Summary
אנו מתארים שיטה לכמת את המצבור של חלבונים misfolded. פרטי פרוטוקול שלנו lentiviral המושרה תא יציב קו הדור הדמיה קונאפוקלית אוטומטיות, ניתוח תמונות של אגרגטים חלבון. כיישום המחשה, למדנו את ההשפעה של מולקולות קטנות בקידום SOD1 צבירת באופן זמן ותלוי במינון.
Abstract
נוירודגנרטיביות (ALS) היא מחלה קטלנית ניווניות יכול להיגרם על-ידי מוטציות בירושה ג'ין קידוד אבץ נחושת סופראוקסיד דיסמוטאז 1 (SOD1). את חוסר היציבות מבנית של SOD1, זיהוי תכלילים SOD1-חיוביות בחולי ALS משפחתית תומכת תפקיד סיבתי פוטנציאליים עבור SOD1 misfolded ו/או צבורים בפתולוגיה ALS. במחקר זה, אנו מתארים את התפתחות assay מבוססת תא שעיצב לכמת את הדינמיקה של צבירת SOD1 בתאים חיים תכולה גבוהה ההקרנה גישות. באמצעות וקטורים lentiviral, יצרנו שורות תאים יציב לבטא פראי-סוג של מוטציה SOD1 A4V עם חלבון פלואורסצנטי צהוב התגית ומצא כי שני חלבונים היו לידי ביטוי ציטוזול בלי שום סימן של מצבור. מעניין, רק SOD1 A4V stably לידי ביטוי HEK-293, אבל לא בשורות תאים U2OS או SH-SY5Y, יצרו אגרגטים על טיפול מעכבי פרוטאוזום. אנו מראים שאפשר לכמת צבירת מבוסס על ניתוח מנה-תגובה של מעכבי פרוטאוזום שונים, וכדי לעקוב אחר קינטיקה צבירה-היווצרות על ידי מיקרוסקופ זמן לשגות. הגישה שלנו מציג את האפשרות של לכימות ההשפעה של מוטציות ALS על עצמו את התפקיד של SOD1 במבנה הצבירה, כמו גם הקרנת עבור מולקולות קטנות למנוע צבירת SOD1 A4V.
Introduction
צבירת חלבון היא תהליך ביולוגי שבו misfolded קבוצת חלבונים את רשאית לפעול כסוכני סיבתי מחלות ניווניות (עמילואידוזיס). אפיון צבירת חלבון חיוני להבין את התפקיד של אגרגטים הסלולר בתפקוד לקוי גם הכוונה להקל על גילוי חדש גורמים המשפיעים על הופעת המחלה. הפריט החזותי של קרינה פלואורסצנטית מתויג חלבונים בתאים חיים היא שיטה חזקה אשר עשויים לסייע בפיתוח של מבחני החלים על תכולה גבוהה הקרנת3,2,1,(HCS)4.
נוירודגנרטיביות (ALS) נחשבת מחלה proteopathic הנגרמת על ידי נוכחותם של חלבונים misfolded עם נטיה לצבור ולצבור בנוירונים מנוע ALS משפחתית (fALS) והן סדיר ALS (sALS)5,6 . תת-קבוצה של ~ 20% מהמקרים fALS קשורים עם דומיננטי מוטציות בגן קידוד האנזים נוגד חמצון cytosolic אבץ נחושת סופראוקסיד דיסמוטאז להקליד (SOD1) 17,8. הוצעו מספר סיבות פוטנציאליות בתפקוד נגזר גנטית זו, לרבות שינויים המבנה והתפקוד של SOD1 משתנים, כגון יציבות סוטה, קצב התגלגלות מוגבר נטיה לצבור9, 10. ראוי לציין, המאפיין היחידי מאומת, רעיל המשותפים לשני החלקים SOD1 מקושרים-ALS ופראי-סוג (WT) SOD1 היא נטיה מוגברת אגרגטים חלבון ממודר או הכללות proteinaceous11,12 . מוטציה misfolded SOD1, בהתמדה polyubiquitinated, מושפל על ידי מערכת אוביקוויטין-פרוטאוזום. כתוצאה מכך, רמה נמוכה של עיכוב פרוטאוזום הפעילות מוביל להצטברות של SOD1 אגרגטים13,14, מבנים אמורפיים איזה טופס המורכבת מרכיבים מסיסים שבו אפשר להחליף עם מוטציה מסיסים SOD1 המוטנט ציטוזול15. ב בפרט, SOD1 המוטנט A4V (אלנין-codon 4 שינתה ולין) המוטציה השכיחה ביותר הגורמים ALS, והוא מוביל הקשורים ניוון מוחיים מהירה עם מועד הישרדות ממוצע של פחות משנתיים לאחר התפרצות המחלה16. מבחינה ביוכימית, SOD1 A4V יש נטייה מוגברת monomerize, צבירה, ויוצרים נקבוביות עמילואיד; אגרגטים כמו נקבוביות שלה דומים נקבוביות עמילואיד מקושרים-מחלת מוטציה צורות אחרות, כגון חלבון α synuclein וβ-עמילואיד17. ללמוד את הדינמיקה של הצטברות SOD1 צבירה, שיטות לניטור מסיסים ובחלקם לא מסיסים SOD1 צבירה טפסים להישאר להיות מפותח.
