Summary
מיליוני אנשים סובלים ממחלות ניוונית של הרשתית הגורמות עיוורון בלתי הפיך. מרכיב נפוץ של רבים ממחלות אלה הוא אובדן תאי הגנגליון ברשתית (RGCs). פרוטוקול מפורט זה מתאר את הבידוד של RGCs Murine העיקרי על ידי בחירה חיובית ושלילית עם cytometry הזרימה.
Abstract
מחלות ניווניות לעיתים קרובות יש השפעה הרסניות על אלה שנפגעו. תא גנגליון התא (RGC) הפסד הוא מעורב במערך של מחלות, כולל רטינופתיה סוכרת וגלאוקומה, בנוסף להזדקנות נורמלית. למרות החשיבות שלהם, RGCs כבר מאוד קשה ללמוד עד עכשיו בין השאר בשל העובדה שהם מהווים רק אחוז קטן של מגוון רחב של תאים ברשתית. בנוסף, שיטות בידוד הנוכחי להשתמש סמנים תאיים כדי לזהות RGCs, אשר מייצרים תאים שאינם קיימא. טכניקות אלה כוללות גם פרוטוקולי בידוד ארוכים, ולכן יש חוסר שיטות מעשיות, סטנדרטי, אמין כדי להשיג ולבודד RGCs. עבודה זו מתארת שיטה יעילה, מקיפה ואמינה לבידוד RGCs ראשוניים מעכברים retinae באמצעות פרוטוקול המבוסס על קריטריונים לבחירה חיובית ושלילית. השיטות המוצגות מאפשרות את המחקר העתידי של RGCs, במטרה להבין טוב יותר את העיקרוןירידה בחדות הראייה הנובעת מאובדן RGCs תפקודית במחלות ניווניות.
Introduction
RGCs הם נוירונים מובחנים סופנית, ולכן, תאים ראשוניים נדרשים לצורך ניסויים. הפיתוח של פרוטוקול לבידוד והעשרה של תאים ראשוניים של תאית גנגליון Murine (RGCs) הוא היסוד לחשוף את המנגנונים של בריאות RGC וניוון במבחנה . זה חשוב במיוחד עבור מחקרים המבקשים ליצור טיפולים פוטנציאליים כדי לקדם את הפונקציה RGC כדי למזער את מותם. התנוונות של RGCs קשורה למחלות ניווניות של הרשתית, כגון גלאוקומה, רטינופתיה סוכרתית והזדקנות נורמלית. למרות שהמנגנונים הסלולריים הספציפיים שבבסיס אובדן RGC אינם ברורים, זוהתה סדרה של גורמי סיכון. חוסר חמצון בראש עצב הראייה 1 , 2 , 3 גורם מוות RGC 4 ופועל כהפרעה של הומאוסטזיס בין ההפעלה של exitatory ואניקולטנים nititory בתוך RGCs בודדים 5 , 6 . שורה של אתגרים מעכבים את ההתקדמות לקראת השימוש בתאים אלה ללימודים מעמיקים. ראשית, מספר RGCs הנוכחי ברשתית Murine הוא קטן. RGCs חשבון עבור פחות מ 1% מכלל תאים הרשתית 7 , 8 , 9 . שנית, רוב RGC ספציפיים סמנים הם תאיים חלבונים 10 , 11 , 12 . הבחירה מבוססת על סמנים אלה משאיר את התאים שאינם קיימא, אשר מונע ניתוח במורד הזרם. לבסוף, הפרוטוקולים הקיימים כיום הם ארוכים וחסרים סטנדרטיזציה 13 , 14 . מוקדם פרוטוקולים בידוד RGC התבססו על שיטות immunopanning. Barres et al. 15 התאימו את החסימה הקלאסיתטכניקה anning והוסיף צעד שני, אשר כלל מונוציטים ותאי האנדותל מהחלק הארי של תאים רשתית לפני הבחירה החיובית המבוססת על אימונוספיטיביות לאנטיגן אנטי תימוציטים (aka Thy1), סמן משטח התא. שנים לאחר מכן, הונג et al. בשילוב טכניקות בידוד מגנטי חרוז עם אסטרטגיות מיון תאים לבודד RGCs עם טוהר 16 . השימוש חרוזים מגנטיים עדיין בשימוש ביישומים מדעיים רבים. יחד, חרוזים מגנטיים ו cytometry זרימת פרוטוקולים שיפרה את הטוהר של תאים בודדים. עם זאת, מערכות טיהור אלה עדיין לא תוקנו לבידוד של RGCs Murine מ Retinae מנותק.
זרימת cytometry היא שיטה אנליטית חזקה המודד את המאפיינים אופטיים פלואורסצנטי של השעיות התא. תאים ניתוחים הן כמותית והן איכותית עם רמה גבוהה של רגישות, מתן ניתוח רב מימדי של התא populAtion. האפליה הסלולארית מתבססת על שני מאפיינים פיזיים עיקריים: גודל התא או שטח הפנים והפרשנות או המורכבות הפנימית 17 . ניתוח רב מימדי ניתן לבצע על ידי שילוב של נוגדנים מתוייגים עם fluorochromes כי יש אורכי גל דומים ו פליטות שונות. זרימת cytometry הוא מהיר, לשחזור, ורגיש. לייזרים multitpe היתר אפילו רב יותר מימדי מנתח של תאים בודדים על ידי cytometry הזרימה. לפיכך, זוהי מתודולוגיה אטרקטיבית לחקר דגימות ציטולוגיות. פלואורסצנטי מופעלת תא מיון (FACS) משתמשת הבדלים פנוטיפי רב מימדי מזוהים על ידי cytometry הזרימה למיין תאים בודדים לתוך subpopulations נפרד.
בעשור האחרון, משטח מרובה חלבונים תאיים זוהו כסמנים ביולוגיים פוטנציאליים עבור הבחירה של תאים, כולל נוירונים. מחקרים ראשוניים שביקשו לבודד RGCs של חולדות השתמשו Thy1 כמו cel גנגליוןסמן. למרבה הצער, Thy1, aka CD90, יש מספר איסופורמים במינים אחרים מכרסם 18 , 19 , 20 והוא בא לידי ביטוי על ידי מספר סוגי תאים ברשתית 19 , 20 , מה שהופך אותו סמן שאינו ספציפי עבור RGCs. סמן נוסף, CD48, נמצא על אוכלוסיות מונוציטיות ברשתית, כולל מקרופאגים ומיקרוגליאה. באמצעות שני אלה סמנים פני השטח, שונה RGC חתימה- Thy1 + ו CD48 Neg תאים - פותחה 15 , 16 , 21 , 22 . למרבה הצער, אלה שני קריטריונים לבחירה אינם מספיקים כדי לבחור עבור האוכלוסייה RGC מועשר מאוד. כדי לענות על צורך זה unmet, פרוטוקול cytometry זרימה פותחה 23 מבוסס על רב שכבתית בחירה חיובית ושלילית קריטריונים usiNg ידוע סמנים משטח התא כדי להעשיר ולטהר RGCs Murine העיקרי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוצדורות המפורטות בפרוטוקול הבא אושרו על ידי המועצה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדת (IACUC) סקירה מועצת המנהלים של אוניברסיטת טנסי למדעי הבריאות מרכז (UTHSC) ו בעקבות האגודה לחקר חזון ורפואת עיניים (ARVO) הצהרות לשימוש של בעלי חיים בחקר עיניים וחזון, בנוסף להנחיות ניסויים בבעלי חיים במעבדה (המכון למעבדות בעלי חיים, מדיניות שירותי בריאות הציבור בנושא טיפול הומאני ושימוש בחיות מעבדה).
1. הכנת מכשירים, פתרונות ומדיה
הערה: כל המידע על חומרים, ריאגנטים, כלים, מכשירים המדווחים בפרוטוקול המפורטים בטבלה של חומרים .
- החיטוי כל כלי לנתיחה ולאחסן אותם באזור סטרילי. השתמש בכלים הבאים: 4 מלקחיים סטנדרטיים (2 אורך ו 2 קצר) ו 2 מספריים,כמו גם 2 מלקחיים (1 ארוך 1 קצר) 1 מספריים לנתיחה; לשמור קבוצה נוספת כגיבוי.
