1 | Thermo Fisher Scientific | Mm01219406_m1 | Horizontal |
| Pcp4 | Thermo Fisher Scientific | Mm00500973_m1 | Bipolar, Amacrine |
| Pou4f1 | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Prdx6 | Thermo Fisher Scientific | Mm00725435_s1 | Astrocytes |
| Prkca | Thermo Fisher Scientific | Mm00440858_m1 | Bipolar |
| Prox1 | Thermo Fisher Scientific | Mm00435969_m1 | Horizontal |
| Pvalb | Thermo Fisher Scientific | Mm00443100_m1 | Amacrine |
| Rbpms | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Rom1 | Thermo Fisher Scientific | Mm00436364_g1 | Photoreceptors |
| Rpe65 | Thermo Fisher Scientific | Mm00504133_m1 | Retinal Pigment Epithelial cells |
| Slc1a3 | Thermo Fisher Scientific | Mm00600697_m1 | Astrocytes |
| Slc6a9 | Thermo Fisher Scientific | Mm00433662_m1 | Amacrine |
| Sncg | Thermo Fisher Scientific | Mm00488345_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Tubb3 | Thermo Fisher Scientific | Mm00727586_s1 | Retinal Ganglion Cells |
| Vim | Thermo Fisher Scientific | Mm01333430_m1 | Müller cells |
| Taqman Universal Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4440047 | qPCR Reagent |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA Isolation |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | cDNA synthesis |
| Taqman PreAmp Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4391128 | Pre-Amplification step |
| BD Cytofix/ Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Fixation/ Permeabilization Buffer |
| BD Perm/ Wash | BD Biosciences | 554723 | Permeabilization Solution |
| RBPMS | Santa Cruz Biotechnology | sc-86815 | intracellular antibody |
| SNCG | Gene Tex | GTX110483 | intracellular antibody |
| BRN3A | Santa Cruz Biotechnology | sc-8429 | intracellular antibody |
| TUJ1 | BioLegend | 801202 | intracellular antibody |
References
- Flammer, J., Orgul, S. Optic nerve blood-flow abnormalities in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 17 (2), 267-289 (1998).
- Bathija, R. Optic nerve blood flow in glaucoma. Clin Exp Optom. 83 (3), 180-184 (2000).
- Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P. A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implication for the treatment of glaucoma. Br J Ophthalmol. 85 (10), 1252-1259 (2001).
- Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye (Lond). 18 (11), 1089-1095 (2004).
- Tian, N., Hwang, T. N., Copenhagen, D. R. Analysis of excitatory and inhibitory spontaneous synaptic activity in mouse retinal ganglion cells. J Neurophysiol. 80 (3), 1327-1340 (1998).
- Schmidt, K. G., Bergert, H., Funk, R. H. Neurodegenerative diseases of the retina and potential for protection and recovery. Curr Neuropharmacol. 6 (2), 164-178 (2008).
- Dreher, B., Sefton, A. J., Ni, S. Y., Nisbett, G. The morphology, number, distribution and central projections of Class I retinal ganglion cells in albino and hooded rats. Brain Behav Evol. 26 (1), 10-48 (1985).
- Williams, R. W., Strom, R. C., Rice, D. S., Goldowitz, D. Genetic and environmental control of variation in retinal ganglion cell number in mice. J Neurosci. 16 (22), 7193-7205 (1996).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Surgucheva, I., Weisman, A. D., Goldberg, J. L., Shnyra, A., Surguchov, A. Gamma-synuclein as a marker of retinal ganglion cells. Mol Vis. 14, 1540-1548 (2008).
- Nadal-Nicolas, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3860-3868 (2009).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Van Bergen, N. J., et al. Recharacterization of the RGC-5 retinal ganglion cell line. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (9), 4267-4272 (2009).
- Wood, J. P., Chidlow, G., Tran, T., Crowston, J. G., Casson, R. J. A comparison of differentiation protocols for RGC-5 cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (7), 3774-3783 (2010).
- Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1 (9), 791-803 (1998).