הראינו בעבר, באמצעות הדמיה לחיות תאים, התאים HEK-293 transiently transfected עם פלורסנט SOD1 מתויג חלבון, כי מוטציות הקשורות ALS לפגום dimerization של צבירת SOD111. למרות מערכות ביטוי ארעי יכול לספק מידע שימושי על התוצאה הביולוגי של ביטוי גנים לטווח קצר, שיטות מתן יציב שילוב של גנים הרצוי עשוי להיות מועדפת לפיתוח וזמינותו. ככזה, וקטורים lentiviral מציעים את היכולת להתייעץ ביטוי גנים לטווח ארוך ומוסדרת על תאים בתרבית של 18. במחקר זה, התמקדנו הדור של שורות תאים יציב transduced עם lentivirus רקומביננטי הנושאת WT ו מתויג SOD1 המוטנט עם חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP). באמצעות מיקרוסקופ הדמיה לחיות תאים כימות אוטומטיות של צבירת SOD1, אנו מופעלות, לכמת SOD1 צבירת להתרחשויות עיכוב של פרוטאוזום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-הפקה lentivirus
הערה: הייצור ואת מניפולציה של וקטורים lentiviral בוצע על פי הנחיות הלאומית המכונים לבריאות (NIH) למחקר מעורבים רקומביננטי ה-DNA. פלסמיד קידוד פראי-סוג של מוטציה A4V SOD1 המתויגת YFP משופרת (SOD1WT-YFP ו SOD1A4V-YFP) מתוארים קים ואח. 11 שני המוצרים פיוז'ן ג'ין היו מוגבר באמצעות הזוג פריימר PCR 5 ′ - ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC - 3 ′, 5 ′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3 ′ ונוסף CMV U3 pTRIP-דלתא פלסמיד 19 בשימוש באתרים מגבלת XhoI ו- BsrGI. בניסויים קודמים, התאים HEK-293T נפרדו ביחס של 1:4 ל- 1:6 כל יומיים. הימנעות של יותר מ-20 קטעים ותחזוקה של תאים על פחות 60% confluency מסייעת להבטיח יעילות תרביות תאים טובה.
- -יום 1, לפצל תאים HEK-293T ב- 30-40% הנהרות בצלחת תרביות רקמה בקוטר 10 ס מ (3 x 10 6 תאים/תבשיל) ב- 10 מ"ל של תרבות תא בינוני (גלוקוז גבוהה DMEM עם 10% FBS ו- 4 מ מגלוטמין) לייצור וירוס.
- לשמור על התרבות רקמות 10-ס מ קוטר צלחת ב- CO 2 מיכלים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) בין לילה.
- -יום 2, להכין פתרון תרביות תאים DNA המכיל 10 µg של וקטורים lentiviral (pTRIP-דלתא U3 CMV - SOD1WT-YFP או - SOD1A4V-YFP) יחד עם lentiviral אריזה (פלסמידים (5 µg של pVSVg; 10 µg של pCMV-dR8.71) איור 2 א) 20. להוסיף µL 125 של 1 מ' CaCl 2 ולכוונן את העוצמה כדי 500 µL באמצעות מים מזוקקים. להוסיף 500 µL של 0.05 M HEPES לתוך התערובת בעדינות, תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- החלף HEK-293T תאים בינוני 10 מ"ל מראש ומחוממת טריים תרבות בינונית תרופתיים מעורבב עם 1 מ ל DNA תרביות תאים פתרון, דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- ביום 3, להחליף את התא supernatant טריים תרבות בינונית.