- הכן 100 מ"ל של תמיסת PBS סטרילית / 1% FBS להשתמש במהלך שוטף, נהלים immunolabeling, ואת התא מיון השלבים. שמור על פתרון צונן על 4 מעלות צלזיוס.
הערה: אל תוסיף Azide נתרן (NaN 3 ) לפתרון, כפי שהוא יכול להיות רעיל לתאים חיים.- הכן 100 מ"ל של PBS / 1% FBS עם 99 מ"ל של PBS ו 1 מ"ל של FBS.
- הכן 100 מ"ל של המדיום העצבתי סטרילי סטרילי בתוספת 3% FBS (ראה טבלה של חומרים ) לשימוש כאוסף אוסף תרבות. שמור על התרבות התא סטרילי בינוני ב 4 מעלות צלזיוס. רק לחמם אותו לטמפרטורת החדר (RT) לפני השימוש.
- הכן 100 מ"ל של המדיום תא עצביים בתוספת 3% FBS באמצעות 97 מ"ל של המדיום התא עצביים 3 מ"ל של FBS.
- טרום צינון צינורות אוסף (15-צינורות מ"ל) מראש מצופה 5 מ"ל של המדיום אוסף ידי הנחת tשולי בדלי קרח. השתמש רק צינורות פוליפרופילן כדי למנוע את התאים מן היצמדות אל פני השטח של הצינור.
- מקום 40 מ"מ מנות, 70-מיקרומטר ניילון strainers, מזרקים, העלי עבור מסננת התא, צינורות פוליפרופילן סטרילית בארון biosafety. לעקר את כל הפריטים לפני ההליכים ולשמור אותם בצורה סטרילית לאורך כל ההליכים.
הערה: כל השלבים לאחר איסוף של הרשתית תתבצע בארון biosafety.
2. Anucleation
הערה: סך של 10 צעירים (5-7 שבועות) C57BL / 6J עכברים שימשו בניסוי זה כדי לבודד 1.0 x 10 6 RGCs עם CD90.2 CD +
- להרדים את העכברים באמצעות שאיפה CO 2 ואחריו נקע צוואר הרחם. תמיד להשתמש בשיטת המתת חסד משנית כדי להבטיח כי החיה מורדמים הוא מת.
- הכנס מלקחיים מתחת לגלובוס של העין, לאחוז בעצב אופטי, למשוך למעלה; הגלובוס יהיה enucleated, עם העצב אופטי שלם. מקום שנאספו העיניים בקבוקון המכיל PBS ולשמור את הבקבוקון על הקרח עד השלב הבא.
הערה: כל אדם יכול לבצע את שלב זה לאחר קבלת הכשרה מתאימה מן המעבדה טיפול בבעלי חיים (LACU).
3. הכנה של השערת תא הרשתית
- מניחים את העין שנאספו על צלחת הבסיס של מיקרוסקופ לנתיחה להתחיל לנתיחה הקרנית. לנתח כל עין בנפרד.
- בזהירות להחזיק את הגלובוס על בסיס עצב הראייה באמצעות מלקחיים. עבור שלב זה, השתמש אחד lonG, ו מלקחיים סטנדרטי קצר אחד.
- השתמש 30-מד (30G) מחט חדה לנקב את הקרנית כדי לאפשר הומור מימית לפנות מן העין, מה שהופך אותו קל יותר להחזיק את העין עם מלקחיים.
- החזק את הקרנית עם מלקחיים להשתמש במספריים לעשות חתך קטן הקרנית. בעדינות לקלף את הקרנית ואת sclera באמצעות מלקחיים. כאשר העולם הוא קילוף באמצע הדרך, לגלגל את הרשתית ואת העדשה החוצה באמצעות מלקחיים. מחק את הקרנית, סקלרה, ואת העדשה.
הערה: שיטה זו מבטיחה הרשתית לחלוטין מנותקת משאר העין. - מניחים את הרשתית בתוך צלחת פטרי 40 מ"מ קטן המכיל PBS / 1% FBS.
הערה: כחלופה לצלחת פטרי, צלחת תרבות התא יכול לשמש. הקפד תמיד לשמור על הרשתית לח, כמו בתנאים פיזיולוגיים.- לשטוף כל הרשתית שלוש פעמים עם טרי סטרילי PBS / 1% FBS בתוך ארון biosafety.
- מקום עד 12 retinae בסטרילית 70-מיקרומטר ניילון מסננת לחה עם PBS / 1% FBS. באמצעות back-end של מזרק 10 מ"ל, בעדינות לקרוע את הרשתית באמצעות תנועה מעגלית לנתק את התאים.
- לחלופין, השתמש העלי עבור מסננת מסירציה או להשתמש בעיכול אנזימטי עם שילוב של 15 IU / מ"ל papain, 5 מ"מ L- ציסטאין, ו 200 U / מ"ל DNase אני במשך 15 דקות ב 37 ° C, ואחריו אי פעילות עם PBS / 10% FBS.
הערה: לא נצפו שינויים באחוז התאים שנמצאו, כאשר העיכול האנזימטי הושווה למציצה עם הקצה האחורי של המזרק או העלי.
- לחלופין, השתמש העלי עבור מסננת מסירציה או להשתמש בעיכול אנזימטי עם שילוב של 15 IU / מ"ל papain, 5 מ"מ L- ציסטאין, ו 200 U / מ"ל DNase אני במשך 15 דקות ב 37 ° C, ואחריו אי פעילות עם PBS / 10% FBS.
- כדי להעביר את התאים מבודדים, במקום סטרילית 70-מיקרומטר מסננת ניילון מעל צינור איסוף פוליפרופילן. להעביר את התאים שנאספו באמצעות מסננת באמצעות פיפטה P1000. שוטפים את מסננת ( שלב 3.6 ) עם PBS / 1% FBS לשחרר את כל התאים הנותרים ולהעביר אותם אל צינור איסוף.
- הוסף PBS / 1% FBS כדי achIeve נפח סופי של 1 מ"ל לכל הרשתית. צנטריפוגה ההשעיה התא 7 דקות ב 200 xg ו RT.
הערה: בהתאם למספר reterne retroe (<6 retinae), גלולה התא עשוי להיות קטן מדי כדי להיות גלוי.- מחק supernatant התא resuspend תא גלולה ב PBS / 1% FBS באמצעות יחס של 1 מ"ל לכל 5 retinae.
- ספירת התאים באמצעות hemocytometer.
- נקי hemocytometer זכוכית coverslip עם אלכוהול 70%. מערבולת בעדינות את הצינור המכיל את התאים כדי להבטיח כי ההשעיה תא הרשתית מופץ באופן שווה. מקום 20 μL של 0.4% trypan כחול בצינור microcentrifuge ומערבבים עם 20 μL ההשעיה התא.
- מערבבים בעדינות וליישם 10 μL של 0.4% trypan כחול / תערובת ההשעיה התא כדי hemocytometer, מילוי שני החדרים; פעולה נימית ימשוך 0.4% trypan כחול / תערובת ההשעיה תא תחת coverslip. באמצעות מיקרוסקופ, לספור את כל התאים trypan כחול שלילי; ThiS מייצג את התאים החיים.
- קביעת כדאיות התא באמצעות הנוסחה הבאה: ספירת תאים חיים / ספירת תאים סה"כ =% כדאיות.
הערה: אם הכדאיות של התאים הוא פחות מ 95%, השימוש בצבע פלואורסצנטי עבור אפל הכדאיות התא נדרש במהלך FACS.
- השתמש צבע חיוניות פלואורסצנטי כי הוא לא חדיר לתאים חיים. שטפו את התאים עם PBS כדי להסיר כל עקבות של נסיוב. הוסף 1 μL של צבע פלואורסצנטי עבור אפליית התא הכדאיות לכל 5.0 x 10 6 תאים בנפח סופי 100 μL. דגירה ב RT במשך 15 דקות, מוגן מפני האור. הוסף 10x את עוצמת הקול של PBS / 1% FBS. צנטריפוגה 5 דקות ב 200 xg ו RT.