- Hong, S., Iizuka, Y., Kim, C. Y., Seong, G. J. Isolation of primary mouse retinal ganglion cells using immunopanning-magnetic separation. Mol Vis. 18, 2922-2930 (2012).
- Julius, R. S. The sensitivity of exponentials and other curves to their parameters. Comput Biomed Res. 5 (5), 473-478 (1972).
- Reif, A. E., Allen, J. M. The Akr Thymic Antigen and Its Distribution in Leukemias and Nervous Tissues. J Exp Med. 120, 413-433 (1964).
- Watanabe, M., Noguchi, T., Tsukada, Y. Regional, cellular, and subcellular distribution of Thy-1 antigen in rat nervous tissues. Neurochem Res. 6 (5), 507-519 (1981).
- Haeryfar, S. M., Hoskin, D. W. Thy-1: more than a mouse pan-T cell marker. J Immunol. 173 (6), 3581-3588 (2004).
- Sahagun, G., Moore, S. A., Fabry, Z., Schelper, R. L., Hart, M. N. Purification of murine endothelial cell cultures by flow cytometry using fluorescein-labeled griffonia simplicifolia agglutinin. Am J Pathol. 134 (6), 1227-1232 (1989).
- Shoge, K., et al. Rat retinal ganglion cells culture enriched with the magnetic cell sorter. Neurosci Lett. 259 (2), 111-114 (1999).
- Chintalapudi, S. R., et al. Isolation and Molecular Profiling of Primary Mouse Retinal Ganglion Cells: Comparison of Phenotypes from Healthy and Glaucomatous Retinas. Front Aging Neurosci. 8, 93 (2016).
- Nagdeve, N. G., Yaddanapudi, S., Pandav, S. S. The effect of different doses of ketamine on intraocular pressure in anesthetized children. J Pediatr Ophthalmol Strabismus. 43 (4), 219-223 (2006).
- Ding, C., Wang, P., Tian, N. Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model. Exp Eye Res. 92 (6), 512-520 (2011).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Aerts, J., Nys, J., Arckens, L. A highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening. J Vis Exp. (92), e51936 (2014).
- Li, X., et al. Loss of AP-2delta reduces retinal ganglion cell numbers and axonal projections to the superior colliculus. Mol Brain. 9 (1), 62 (2016).
- Moshiri, A., et al. Near complete loss of retinal ganglion cells in the math5/brn3b double knockout elicits severe reductions of other cell types during retinal development. Dev Biol. 316 (2), 214-227 (2008).
- Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (12), 5151-5162 (2003).
- Jakobs, T. C., Ben, Y., Masland, R. H. CD15 immunoreactive amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 465 (3), 361-371 (2003).
- Uusitalo, M., Schlotzer-Schrehardt, U., Kivela, T. Ultrastructural localization of the HNK-1 carbohydrate epitope to glial and neuronal cells of the human retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (3), 961-964 (2003).
- Jackson, C. J., Garbett, P. K., Nissen, B., Schrieber, L. Binding of human endothelium to Ulex europaeus I-coated Dynabeads: application to the isolation of microvascular endothelium. J Cell Sci. 96 ( Pt 2), 257-262 (1990).
- Pennartz, S., Perraut, M., Pfrieger, F. Purification of retinal ganglion cells from postnatal rats by magnetic cell sorting. MACSmore. 12 (2), 16-18 (2010).
- Nadal-Nicolas, F. M., et al. Displaced retinal ganglion cells in albino and pigmented rats. Front Neuroanat. 8, 99 (2014).
- Nadal-Nicolas, F. M., Salinas-Navarro, M., Vidal-Sanz, M., Agudo-Barriuso, M. Two methods to trace retinal ganglion cells with fluorogold: from the intact optic nerve or by stereotactic injection into the optic tract. Exp Eye Res. 131, 12-19 (2015).
- Barnstable, C. J., Drager, U. C. Thy-1 antigen: a ganglion cell specific marker in rodent retina. Neuroscience. 11 (4), 847-855 (1984).
- Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. (16), (2008).