- -4 יום, לקצור את תגובת שיקוע צינור 15 מ"ל, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 500 g x כדי להסיר את תאים מתים ופסולת. בהמשך לטהר את תגובת שיקוע על ידי העברתו דרך מסנן מיקרומטר 0.45 באמצעות מזרק גדול 60 מ. מיד לוותר על תוך aliquots חד-פעמיים (300 µL), ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס. כדי לשמור על פעילות מוצרי המרבי, להימנע מחזור הפשרת ההקפאה.
2. התמרה חושית lentiviral
- לפצל את שורת התאים להיות נגועים ב- 60% הנהרות (תאים HEK-293, SH-SY5Y; 5 x 10 5 תאים לכל טוב, U2OS; 1 x 10 5 תאים לכל טוב) בצלחת תרביות רקמה 6-ובכן ב 2 מ"ל של מדיה DMEM בתוספת 10% FBS.
- להשאיר את הצלחת תרביות רקמה 6-ובכן בחממה 37 ° C-5% CO 2 ללילה.
- להסיר את lentivirus קפוא מהמקפיא-80 ° C, להפשיר aliquot על הקרח לפני כל שימוש; לא להקפיא מחדש.
- בעוד הווירוס הוא מפשיר, חמים המדיום התרבות התא המכיל את הנסיוב תואם שורת התאים עניין. ברגע הווירוס מופשר הוא מלא, להכין מגוון של דילולים (1:3, 1:10, 1:30 ו- 1: 100) ב- DMEM בשפופרת טריים mL 1.5 microfuge.
- מעלה את עוצמת הקול של הצינורות 1 מ עם מדיה מופחת סרום.
- µL להוסיף 2 של Polybrene (בבית מלאי של 4 µg/µL) עד 1 מ"ל של וירוס/מדיה. מערבבים היטב בעזרת pipetting ומוסיפים 1 מ"ל של תערובת התאים. דגירה התאים בוירוס עבור ה 24
- מסיר את המדיה וירוס ולהחליף מדיה DMEM רגיל בתוספת 10% FBS. לשמור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לפקח על הגידול של התאים ושינוי תרבות התקשורת בכל יומיים. -זרימה, להרחיב את המנה 6-ובכן לתוך צלחת תרביות רקמה בקוטר 10 ס מ.
- ברגע התאים שהורחבו מספיק, תאי זרע 1.5 x 10 4 בעיר µL 50 DMEM מדיה על צלחות assay 384-טוב כדי לבדוק את רמת הביטוי YFP מתויגות חלבון באמצעות מיקרוסקופ. אם YFP מתויג חלבון תא ביטוי מראה יחס אות לרעש ≥ 3, להתכונן תא מניות הקו המקביל תא.
3. זמן ההשפעה תלויה של מעכב פרוטאזום על צבירת חלבון
הערה: לבצע ייבוא תמונות שימוש במיקרוסקופ אוטומטי (ראה חומרים).
- לוותר על µL 0.25 של מעכב דימתיל סולפוקסיד או פרוטאוזום מומס דימתיל סולפוקסיד 100% (ALLN, 2 מ מ) על לוחות שטוחים 384-ובכן.
- ידנית זרע 1.5 x 10 4 תאים לכל טוב ב- 50 µL של DMEM מדיה על אותו assay צלחת. פרוטאוזום מעכב (ALLN) הריכוז הסופי צריך להיות 10 מיקרומטר.
- להגדיר את יחידת הסביבתי של המערכת מיקרוסקופ CO 37 ° C ו-5% 2. צילום מסך של ההתקנה ניסיוני מוצג באיור 3.
- פועלים המיקרוסקופ במצב פלורסצנטיות שדה רחב באמצעות התוכנה עם ההגדרות הבאות: LWD 20 X אובייקטיבי, מצב שאינו-קונפוקלי, שדות 4/טוב, עם מרווח זמן הלכידה של שעה. בסוף כל הפעלה, תמונות שנתפסו מועלות באופן אוטומטי לשרת.
4. זמן לשגות הדמיה YFP ביטוי בתאים חיים, ניתוח (ערוץ יחיד) תמונה
הערה: השלבים הבאים מתארים יישום של התוכנה (למשל, קולומבוס).