- דגירה ההשעיה תא לילה ב 4 ° C, במידת הצורך. אם זה נעשה, למלא את הצינור ההשעיה תא עם בינוני תאים עצביים ולא PBS / 1% FBS. מניחים את הצינור אופקית ולשמור אותו 4 מעלות צלזיוס.
4. Immunolabeling Reתאים
- השתמש בהמרה הבאה כדי לקבוע את עוצמת הקול של נוגדנים לכל מספר תאים: 2 μL של נוגדנים לכל 5.0 x 10 6 תאים בנפח 100 μL.
- לשטוף את התאים ולשמור אותם PBS / 1% FBS. קח aliquot קטן של תאים (5.0 x 10 6 תאים) להשתמש כביקורת שלילית (ללא תווית) בזמן ההתקנה של המיון.
הערה: שליטה שלילית זו היא קריטית לכיול הנכון של סדרן התא. - כדי למזער את מחייב הלא ספציפי של נוגדנים לתאים המבטאים את הקולטנים Fcγ II ו- III, להוסיף 1 μL של נוגדן CD16 / 32 נגד העכבר לכל 1.0 x 10 6 תאים בנפח סופי 50 μL באמצעות PBS / 1% FBS. דגירה של 10 דקות ב RT.
- מוסיפים את הקוקטייל נוגדן למדגם ומערבבים בעדינות על ידי pipetting. דגירה במשך 30 דקות בתוך דלי קרח. ודא כי דלי הקרח מכוסה, כמו האור יכול לסכן את הניסוי בשל photobleaching של פלואור מתויגPhores.
- הכן את קוקטייל נוגדנים באמצעות fluorescently מתוייגים נוגדי עכברים מתויגים: CD90.2 AF-700, CD48 PE-Cyanine7, CD15 PE, ו- CD57 מתויג.
הערה: עבור כל נוגדנים, השתמש בריכוז הבא לכל 5.0 x 10 6 תאים: CD90.2 AF700, 1 מיקרוגרם; CD48 PE-Cyanine7, 0.4 מיקרוגרם; CD15 PE, 0.02 מיקרוגרם; ו-מתויג CD57, 0.4 מיקרוגרם.- השתמש כרכים לפי החישובים הבאים (על בסיס נוגדנים זמינים מסחרית המפורטים בטבלה של חומרים ): סך של 5.0 x 10 7 תאים להיות מתויג; 2 μL לכל 5.0 x 10 6 תאים = 20 μL של נוגדן כל; 4 נוגדנים שונים = 80 μL של קוקטייל נוגדן; נפח סופי = [(5.0 x 10 7 תאים סה"כ) /5.0 x 10 6 תאים] x 100 = 1000 μL; 80 μL Abs + 50 μL של CD נגד העכבר CD16 / 32 + 870 μL PBS / 1% FBS = 1000 μL.
הערה: שילוב זה סיפק אתשילוב אופטימלי של fluorochromes עבור תצורת המכשיר. הפרמטרים הבאים מסכמים את הפליטה ואת עירור: AF-700, פליטה של 719 ננומטר כאשר מתרגש עם לייזר דיודה אדום 638 ננומטר; PE-Cyanine7, פליטה של 767 ננומטר כאשר מתרגש עם 488 ננומטר לייזר כחול דיודה; ו PE, פליטה של 575 ננומטר כאשר מתרגש עם לייזר 488 ננומטר כחול דיודה.
- השתמש כרכים לפי החישובים הבאים (על בסיס נוגדנים זמינים מסחרית המפורטים בטבלה של חומרים ): סך של 5.0 x 10 7 תאים להיות מתויג; 2 μL לכל 5.0 x 10 6 תאים = 20 μL של נוגדן כל; 4 נוגדנים שונים = 80 μL של קוקטייל נוגדן; נפח סופי = [(5.0 x 10 7 תאים סה"כ) /5.0 x 10 6 תאים] x 100 = 1000 μL; 80 μL Abs + 50 μL של CD נגד העכבר CD16 / 32 + 870 μL PBS / 1% FBS = 1000 μL.
- הכן את קוקטייל נוגדנים באמצעות fluorescently מתוייגים נוגדי עכברים מתויגים: CD90.2 AF-700, CD48 PE-Cyanine7, CD15 PE, ו- CD57 מתויג.
- לאחר הדגירה 30 דקות, להביא נפח של עד 5 מ"ל באמצעות PBS / 1% FBS. שטפו את הדגימות על ידי centrifuging אותם במשך 7 דקות ב 200 xg ו RT. חזור על הנוהל פעם אחת כדי להסיר את כל הנוגדן unbound.
- הוסף 2 μL של נוגדן משני (0.1 מיקרוגרם), אשר יחייב את CD57 של 5.0 x 10 6 תאים. דגירה במשך 30 דקות בתוך דלי קרח, כמו בשלב 4.4 . שטפו את התאים פעמיים, כמו בשלב 4.5 .
- תווית התאים עם נוגדנים משני אם נוגדנים ראשוני לא מתויג שימש בשלב 4.4 .
הערה: השנינוגדן של בחירה עבור תצורה זו מופיע בטבלה של חומרים ; יש לו אורך גל פליטה של 421 ננומטר. השתמש בו עם מסנן bandpass של ננומטר 450/50 כאשר מתרגש עם לייזר דיודה סגול ב 405 ננומטר. - השתמש כרכים לפי החישובים הבאים (על בסיס נוגדן זמין מסחרית המפורטים בטבלה של חומרים ): 2 μL לכל 5.0 x 10 6 תאים = 20 μL של נוגדנים משני; נפח סופי = [(5.0 x 10 7 תאים סה"כ) /5.0 x 10 6 תאים] x 50 = 500 μL; 20 μL של ABS + 480 μL PBS / 1% FBS = 500 μL.
- תווית התאים עם נוגדנים משני אם נוגדנים ראשוני לא מתויג שימש בשלב 4.4 .
- שמור את התאים שכותרתו PBS / 1% FBS. ספירת התאים באמצעות hemocytometer; להשתמש ריכוז התא הרשתית הסופי של 3.0 - 4.0 x 10 7 תאים / מ"ל.
הערה: אין להשתמש במדיום תרבית בינוני לדלל את התאים כי אדום פנול יכול להגדיל את autofluorescence, ובכך להפחית את הרזולוציה בין negatIve ותאים חיוביים. ריכוז התא הסופי לכל נפח מאוד תלוי בקצב הזרימה של קצב תצורת המכשיר. - השתמש בבקרות צבע יחיד במהלך ההתקנה כדי למזער את הזרימה הקרינה.
הערה: צעד זה, הידוע גם בשם פיצוי, מוחל על תיקון הרעש שנוצר על ידי שילוב של fluorophores. פוליסטירן microspheres ב PBS / 0.1% BSA / 2 מ"מ NaN 3 עם היכולת לאגד אימונוגלובולינים מתויגים fluorescently (Ig) isotypes ממספר מינים לספק שולטת חיובית לקבוע את הפיצוי.- מקום 3 טיפות של microspheres פוליסטירן צינורות FACS סטרילי, להקצות אחד לכל fluorophore. הוסף 1 מיקרוגרם של fluorophore בהתאמה לכל צינור. דגירה במשך 15 דקות ב RT, מוגן מפני האור. הוסף 3 מ"ל של PBS / 1% FBS על צינורות מדגם. צנטריפוגה 5 דקות ב 200 xg ו RT. בזהירות להסיר את supernatant ו resuspend μL 250 של PBS / 1% FBS.
- כדי להגדיר את contr השליליOls, להשתמש פוליסטירן microspheres כי לא להיקשר Ig. בצע את הצעד הזה יום קודם לכן, במידת הצורך.
5. תא מיון אסטרטגיה
הערה: הוראות ספציפיות להגדרת מכשיר עבור FACS עם 355 ננומטר, UV; 405 ננומטר, סגול; 488 ננומטר, כחול; ו 640 ננומטר, לייזרים אדומים עם 2, 2, 5, ו 3 הפצה ערוץ הקרינה, בהתאמה. תוכנת ההפעלה הייתה DIVA גרסה 8.0.1. מיון תאים בוצע עם זרבובית 70 מיקרומטר, 70 psi הלחץ נדן, 87.5 תדר, 48.6 משרעת עם הפסקה הראשונה ירידה ב 333, אבחנה ההפרש של 6, דיוק מיון להגדיר טוהר ארבע דרך עם ברירת מחדל (32) מסכת טוהר, ושחרור עיכוב מותאם ל 42.98 באמצעות חרוזים.