אלגוריתם- בחר המתאים לחלק האובייקטים העיקריים (ציטוזול ו אגרגטים). אם נדרש, להתאים את הפרמטרים ' סף ' ניגודיות רקע ( איור 4).
- ספירת תאים באמצעות ' למצוא תאים ' עם הסף בודדים של 0.1 עבור הערוץ בעוצמה YFP. לקבוע אגרגטים באמצעות ' למצוא כתמים ' אלגוריתם עם שהבוטות היחסית YFP ספוט > 0.2 ומקדם הפיצול של 1.0.
5. מנה ההשפעה התגובה של מעכבי פרוטאוזום על צבירת חלבונים בתאי חיה צבעונית בגרעין (שני ערוצים)
הערה: לבצע ייבוא תמונות שימוש במיקרוסקופ אוטומטי. לקבוע את טווח הריכוז של מעכבי פרוטאוזום (ALLN, Epoxomicin ו MG132) בהתבסס על הערך הצפוי של 50 IC כדי להבטיח התאמה אופטימלית עקומת של.
- הכן דילולים טורי של תרכובות על פוליפרופילן אחסון 384-ובכן צלחת על ידי התקן סדרת דילול 1:3. ודא לערבב את מתחם דילולים היטב כדי להבטיח כי ריכוז מתחם מדויק.
- לוותר על µL 0.25 של מעכבי פרוטאוזום על לוחות ריקים שטוח התחתונה שחור 384-ובכן וזמינותו. נוכל להשתמש במטפל נוזלי מצויד עם ראש 384-נים מסוגל להעביר את אמצעי האחסון.
- זרע 1.5 x 10 4 תאים לכל היטב ב-50 µL של התקשורת DMEM על צלחות וזמינותו. דגירה הלוחות assay-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 עבור ה 24
- להוסיף 10 µL של התקשורת DMEM (להתחמם מראש ב 37 מעלות צלזיוס) עם צביעת פתרון (Hoechst 33342 בבית מלאי של 10 מ"ג/מ"ל), דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות
- ההשקה למיקרוסקופלהתמודד הפעלת התוכנה. צילום מסך של ההתקנה ניסיוני מוצג באיור 6. בחר " תצורה " הכרטיסייה ובחר 20 X אובייקטיבית, הסוג הנכון צלחת. ודא " צווארון " מוגדר הערך הנכון על המטרה ומאפשר הריכוז עם סוגים שונים צלחת-
- בחר " מיקרוסקופ " בכרטיסיית הגדר חשיפה 1 כמו YFP (לייזר 488) וחשיפה 2 כמו Hoechst (לייזר 405). להפעיל את המסנן על שתי חשיפות ולהקצות חשיפה 1 מצלמה 1 ו- 2 חשיפה מצלמה 2 תשאר. הגדר פעמים חשיפה ~ 800 ms חשיפה 1 ו- ms ~ 40 חשיפה 2.
- בחר חשיפה 1. מוגדר גובה מיקוד 0 מיקרומטר. בחר " מיקוד ". ברגע מרוכז, חושפים את המצלמה 1. להתאים את גובה המוקד כדי למטב את המטוס חשיפה ולחץ על " לקחת את גובה ". שינוי טיימס חשיפה, לייזר הכוח לתת האינטנסיביות של פיקסלים מרבי של ~ 3000. שמור חשיפה פרמטרים. חזור על חשיפה 2.
- בחר " הגדרת הניסוי " בכרטיסיית ליצור פריסה sublayout. גרור ושחרר את הפריסה הרלוונטיים, חשיפה, תמונת ייחוס, קובץ skewcrop ועל sublayout. להציל את הניסוי.
- בחר " ניסוי אוטומטי " טאב ו לרכוש תמונות. בסוף כל הפעלה, תמונות שנתפסו מועלות באופן אוטומטי לשרת.
6. ניתוח של שתי תמונות ערוץ תמונה
- בחר את האלגוריתם תוכנה כדי לחלק האובייקטים העיקריים (גרעינים, ציטוזול ו אגרגטים) ( איור 7).
- בחר את שיטת מגזרים גרעינים במדויק על ידי בדיקה חזותית של האובייקטים מקוטע. Hoechst חפצים שהוכתמו בערוץ 1 (Ch1) ישמש כדי לקבוע את מספר התאים. ההכתמה YFP מן המוטציה SOD1-A4V בערוץ 2 (Ch2) ישמש כדי לקבוע את כמות אגרגטים.
- ספירת תאים באמצעות ' למצוא את הגרעינים ' אלגוריתם בתור מכתים Hoechst אזורים > 20 מיקרומטר 2, עם מקדם הפיצול של 7.0, סף בודדים של 0.40, ניגוד > 0.10.
- ליצור טבלת הנתונים ולקבוע EC 50 לכל אחד של תרכובות באמצעות ' רגרסיה ליניארית ' המשוואה בתוכנה graphing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generating תא יציב קו באמצעות lentivirus: האסטרטגיה הכוללת עבור ניטור אגרגטים חלבון SOD1 מודגם באיור1. צעד ראשון, אנחנו שנוצר וקטור ביטוי lentiviral למסירה יציב הגן SOD1 לתוך שורות תאים (שלב 1). שני וקטורים lentiviral קידוד מתויג YFP SOD1 WT ו SOD1 A4V (SOD1WT-YFP ו- SOD1A4V-YFP, בהתאמה) עם אריזה, המעטפה פלסמידים הוכנו (איור 2 א). על lentiviral התמרה חושית (שלב 2) התא קווי בדוקות (HEK-293 U2OS, SH-SY5Y) נשאר בריא, הראה ביטוי גבוהה רמות (איור 2B) ולאחר YFP לטווח ארוך תיוג ללא קשר הטופס SOD1. מעניין, WT וגם מוטציה SOD1 לידי ביטוי הקווים שלושה תאים אשר הראו מצבור גלוי, לעומת הדגם הסלולר ביטוי ארעי בעבר נבדקו11.
Validating תא יציב קווים עבור צבירה SOD1 ולימוד הדינאמי: כדי לעורר היווצרות צבירה SOD1 על הסלולר הצטברות misfolded SOD1 המוטנט, השתמשנו מעכב פרוטאזום ALLN (נקרא גם calpain אני והמעכב השני; Ki = nM 190 ו- 220 בהתאמה), בעבר לאמת באמצעות ארעית SOD1 ביטוי מודל הסלולר11. SOD1 צבירת נבדק עם שורות תאים HEK-293, U2OS ו- SH-SY5Y transduced עם SOD1WT-YFP ו SOD1A4V-YFP. טיפול עם מעכבי פרוטאוזום ALLN (10 מיקרומטר) עבור 24 שעות בחום קידום ההצטברות של SOD1A4V-YFP אגרגטים בתאים HEK-293 (איור 2C). עם זאת, אין צבירת נמצא ב- SOD1WT-YFP transduced שורות תאים, רמות נמוכות מאוד של צבירת נמצאה U2OS של שורות תאים SH-SY5Y SOD1A4V-YFP transduced SOD1WT-YFP ו- SOD1A4V-YFP (איור 2C). על סמך תצפיות אלה, השתמשנו זמן לשגות מיקרוסקופ כדי לחקור את הדינמיקה של היווצרות צבירה SOD1A4V-YFP המושרה על ידי עיכוב פרוטאוזום (שלב 3, איור 3), לכמת SOD1A4V-YFP צבירה באמצעות פלורסצנטיות YFP יחיד ערוץ כדי לזהות את התאים ואת אגרגטים לביטוי בתאים חיים (בשלב 4, איור 4). התאים היו נזרע נוכחות, היעדר ALLN, פיקוח לתקופה של 50 שעות (איור 5A). בתנאים ניסיוני שלנו, מצאנו היווצרות צבירה שנגזרות ALLN הגיע מישור-24 שעות, נשארה יציבה במשך 12 השעות הבאות. אנו מראים כי התא צפיפות משמעותית ירד לאחר 28 שעות עקב השפעת ציטוטוקסיות ALLN, בעוד המספר עלה ב הניסוי שטופלו דימתיל סולפוקסיד שלילי.