- השתמש 15 מ"ל צינורות פוליפרופילן חרוטי כמו כלי איסוף. הוסף 5 מ"ל של המדיום אוסף (בינוני תרבות התא) לכל צינור ולסובב את הצינור כדי לקשט את הקירות.
הערה: צעד זה מונע את התאים דבק לצדדים של tהוא צינור. כחלופה, צינור יכול להיות מצופה FBS מזוקק. - קח בחשבון את היעילות של סדרן התא להעריך את התשואה הסופית של תאים.
הערה: היעילות של המיון משתנה על בסיס cytometer זרימת בשימוש. RGCs עם CD90.2 + CD48 Neg CD15 Neg CD57 שלבים פנוטיפ מהווים כ 1% מכלל התאים ברשתית. - יש את מיון התא מבוצע על ידי מפעיל מאומן (בדרך כלל במתקן הליבה). ודא כי המכשיר הוא ניקה ו מעוקרים עם אתנול 70% לפני רכישת מדגם. בזהירות לנגב את החיצוני של צינורות איסוף עם אתנול 70% גם כן.
- אם התאים התיישבו או מצטברים, פיפטה התאים למעלה ולמטה ולסנן את ההשעיה באמצעות מסננת סטרילית 40 מיקרומטר סטרילי לפני הרכישה. הקפד לשלוט על הטמפרטורה ולשמור אותו על 4 מעלות צלזיוס בזמן מיון התא מתבצעת; כשל לעשות זאת תפחית את celאני מניב.
- לדון את הפרטים של המיון עם מפעיל סדרן התא לפני ביצוע הניסויים.
הערה: בזמן הניסוי, מפעיל סדרן התא ילחץ על שורה של לחצנים מסרגל הכלים של סביבת העבודה של תוכנת הרכישה עבור הציטומטר. אלה הם דפדפן , Cytometer , מפקח , גליון עבודה , רכישת לוח המחוונים . האסטרטגיה של מיון תאים בשימוש כאן ידוע בתור מיון דו סטרי. שתי אוכלוסיות נאספות: RGCs מועשר וכל סוגי תאים אחרים. אם יש לאסוף אוכלוסיות נוספות, ניתן לבודד עד שתי אוכלוסיות נוספות כאחת. אם אוכלוסיות נוספות ייאספו, סדרן התא דורש אוסף צינורות שונים ההתקנה. - לבצע פיצוי לתקן חפיפה רפאים מן fluorophores.
הערה: ניתן לבצע תהליך זה באופן ידני באמצעות כוונוןIng כל הגדרה, או שזה יכול להיעשות באופן אוטומטי כחלק התוכנה בשימוש. רוב התוכנה עבור התא מיון ציוד יש אפשרות של פיצוי אוטומטי. זה נחשב תקן הזהב ואת סוג המדויק ביותר של פיצוי. מדגם שלילי (ללא fluorophore) ואת הפקדים יחיד מוכן עם polysterene microspheres (פיצוי חרוזים) המיוצרים במיוחד כדי לכבול את כל נוגדנים חד שבטיים הרלוונטיים המשמשים את הניסוי ישמש בשלב זה.- בחר ניסוי> הגדרת פיצויים> יצירת בקרי פיצויים . הוסף את הפקדים הספציפיים ל- fluorophore מהרשימה המוצגת במסך. לחץ על אישור .
הערה: צינור פיצוי לכל אחד מהבקרות יוצג.- השתמש בפקד ללא תווית (ללא fluorophore, שלב 4.2 ) כדי לאמת את האור מפוזר קדימה (FSC), את האור מפוזרים בצד (SSC), ואת השער האוכלוסייה הראשונית (P1).
- התקן את הצינור שליטה שלילית על cytometer ולחץ על טען. ודא שאוכלוסיית העניין מוצגת ולבחור אותה. זוהי אוכלוסייה 1 (P1). לחץ לחיצה ימנית על שער P1 ובחר Apply אל All Compensation Controls . לחץ על נתוני שיא . לאחר ההקלטה, לחץ על בטל והסר את הצינור.
- התקן את הצינור הבא על הציטומטר, כפי שמוצג על המסך. חזור על שלב 5.6.2 עד שכל נתוני הבקרות נרשמו.
- בחר ניסוי> הגדרת פיצויים> חישוב פיצויים . שמור את ההגדרה ואת שם הניסוי. לחץ על קישור ושמור .
הערה: פיצוי הוא צעד הכרחי, שכן הוא מסיר את החפיפה בין הספקטרום בין הגלאים. - אם נדרש פיצוי ידני, לעשות זאת על ידי התאמת האמצעים של האותות החיוביים כך שהם שווים את הנגטיבים עבור eacשעה של fluorochromes בשימוש.
הערה: שלב זה נעשה על ידי המבצע סדרן התא עשוי לקחת 30 דקות.
- בחר ניסוי> הגדרת פיצויים> יצירת בקרי פיצויים . הוסף את הפקדים הספציפיים ל- fluorophore מהרשימה המוצגת במסך. לחץ על אישור .
- Gating אסטרטגיה ( איור 3 א ).
- הגדרת P1 על ידי זומם FSC לעומת SSC; ה- FSC מעיד על הגודל וה- SSC מציין את המורכבות הפנימית של התאים. ראה איור 3 א .
- ציור חלקה pseudocolor של SSC-H (גובה) לעומת SSC-W (רוחב) באמצעות האוכלוסייה הנבחרת בשלב 5.7.1 (P1); העלילה pseudocolor מאפשר ייצוג חזותי של צפיפות תאים יחסית אחד לשני.
הערה: צפיפות תאים נמוכה מיוצגת על ידי כחול וירוק, ואילו אזורים אדומים וכתומים מייצגים צפיפות תאים גבוהה.- בצע שלב זה כדי לאסוף תאים בודדים בלבד; שער תא בודד נקרא P2. ראה איור 3 א .
- חזור על שלב 5.7.2 אלהעלילה FSC-H לעומת FSC-W באמצעות P2. ודא כי הבחירה של תאים בודדים כמו "זוגות" או גושי התא מכיל גם סימן חיובי שלילי, מתן חיוביות שקר.
- צייר חלק pseudocolor של CD90.2 לעומת CD48. בחר את כל התאים CD90.2 + CD48 Neg לחסל מונוציטים מעשרת RGC; התקשר לשער CD90.2 + CD48 שלילי , או P3. ראה איור 3 א .
- באמצעות CD90.2 + CD48 הנבחר האוכלוסייה או שער P3, לצייר חלק pseudocolor של CD57 לעומת CD15 לחסל מזהמים תא Amacrine מן העשרת RGC. שער CD15 Neg CD57 האוכלוסייה. ראה איור 3 א .
- הגדרת אוכלוסיות להיות שנאספו עבור המדגם בחלון "מיון פריסה" ולהמשיך עם מיון התא; המדגם לאסוף הוא CD90.2 + CD48 נג CD15 נג CD57 שלילית P>.
הערה: האוכלוסייה שתמוין נבחרה מהתפריט הנפתח הוסף בחלון המיון. לאחר הוספת האוכלוסייה, היא תבקש אירועי יעד או כמה אירועים יש לאסוף. בכל עת, ניתן לערוך את פריסת המיון על ידי לחיצה על השדה מיקום מיקום המכיל את האוכלוסייה. 0.9% ± 0.3 של RGCs עם הפנוטיפ CD90.2 + CD48 Neg CD15 נג CD57 שלילית מתקבלים מגיל צעיר (5-7 שבועות) ו 0.5% ± 0.3 ו ישן (> 12 חודשים) C57BL / 6J עכברים 23 . - באמצעות 25,000 תאים, לבצע בדיקת טוהר 23 . ראה איור 3 ב-א .