מולקולה קטנה Characterizing EC 50 על היווצרות צבירה באמצעות SOD1 תא דגם: התאים לבטא SOD1A4V-YFP טופלו באופן תלוי מינון עם מעכבי פרוטאוזום מולקולה קטנה. השתמשנו סמן גרעיני לסמן קו תא SOD1A4V-YFP, המהווה יתרון לזיהוי הצבירה בתוך תא ציטוזול. אכן, מאז כל תא מכיל גרעין, על-ידי הממיין הגרעינים ולהשתמש בהן זרעים בתוך פרשת המים פילוח של התאים, הציטופלסמה פילוח הוא מפושט21. נהגנו Hoechst מכתים, הידוע אין רעילות בעת שימוש לתקופה לטווח קצר, ריכוזים נמוכים22, תנאים אשר לא היו בארץ לשגות בפעם הקודמת הדמיה ניסוי. לאחר 24 שעות של התא culturing בנוכחות מעכבי פרוטאוזום, תאים SOD1A4V-YFP היו מוכתמים Hoechst פתרון (10 µg/mL) למשך 10 דקות. הבא לנו רכשה פלורסצנטיות תמונות Hoechst, YFP באמצעות מטרה נה 20 X 0.4 (בשלב 5, איור 6). באמצעות אלגוריתם ניתוח תמונה אשר לוקח בחשבון את גרעין התא, SOD1A4V-YFP והפצה, תאים נותחו באמצעות התוכנה ניתוח התמונה (שלב 6, איור 7). חפצים שהוכתמו Hoechst המציגות את עוצמת פלורסנט המתאים מעל הרקע ואת מאפייני גודל מורפולוגי גרעינים (רוחב, אורך ושטח) מזוהה, מסווגים לפי סגמנטציה. המסכה גרעיני נגזר Hoechst מכתים שימש כדי לעקוב אחר התפלגות ספוט הפרוקסימלית של SOD1A4V-YFP בתוך אזור cytosolic תא וכדי לקבוע את קיומו או העדרו של אגרגטים. על סמך זיהוי גרעינים, כתמים, מחושב יחס של אגרגטים זוהה לעומת תאים. כדי לקבוע את רמת הרגישות של assay שלנו, אנחנו הבאה לכמת צבירה של תאים SOD1A4V-YFP HEK-293 מטופלים עם שלושה מעכבי פרוטאוזום שונים (ALLN, MG132 ו epoxomicin) באופן ריכוז מינון שאיפשר הולם כימות הנתונים, אנחנו מחושבים ערכי EC50 ± 6.53 1.17, 0.17 מיקרומטר ± 0.03 ± 0.06 ולאחר 0.03 ALLN, MG132, epoxomicin, בהתאמה (איור 8 ב'). רעילות היחסי עבור כל מעכבי פרוטאוזום שלוש הייתה לכמת על ידי מדידת מספר תאים חסיד שנותרו בתוך הבאר המסומנת Hoechst לצבוע. מצאנו כי המספר בתא סכום נטו ירידה בתגובה תופעות מורכבות, כפי שמעידים דומה ערכי EC50 ± 6.58 1.06, 0.19 מיקרומטר ± 0.01 ± 0.03 ולאחר 0.05 ALLN, MG132, epoxomicin, בהתאמה.
איור 1. זרימת העבודה וציר תא קו הדור, ניתוח תוכן גבוהה (HCA) של חלבון מצבור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. SOD1 WT וליצירת קו יציב A4V.
(א) תרשים סכמטי של lentiviral, אריזות וקטורים (אריזה, Envelop פלסמידים) עבור פראי סוג של מוטציה הדור lentivirus SOD1 A4V. (B) נבחרה תמונות קונאפוקלית של שלושה תאים (HEK-293, U2OS ו- SH-SY5Y) transduced עם lentivirus פראי סוג SOD1 (WT) ואת SOD1 המוטנט (A4V). (ג) להחליפן בתמונות של שלושה תאים יציב שטופלו במשך 24 שעות ביממה עם מעכב פרוטאזום, ALLN (10µM). SOD1A4V-YFP אגרגטים נמצאו בשפע נוכח HEK-293 (חצים אדומים), אבל מציגה בדלילות בתאים U2OS או SH-SY5Y. תמונות נרכשו באמצעות מטרה X 20. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. ארבעת השלבים הדרושים עבור ניתוח תמונות של מצבור באמצעות הערוץ YFP לזהות תאים, אגרגטים.
(1) לייבא תמונות תמונות נתונים אחסון וניתוח המערכת. (2) בחר ב "למצוא תאים" לספירת תאים. (3) בחר "למצוא כתמים" כדי לקבוע אגרגטים. (4) להגדיר את התוצאות בהסתמך על כל אלגוריתם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5. עיכוב פרוטאוזום מובילה להצטברות של SOD1A4V-YFP אגרגטים בתאים HEK-293.
(א) נבחר תמונות קונאפוקלית של תאים SOD1A4V-YFP HEK-293 שטופלו 10 מיקרומטר של ALLN. (B) ניתוח כמותי של היווצרות צבירה המושרה עם ALLN (10µM) וסופרת תא באופן תלוי-זמן. תמונות נרכשו באמצעות מטרה LWD 20 X דק 60 בכל קנה מידה בר = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6. מסך זריקה של ערכת ניסיוני למעלה עבור ערוץ 2 רכישה (YFP ו Hoechst). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7. ארבעת השלבים הדרושים לניתוח תמונה של תאים בלוחיות YFP ו Hoechst אגרגטים SOD1.
(1) תמונות קלט ממערכת תמונת נתונים אחסון וניתוח. (2) בחר ב "מצא את הגרעינים" לספירת תאים. (3) בחר "למצוא כתמים" כדי לקבוע אגרגטים. (4) להגדיר את התוצאות בהסתמך על כל אלגוריתם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8. ניתוח כמותי של צבירת SOD1 A4V וריכוז מעכבי פרוטאוזום למינון.
(א) כאן אנו מציגים את התמונה וסופרת שיטת ניתוח כימות כתמים ותא באמצעות מערכת ניתוח התמונה קולומבוס. תמונות המתאימים בשני ערוצים פלורסנט ספיציפית Hoechst (Ch1) ונרכשה YFP (Ch2) היו ברצף. חפצים שהוכתמו Hoechst (משמאל) זוהו על ידי סגמנטציה. המסכה גרעינית (מרכז) נגזר האלגוריתם "מצא את הגרעינים" הוחל כדי לספור את מספר התאים, ואחריו מסכה ספוט (מימין) "למצוא כתמים" האלגוריתם המשמשים לזיהוי אגרגטים. (B) מנה תגובה המחקר של ההשפעה של מעכבי פרוטאוזום על צבירה של מוטציה SOD1 A4V, אשר מראה משתנה EC50 דירוג של 6.53 מיקרומטר, ALLN, 0.17 מיקרומטר על MG132 ולאחר מיקרומטר 0.03 נקודות עבור Expoxomicin. נבחרת תמונות קונאפוקלית של מוטציה פרוטאוזום SOD1 A4V שטופלו ב- EC50 ריכוז. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ישנן שתי גישות עיקריות ליצירת שורות תאים יציב. הראשון לוקח מספר שבועות ומחייב בחירה תרביות תאים והתנגדות ארעית של הווקטורים דנ א גנומי פלסמיד משולב. השני לוקח שעות באמצעות lentivirus, ביצוע פרוטוקול זה נוטה הביטוי יעיל של חלבון המטרה שורות תאים מרובים עם מאמץ מוגבל. הטיול-CMV וקטור19 היה וקטור מתמשכת לשימוש, עם יעילות התמרה חושית שנשמרת וביטוי transgene יציב. למרבה ההפתעה, הקווים שלושה תאים שנוצרו הראה אין צבירה גלוי של המוטציה SOD1, בניגוד פרוטוקול ניסיוני המבוסס על הביטוי ארעי תיאר קודמות11. סביר כי הביטוי ארעי טובות חלבון צבירת כפי שהוא מייצר חלבון גבוה, ביטוי תקופת זמן קצרה יחסית. על תרביות תאים ארעי, המערכת אוביקוויטין – פרוטאוזום, אשר מדרדרת רוב של חלבונים, מגיע לנקודת רוויה שבה את יכולתה לבזות חלבונים צבירה נוטה באופן מלא מנוצל. עם זאת, אנו טוענים כי יציב ארוכות יותר לשחזר את המצב פיזיולוגיים בהם חלבונים באים לידי ביטוי ברמה קבועה יחסית אשר תואם את חיסול של חלבונים misfolded ויה פרוטאוזום, autophagosome-ליזוזום, ו אקסוציטוזה. למרות האירועים הראשי שמוביל לאיי עדיין לא ידוע, הזדקנות לפעולותיה ירידה במערכת פרוטאוזום אוביקוויטין, היא גורם סיכון משמעותי23. כפי שהודגמה בעזרת assay הסלולר שלנו, עיכוב פרוטאוזום מקדם הצבירה של חלבונים misfolded (SOD1 A4V). ככזה, וזמינותו הזה יוצר הזדמנויות חדשות על המסך עבור מפעילי מולקולה קטנה autophagy איתות לשביל או מהרשת המלווה. אכן, בשדרת עבור המלווה אינדוקציה נראה מבטיח, כמו מאויר בדו ח של קיירן ואח . להראות את זה לטיפול עם משרן שיתוף החום נמצא תגובת הלם יש יתרונות טיפולית על ידי הארכת תוחלת החיים של SODG93A עכברים24.