הערה: בדיקת הטוהר היא תהליך לנתח מחדש את התאים מיון כדי לאמת את הדיוק של מיון התא. Aliquot קטן של תאים ממוינים יהיה נטען על cytometer לאמת את האפקטיביות של המיון.
- תיוג תאיים.
- תקן תאים מיון עבור 1 שעות ו permeabilize ב 4 ° C כדי להפוך את התאים מטבולית בלתי פעיל כדי לאפשר את החדירה של נוגדנים תאיים.
- לדלל את הנוגדנים הבאים לפתרון permeabilization: אנטי רנ"א מחייב חלבון עם שחבור מרובות (RBPMS) בדילול 1: 100 במלאי 100 מיקרוגרם / מ"ל; אנטי-סינולאין גמא (SNCG), 1: 100 במלאי של 1 מ"ג / מ"ל; המוח ספציפי homeobox / POU תחום חלבונים 3A (BRN3A), 1: 100 במלאי 200 מיקרוגרם / מ"ל; ו אנטי נוירון ספציפי בכיתה III בטא טובולין (TUJ1), 1: 100 במלאי 1 מ"ג / מ"ל. דגירה התאים ופתרונות נוגדן במשך 1 שעה דלי קרח מכוסה.
- שטפו את הדגימות פעמיים עם PBS / 1% FBS.
- Resuspend התאים המתאימים AF488 שתייגת נוגדנים משני ב דילול 1: 200 במשך 30 דקות בתוך דלי קרח.
- שטפו את הדגימות כמו בשלב 6.1.3. שמור את התאים בפניםPBS / 1% FBS (250 μL) עד מוכן לנתח.
7. אימות של תא מיון לפי ניתוח qPCR
הערה: ראה איור 4 .
- מיצוי רנ"א 23 .
- חלץ את ה- RNA מ 5.0 x 10 5 תאים מיון על ידי תמוגה התא homogenization ואחריו תוספת של כלורופורם.
- מעבירים את השלב העליון, חסר צבע כדי microtube נקי עבור משקעים אלכוהול ואחריו תמצית תמצית בעמודה ספין. לבצע עיכול DNAse על העמודה.
- שטפו את הטור עם מים חינם RNase עבור אלוטיון RNA.
- להעריך את הריכוז RNA ידי spectrophotometry.
- CDNA סינתזה מראש הגברה.
- השתמש 100 ng של חומר RNA ומערבבים עם פתרון המכיל אנזים transcriptase הפוך, מעכב ribonuclease רקומביננטי (כדי למנוע השפלה RNA), מגנזיום כלורי (MgCL 2 ), וכן deoxynucleotides.
- מערבבים את תוכן הצינור דגירה במשך 10 דקות על 25 מעלות צלזיוס ואחריו 60 דקות על 42 מעלות צלזיוס. לסיים את התגובה עם הדגירה 5 דקות ב 85 מעלות צלזיוס. חנות cDNA וכתוצאה מכך ב -20 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.
הערה: החומר cDNA ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך חודש עד אם צעד הגברה מראש לא יכול להתבצע באופן מיידי.
- טרום הגברה של cDNA.
- טרום להגביר חומר cDNA באמצעות סדרה של primers ספציפיים עבור סוגי תאים ברשתית רבים כולל: תאים גנגליון ברשתית, תאים amacrine, astrocytes, Müller, דו קוטבית, אופקי, photoreceptors, ותאי אפיתל פיגמנט ברשתית, כמפורט ב הפניה 23 בטבלה של חומרים .
הערה: התגובה מראש הגברה מוכן להגדיל את הרגישות של זיהוי לכימות. התגובה טרום הגברה מכיל תערובת של פריימרמתערבב משולחן החומרים ; 2.5 μL של cDNA, אשר נכתבו ב 100 ng של RNA; אנזים transcriptase הפוך; ו nuclease ללא מים בנפח סופי של 10 μL. - לבצע את שלב ההפעלה האנזים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחריו 14 מחזורים ב 95 מעלות צלזיוס במשך 15 שניות, ואחריו 60 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות. לדלל את החומר המוגבר מראש 1:10 במאגר EDIS Tris ולשמור אותו ב -20 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.
- טרום להגביר חומר cDNA באמצעות סדרה של primers ספציפיים עבור סוגי תאים ברשתית רבים כולל: תאים גנגליון ברשתית, תאים amacrine, astrocytes, Müller, דו קוטבית, אופקי, photoreceptors, ותאי אפיתל פיגמנט ברשתית, כמפורט ב הפניה 23 בטבלה של חומרים .
- 7.4 qPCR תגובה.
- הכן את כל התגובות qPCR בנפח 10 μL הסופי באמצעות מדולל, מראש מוגבר cDNA (2.5 μL), primers (המפורטים בטבלה של חומרים ), מים ללא nuclease, וכן להתרכז עם פולימראז DNA ו deoxynotides.
- השתמש בתנאי המכשיר הבאים כדי להפעיל את qPCR: צעד אחיזה של 50 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ואחריו 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הפעל סך של 40 מחזורים ב 95 מעלות צלזיוס במשך 15 שניות ואחריו 60 מעלות צלזיוס למשך 1 דקות. בצע את כל המדידהEments משכפל של שלושה.
- בצע כימות יחסית באמצעות סף ההשוואה (C T ) לאחר קביעת ערכי C T עבור הגן משק הבית ואת הגנים היעד בכל מדגם. לחשב את שינוי הקפל היחסי (R q ) באמצעות המשוואה הבאה: R = q = 2 T -ΔC , כאשר ΔC T = C T גן היעד - C T התייחסות הגן 23 .
הערה: C C מוגדר מחזור PCR שבו האות ניאון של צבע הכתב חוצה סף להציב באופן שרירותי 26 . C T קשורה הפוך לכמות amplicon (מוצר PCR) בתגובה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המחקר מעמיק של RGCs מונע על ידי גורמים רבים, כולל תדירות נמוכה שלהם ואת חוסר מתודולוגיה חזקה ומתוקננת לבידוד שלהם. איור 1 מציג את המתודולוגיה המשמשת לבידוד retinae. וריאציות בהליך enucleation קיימות על סמך סוג הניתוח, כגון אם האנקלאציה היא חלק מהניסוי של vivo 27 . Enucleation בפרוטוקול זה מבוצע על עכברים מורדמים. כפי שמוצג בתרשים 1A -B , מלקחיים ממוקמים מתחת לעין ומשכה לגרום לדימום מינימלי ולהסיר את כדור העין עם עצב אופטי שלם.
הבדלים קיימים במספר RGCs זנים שונים העכבר, במיוחד בעכברים ששונו גנטית 23 , 28 ,EF "> 29 , 30. מודעות להבדלים אלה חשוב בעת קביעת מספר עכברים לשמש.למען עכברים C57BL הישן / 6J יש פחות תאים ברשתית חיים מאשר עמיתיהם הצעירים שלהם 23. לכן, דיסקציה רשתית חייב להיות מבוצע בקפידה כדי למקסם את התשואה התא.הליך צעד אחר צעד עבור דיסקציה הרשתית מוצג בתר 1C -J תאים הרשתית שבריריים.לכן, retinae גזור ממוקמים מסננים ניילון ו macerated גם עם הקצה האחורי של מזרק, כמו כפי שמוצג בתרשים 2A , או עם העלי עבור תאים מסננת.התאוששות של תאים ישירות מסננת התא הוא מהיר ומפחית גושים התא.דימוי נציג ההשעיה התא מוצג באיור 2.B תאים הרשתית הפנימית מרובים ניתן דמיינו. בשלב זה, RGCs איבדו מורפולו החתימה שלהםGy עקב axotomy במהלך בידוד התא הכנת ההשעיה התא.
השלב הכי אינטנסיבית של מתודולוגיה זו היא הגדרת התא מיון. שלב זה הוא צעד קריטי במהלך FACS multicolor, כפי שהוא ממקסם את האות לרעש ברזולוציה. איור 3 א מציג את האסטרטגיה gating המשמש לבידוד של RGCs. אסטרטגיה זו מכוונת להסרת תאים מזהמים מתא ההשעיה, שכלל מונוציטים, גליה, אמקרין ותאי פוטורפטור. במסגרת המתודולוגיה, סמנים פני השטח נוספים אושרו על ידי ניתוח immunohistochemical לפני שהם שימשו כחלק מאסטרטגיית הרחקה. נתונים קודמים הראו כי אחוז קטן של CD90.2 + תאים הם CD48 + . הרחקה של תאים אלה הוסרו מונוציטים ואולי microglia מבריכת תא retinae. זה כבר הוכיחו בעבר כי קלאסי Thy1 + CD48 Neg 23 , כמו תאים אלה להביע גנים הקשורים amacrine, Müller, דו קוטבית, photoreceptor אופקית, ותאי אפיתל פיגמנט ברשתית ( איור 4 א ). זה עוד מטופל על ידי חקירת סמנים נוספים על אי הכללת תאים. CD15 תוארה כסמן של amacrine ותאים דו קוטביים 31 , מה שהופך את השימוש בו כסמן נוסף לבחירה שלילית. עבודה מ Uusitalo et al. 32 תיאר CD57 כסמן זיהוי לתאי גלייה ו photoreceptors. לכן, נוגדנים אלה נוספה אסטרטגיה מיון התא.
לאחר מכן, תאים אלה אופיינו כדי לאמת את המתודולוגיה עבור בידוד של RGCs Murine. פנוטיפים של CD90.2 + CD48 נג CD15 Neg CD57 תאים ממוינים (<(3) , 11 , 12 , 33 : SNCG, BRN3A, TUJ1 ו- RBPMS. כפי שמוצג בתרשים 3C , תאים ממוינים ביטא את כל ארבעת חלבונים תאיים הקשורים RGC. לאחר מכן, cytometry זרימת הדמיה שימש באיור 3D כדי להראות את לוקליזציה תאיים של RBPMS ואת הביטוי משטח התא של CD90.2. תוצאות אלה נבדקו במערכות cytometer מרובים, המאשר את reproducibility ו סטנדרטיזציה. כפי שמוצג בתרשים 3E , כמה תאים מיון החלו להראות את המורפולוגיה הקשורים RGCs לאחר בתרבית תאים חוץ גופית .
לבסוף, השוואה של תאים לפני העשרה שלאחר לסה"נניתוח ll בוצע על ידי ניתוח qPCR. השוואה של פנוטיפ Thy1 + CD48 של CD CD90.2 + CD48 נג CD15 Neg CD57 תאים מיון מיון גילה כי הפנוטיפ Thy1 + CD48 Neg מבטא גנים הקשורים RGCs, אלא גם עם תאים אחרים ברשתית. עם זאת, האוכלוסייה מועשר מאוד תא תאים ( איור 4 ב ) הראה עלייה פי כמה בגנים קידוד עבור RGC ספציפיים סמנים תאיים Sncg (SNCG), Pouf4l (BRN3A), Tubb3 (TUJ1), ו Rbpms (RBPMS). ביחד, הערכות ה- mRNA והחלבון אישרו את המתודולוגיה.
איור 1 . אנקלאציה וניתוח עיני עבור בידוד רשתית. צעירים C57BL / 6J עכברים היו מורדמים לפני tO הסרת גלובוס העין עם CO 2 ונקע צוואר הרחם. א) מניחים מלקחיים מתחת לעין ולמשוך את העין בתנועה אחת. ב) העין מוסרת, כולל עצב הראייה. CJ) מדריך שלב אחר שלב כדי להסיר את הרשתית. C) לנקב מבוצע באמצעות מחט 30G לפני הסרת הקרנית כדי לאפשר הומור מימית לצאת מהעין. D) הקרנית מוחזקת עם מלקחיים לעשות חתך קטן. EF) השימוש במלקחיים מאפשר קילוף את הקרנית, אפיתל פיגמנט הרשתית, choroid, ו sclera. הרשתית מנותקת מן sclera, התגלגל, והוסרו. ) G העדשה מוסרת ומוזנחת. HJ) retinae שנאספו ממוקמים בצלחת קטנה המכילה PBS / 1% FBS לשמור אותם לחים בכל עת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של זהדמות.
איור 2 . תא רשתית השעיה לאחר Maceration של Retinae שנאספו. רטינה שנאספו ממוקמים בצלחת קטנה לבודד את התאים. א) Retinae ממוקמים מסנן ניילון 70 מיקרומטר ו macerated באמצעות back-end של מזרק. ב) תמונה נציג של ההשעיה התא, שבו תאים רשתית ברורים נצפים. סרגל סולם הוא 10 מיקרומטר.
איור 3 . מיין אסטרטגיה לבידוד של תאים עם CD90.2 + CD48 נג CD15 Neg15 CD
גיל = "1"> 
איור 4 . המיון שלאחר מיון ניתוח mRNA. Thy1 + CD48 תאים שליל ומיין עם CD90.2 CD90.2 CD90 CD + CD48 נג CD15 נג שלילית הוערכו על ידי ניתוח qPCR באמצעות פאנל של 25 גנים לידי ביטוי על ידי תאים ברשתית. רמות היעד ביטוי גנים מוצגים כשינוי יומן 2- Fold באמצעות Hprt כגן משק בית ומים כבקרה שלילית. החישוב נעשה לפי שיטת ΔC T. ממוצע ± SEM; N = 3 משכפל ביולוגי בוצעו בשלושה עותקים. נתונים המתקבלים מעבודות שפורסמו בעבר עם אישור 23 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FACS היא טכניקה של בחירה כדי לטהר אוכלוסיות תאים. שיטות בידוד אחרות כוללות immunopanning, חרוזים מגנטיים, ואת ההשלמה קיבעון משלים. היתרון של FACS על פני מתודולוגיות אחרות אלה מבוסס על זיהוי סימולטני של סמנים פני השטח עם דרגות שונות של אינטנסיביות. עוצמת הניאון של המולקולה פרופורציונלית לכמות ביטוי החלבון. עד כה, הבידוד של RGCs התבסס רק על חיוביות Thy1 (CD90) ו CD48 negativity 15 , 16 , 22 , 34 , ללא קשר לשיטת בידוד בשימוש. הוכח לאחרונה כי פנוטיפ Thy1 + CD48 Neg אינו מספיק כדי לבודד אוכלוסייה הומוגנית של תאים להביע RGC סמנים תאיים 23 . זיהוי האוכלוסייה RGC הוא חיוני לבידוד שלהם, בפרטY כי הם מהווים אחוז קטן של תאים ברשתית 7 , 8 , 9 . רוב RGCs ממוקמים השכבה הפנימית של הרשתית, בעוד מספר קטן נמצאים בשכבות plexiform הפנימיים (RGCs העקורים 35 ). לפיכך, מעקב RGCs מן colliculi מעולה על ידי זריקות stereotactic ו מעקב עם hydroxystillbamidine (נותב מדרדר עבור נוירונים מתאר) הפך אטרקטיבי בחירות עבור מעבדות רבות 36 , 37 , 38 . מערכות אלה דורשות הזרקת של נותב, אשר, אם לא מבוצע כראוי, עלול להוביל כמה אזורים רשתית שמאל untraced. בנוסף, הם דורשים יותר מבחינה טכנית, כמו מתודולוגיות אחרות כגון immunopanning, הם ארוכים. Immunopanning באמצעות נוגדנים נגד Thy1 ו -4848 לוקח 48 שעות כדי להשלים אינו משיג יותר מ 95טוהר. עבודה זו מתארת מתודולוגיה מבוססת FACS המציעה פרוטוקול מהיר לשחזור לבודד אוכלוסייה הומוגנית של RGCs לחיות עם CD90.2 + CD48 נג CD157 CD57 שלילי פנוטיפ, ללא שימוש של כל tracers, חרוזים מגנטיים, או טכניקות immunopanning .
הגורמים הבאים נדרשים לבידוד מוצלח של RGCs טהורים על ידי FACS: 1) יעילות מיון, אשר מאוד תלוי בציוד בשימוש; 2) שילוב אופטימלי של נוגדנים מתוייגים fluorochromes, כדי למזער את הרעש; ו 3) הגדרת התא מיון. יעילות המיון מחושבת על ידי לקיחת מספר אירועי היעד שנבחרו למיון חלקי מספר אירועי היעד שזוהו, המבוטאים באחוזים. יעילות המיון היא חישוב הניתן על ידי הציוד. יעילות זו תלויה בהגדרת מערכת המיון ובמצב מיון התא. בחירת שילוב אופטימלי של fluorochromes היא תהליך מורכב. כל שפעתאורוכרום יש תכונות נפרדות מאופיין על ידי עירור ואת פליטת אורכי גל. בעוד את עירור הוא קרא עם לייזר, את הפליטה הוא קרא על ידי צינורות photomultiplier, אשר מוגבלים על ידי מסננים אופטיים זמין ציוד מיון FACS. כאן, שילוב של נוגדנים מתוייגים fluorochromes PE, PE-Cyanine7, AF700, ו BV421 מסופק. זה נקבע לאחר שקול שילובים fluorochrome מרובים שסיפק את הפתרון הטוב ביותר תוך צמצום חפיפה רפאים. לבסוף, הגדרת המיון היא קריטית. באופן כללי, תאים ברשתית הם שבירים. לכן, עדיף להשתמש בלחץ נמוך יותר כדי להפעיל את הדגימות, כדי למזער את הלחץ על התאים. זה קריטי כדי לשמור על המדגם ב 4 ° C, בגלל שמירה על RGCs Murine לתקופות ארוכות יותר של זמן בטמפרטורת החדר יכול להפחית את התשואה התא, במיוחד כאשר מיון מספר גדול של תאים.
מיון מבוסס FACS הוא מתודולוגיה אידיאלית לבידוד של תאים המרכיבים את AVEry אחוז קטן ההשעיה התא. התהליך, מן לנתיחה הרשתית להשלמת מיון התא, לוקח בערך 5 - 6 שעות, לעומת immunopanning ומעקב מערכות, אשר לקחת ימים כדי להשלים. הניתוח הרב-ממדי של FACS ויכולת הציוד לאסוף מספר אוכלוסיות בנות-קיימא מאפשרות ניתוחים פונקציונליים נוספים של תאים. הפרוטוקול המתואר כאן הוא כלי רב עוצמה לבידוד של RGCs Murine העיקרי. למרות יתרונותיו הרבים, כולל רגישותו, שחזורו, והזיהוי המיידי של תאים בת קיימא, קיימות מספר מגבלות. ראשית, זה דורש מכשור יקר ומפעיל מאומן. בדרך כלל, המפעיל הוא אימונולוג או אדם מאומן בתחום, עם מי יש צורך להיפגש בזמן ההתקנה הניסוי. כיום, מתקני אקדמיים יש מתקני הליבה מרובים, אשר עשוי להקל על ביצוע סוגים אלה של ניסויים. שנית, RGCs לאבד את ty שלהםמורפולוגיה pical עקב atoxomy, מה שהופך אותם קטנים מאוד בגודל. בשלב זה, לא ידוע אם חלק הגנים שלהם עשוי להיות מאופנן עקב atoxomy.
המתודולוגיה המוצגת כאן מאפשרת ניתוח במורד הזרם של תפקוד RGC במבחנה והיא כלי רב ערך לשימוש בתחומי מדעי הראייה והבריאות. שמירה על פלט תא גנגליון למוח נדרש תפיסה חזותית והוא בסיכון במחלות רבות. תאים אלה יכולים לשמש עבור מבוקר ניסויים במבחנה , הן מודלים בריאים המחלה. ניתן לבצע מחקרים אלקטרו-פיזיולוגיים, פרמקולוגיים, ביוכימיים ומולקולריים על תאים אלה, שהם אידיאליים לפיתוח מטרות טיפוליות בעתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות למר טים היגינס, מאייר בכיר מהמחלקה למיקרוביולוגיה, אימונולוגיה וביוכימיה, לסיוע טכני טכני; ד"ר מתיו ווילסון לדיונים ולחברי המעבדות של ג'בלונסקי ומוראלס-טיראדו על הערותיהם המועילות. עבודה זו נתמכה על ידי מכון המחקר Alcon Research Young Investigator Award (VMM-T), אוניברסיטת Tennessee Research Foundation (VMM-T), המכון הלאומי Eye EY021200 (MMJ), אחוות Gerwin (VMM-T); את אחוות גרובין לפני הדוקטורט (ZKG), את מחלקת המחקר הרפואי של צבא ההגנה ואת פקודת המטען (VMM-T) ואת המענק הבלתי מוגבל ממחקר למניעת עיוורון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse CD15 PE | BioLegend | 125606 | Clone MC-480 |
| Anti-mouse CD48 PE-Cy7 | BioLegend | 103424 | Clone HM48-1 |
| Anti-mouse CD57 | Sigma Aldrich | C6680-100TST | Clone VC1.1 |
| Anti-mouse CD90.2 AF700 | BioLegend | 105320 | Clone 30-H12 |
| Brilliant Violet 421 Goat Anti-mouse IgG | BioLegend | 405317 | Clone Poly4053 |
| Purified Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | FcgRII/III block, Clone 93 |
| Zombie Aqua | BioLegend | 423102 | Live cell/ Dead cell discrimination |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | U.S. origin |
| AbC Total Antibody Compensation Bead Kit | Thermo Fisher Scientific | A10497 | Multi-species Ig |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Add serum to media prior to culture. |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | Saline solution |
| Dissection Microscope | Olympus | SZ-PT Model | Stereo Microscope |
| Sorvall Centrifuge | Thermo Scientific | ST 16R | All centrifugation performed at RT |
| Base Plate – Dissection Pan | Fisher Scientific | SB15233FIM | A wax plate can also be used |
| Forceps | Aesculap | 5002-7 | 4 ½ inches |
| Iris Scissors, Straight | Aesculap | 1360 | 5 ½ inches |
| Falcon 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 352097 | Polypropylene tubes |
| Falcon 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 352098 | Polypropylene tubes |
| BD FACS Tubes | Fisher Scientific | 352003 | Polypropylene tubes |
| 40 mm dishes | MidSci | TP93040 | Tissue culture treated |
| 70 μm nylon strainer | MidSci | 70ICS | sterile |
| 40 μm nylon strainer | MidSci | 40ICS | sterile |
| BD 10 mL syringe | Fisher Scientific | 301604 | Disposable Syringe without needle |
| Pestles | MidSci | PEST | sterile |
| Wheaton Vials | Fisher Scientific | 986734 | No Liner |
| BD 30 G needle | Fisher Scientific | 305128 | 1 inch |
| Hausser Scientific Bright-Line Glass Counting Chamber | Fisher Scientific | 0267151B | Hemocytometer |
| Gibco Trypan blue 0.4% Solution | Fisher Scientific | 15250061 | Viability Dye |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | 1.5mL |
| EVOS Floid Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | 447113 | Fluorescence Imaging with a 20X objective |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-452 | Used to make 70% Ethanol |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | Rainin | 17014282 | LTS Pipette |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | Rainin | 17014391 | LTS Pipette |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | Rainin | 17014392 | LTS Pipette |
| Rack LTS 1000 mL – GPS-L1000S | Rainin | 17005088 | Blue Rack Sterile Tips |
| Rack LTS 250 mL – GPS-L250S | Rainin | 17005092 | Green Rack Sterile Tips |
| Rack LTS 20 mL – GPS-L10S | Rainin | 17005090 | Red Rack Sterile Tips |
| FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | N/A | Custom order |
| LSR II Cytometer | BD Biosciences | N/A | Custom order |
| Abca8a | Thermo Fisher Scientific | Mm00462440_m1 | Müller cells |
| Aldh1al | Thermo Fisher Scientific | Mm00657317_m1 | Müller cells |
| Aqp4 | Thermo Fisher Scientific | Mm00802131_m1 | Astrocytes |
| Calb2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00801461_m1 | Amacrine, Horizontal |
| Cd68 | Thermo Fisher Scientific | Mm03047340_m1 | Retinal Pigment Epithelial Cells |
| Gad2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00484623_m1 | Amacrine |
| Hprt | Thermo Fisher Scientific | Mm01545399_m1 | House keeping gene |
| Lhx1 | Thermo Fisher Scientific | Mm01297482_m1 | Horizontal |
| Lim2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00624623_m1 | Horizontal |
| Nrl | Thermo Fisher Scientific | Mm00476550_m1 | Photoreceptors |
| Ntrk1 | Thermo Fisher Scientific | Mm01219406_m1 | Horizontal |
| Pcp4 | Thermo Fisher Scientific | Mm00500973_m1 | Bipolar, Amacrine |
| Pou4f1 | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Prdx6 | Thermo Fisher Scientific | Mm00725435_s1 | Astrocytes |
| Prkca | Thermo Fisher Scientific | Mm00440858_m1 | Bipolar |
| Prox1 | Thermo Fisher Scientific | Mm00435969_m1 | Horizontal |
| Pvalb | Thermo Fisher Scientific | Mm00443100_m1 | Amacrine |
| Rbpms | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Rom1 | Thermo Fisher Scientific | Mm00436364_g1 | Photoreceptors |
| Rpe65 | Thermo Fisher Scientific | Mm00504133_m1 | Retinal Pigment Epithelial cells |
| Slc1a3 | Thermo Fisher Scientific | Mm00600697_m1 | Astrocytes |
| Slc6a9 | Thermo Fisher Scientific | Mm00433662_m1 | Amacrine |
| Sncg | Thermo Fisher Scientific | Mm00488345_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Tubb3 | Thermo Fisher Scientific | Mm00727586_s1 | Retinal Ganglion Cells |
| Vim | Thermo Fisher Scientific | Mm01333430_m1 | Müller cells |
| Taqman Universal Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4440047 | qPCR Reagent |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA Isolation |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | cDNA synthesis |
| Taqman PreAmp Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4391128 | Pre-Amplification step |
| BD Cytofix/ Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Fixation/ Permeabilization Buffer |
| BD Perm/ Wash | BD Biosciences | 554723 | Permeabilization Solution |
| RBPMS | Santa Cruz Biotechnology | sc-86815 | intracellular antibody |
| SNCG | Gene Tex | GTX110483 | intracellular antibody |
| BRN3A | Santa Cruz Biotechnology | sc-8429 | intracellular antibody |
| TUJ1 | BioLegend | 801202 | intracellular antibody |
References
- Flammer, J., Orgul, S. Optic nerve blood-flow abnormalities in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 17 (2), 267-289 (1998).
- Bathija, R. Optic nerve blood flow in glaucoma. Clin Exp Optom. 83 (3), 180-184 (2000).
- Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P. A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implication for the treatment of glaucoma. Br J Ophthalmol. 85 (10), 1252-1259 (2001).
- Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye (Lond). 18 (11), 1089-1095 (2004).
- Tian, N., Hwang, T. N., Copenhagen, D. R. Analysis of excitatory and inhibitory spontaneous synaptic activity in mouse retinal ganglion cells. J Neurophysiol. 80 (3), 1327-1340 (1998).
- Schmidt, K. G., Bergert, H., Funk, R. H. Neurodegenerative diseases of the retina and potential for protection and recovery. Curr Neuropharmacol. 6 (2), 164-178 (2008).
- Dreher, B., Sefton, A. J., Ni, S. Y., Nisbett, G. The morphology, number, distribution and central projections of Class I retinal ganglion cells in albino and hooded rats. Brain Behav Evol. 26 (1), 10-48 (1985).
- Williams, R. W., Strom, R. C., Rice, D. S., Goldowitz, D. Genetic and environmental control of variation in retinal ganglion cell number in mice. J Neurosci. 16 (22), 7193-7205 (1996).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Surgucheva, I., Weisman, A. D., Goldberg, J. L., Shnyra, A., Surguchov, A. Gamma-synuclein as a marker of retinal ganglion cells. Mol Vis. 14, 1540-1548 (2008).
- Nadal-Nicolas, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3860-3868 (2009).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Van Bergen, N. J., et al. Recharacterization of the RGC-5 retinal ganglion cell line. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (9), 4267-4272 (2009).
- Wood, J. P., Chidlow, G., Tran, T., Crowston, J. G., Casson, R. J. A comparison of differentiation protocols for RGC-5 cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (7), 3774-3783 (2010).
- Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1 (9), 791-803 (1998).
- Hong, S., Iizuka, Y., Kim, C. Y., Seong, G. J. Isolation of primary mouse retinal ganglion cells using immunopanning-magnetic separation. Mol Vis. 18, 2922-2930 (2012).
- Julius, R. S. The sensitivity of exponentials and other curves to their parameters. Comput Biomed Res. 5 (5), 473-478 (1972).
- Reif, A. E., Allen, J. M. The Akr Thymic Antigen and Its Distribution in Leukemias and Nervous Tissues. J Exp Med. 120, 413-433 (1964).
- Watanabe, M., Noguchi, T., Tsukada, Y. Regional, cellular, and subcellular distribution of Thy-1 antigen in rat nervous tissues. Neurochem Res. 6 (5), 507-519 (1981).
- Haeryfar, S. M., Hoskin, D. W. Thy-1: more than a mouse pan-T cell marker. J Immunol. 173 (6), 3581-3588 (2004).
- Sahagun, G., Moore, S. A., Fabry, Z., Schelper, R. L., Hart, M. N. Purification of murine endothelial cell cultures by flow cytometry using fluorescein-labeled griffonia simplicifolia agglutinin. Am J Pathol. 134 (6), 1227-1232 (1989).
- Shoge, K., et al. Rat retinal ganglion cells culture enriched with the magnetic cell sorter. Neurosci Lett. 259 (2), 111-114 (1999).
- Chintalapudi, S. R., et al. Isolation and Molecular Profiling of Primary Mouse Retinal Ganglion Cells: Comparison of Phenotypes from Healthy and Glaucomatous Retinas. Front Aging Neurosci. 8, 93 (2016).
- Nagdeve, N. G., Yaddanapudi, S., Pandav, S. S. The effect of different doses of ketamine on intraocular pressure in anesthetized children. J Pediatr Ophthalmol Strabismus. 43 (4), 219-223 (2006).
- Ding, C., Wang, P., Tian, N. Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model. Exp Eye Res. 92 (6), 512-520 (2011).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Aerts, J., Nys, J., Arckens, L. A highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening. J Vis Exp. (92), e51936 (2014).
- Li, X., et al. Loss of AP-2delta reduces retinal ganglion cell numbers and axonal projections to the superior colliculus. Mol Brain. 9 (1), 62 (2016).
- Moshiri, A., et al. Near complete loss of retinal ganglion cells in the math5/brn3b double knockout elicits severe reductions of other cell types during retinal development. Dev Biol. 316 (2), 214-227 (2008).
- Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (12), 5151-5162 (2003).
- Jakobs, T. C., Ben, Y., Masland, R. H. CD15 immunoreactive amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 465 (3), 361-371 (2003).
- Uusitalo, M., Schlotzer-Schrehardt, U., Kivela, T. Ultrastructural localization of the HNK-1 carbohydrate epitope to glial and neuronal cells of the human retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (3), 961-964 (2003).
- Jackson, C. J., Garbett, P. K., Nissen, B., Schrieber, L. Binding of human endothelium to Ulex europaeus I-coated Dynabeads: application to the isolation of microvascular endothelium. J Cell Sci. 96 ( Pt 2), 257-262 (1990).
- Pennartz, S., Perraut, M., Pfrieger, F. Purification of retinal ganglion cells from postnatal rats by magnetic cell sorting. MACSmore. 12 (2), 16-18 (2010).
- Nadal-Nicolas, F. M., et al. Displaced retinal ganglion cells in albino and pigmented rats. Front Neuroanat. 8, 99 (2014).
- Nadal-Nicolas, F. M., Salinas-Navarro, M., Vidal-Sanz, M., Agudo-Barriuso, M. Two methods to trace retinal ganglion cells with fluorogold: from the intact optic nerve or by stereotactic injection into the optic tract. Exp Eye Res. 131, 12-19 (2015).
- Barnstable, C. J., Drager, U. C. Thy-1 antigen: a ganglion cell specific marker in rodent retina. Neuroscience. 11 (4), 847-855 (1984).
- Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. (16), (2008).