חשוב לציין כי ישנם כמה החסרונות שיש להביא בחשבון לפני שימוש assay הזה. כמו עם פרוטוקול אופטימיזציה assay, מצאנו כי ריכוזי דימתיל סולפוקסיד 1% או שמעליו מגדילה את עוצמת YFP נמדד ב- assay שלנו אומר. לכן חשוב להפחית את ריכוז דימתיל סולפוקסיד ל 0.5% כדי למנוע כל החפץ כזה. יתר על כן, הבחירה של עדשת הגדלה וצפיפות תא בצלחת assay חשובים שיש לקחת בחשבון כדי למטב את היציבות של וזמינותו.
במחקר שלנו, אנחנו הראו כי באמצעות מערכת lentiviral, הקו תא SOD1A4V-YFP HEK-293 מתאימה עבור ניטור היווצרות מוטציה של צבירה SOD1 A4V על אינדוקציה על ידי מעכבי פרוטאוזום. המחקר של חלבונים misfolded, צבירת חיוני להבנת המנגנון של proteinopathies. למרות הכלים לניתוח חלבון צבירת שהורחבו בעשורים האחרונים, גישות יעיל כדי לזהות ולכמת צבירת נדרשים מולקולות מסך המונעים היווצרות צבירה. עבודה זו מספקת פרוטוקול מפורט assay ופיתוח מחקרים של צבירת חלבון. בתקווה, עם התמיכה של HCS, ציטרין ושימוש כימי או CRISPR/siRNA ספריות, עבודה זו צריך לפתוח אפיקים חדשים לגילוי היעד הרפוי או רומן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק ממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIP) (ה-NRF-2014K1A4A7A01074642), והתוכנית הלאומית מחקר קרן של קוריאה (NRF) מדען בודדים תמיכה (ה-NRF-2013M3A9B5076486/ה-NRF-2015R1D1A1A09057239).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
| MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
| Epoxomicin (C28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
| Operetta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
| CyBi Hummingwell liquid handling | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |
References
- Schulte, J., Sepp, K. J., Wu, C., Hong, P., Littleton, J. T. High-content chemical and rnai screens for suppressors of neurotoxicity in a huntington's disease model. PLoS ONE. 6 (8), e23841 (2011).
- Honarnejad, K., et al. Development and implementation of a high-throughput compound screening assay for targeting disrupted ER calcium homeostasis in Alzheimer's disease. PLoS ONE. 8 (11), 1-12 (2013).
- Burkhardt, M. F., et al. A cellular model for sporadic ALS using patient-derived induced pluripotent stem cells. Mol Cell Neurosci. 56, 355-364 (2013).
- Mattiazzi, U., et al. High-Content Screening for Quantitative Cell Biology. Trends Cell Biol. 26 (8), 598-611 (2016).
- Kato, S. Amyotrophic lateral sclerosis models and human neuropathology: Similarities and differences. Acta Neuropathologica. 115 (1), 97-114 (2008).
- Strong, M. J., Kesavapany, S., Pant, H. C. The pathobiology of amyotrophic lateral sclerosis: a proteinopathy? J neuropathol exp neurol. 64 (8), 649-664 (2005).
- Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat rev Neurosci. 2 (11), 806-819 (2001).
- Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. Unraveling the Mechanisms Involved in Motor Neuron Degeneration in Als. Annu Rev Neurosci. 27 (1), 723-749 (2004).
- Vassall, K. a, et al. Decreased stability and increased formation of soluble aggregates by immature superoxide dismutase do not account for disease severity in ALS. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (6), 2210-2215 (2011).
- Hwang, Y. M., et al. Nonamyloid aggregates arising from mature copper/zinc superoxide dismutases resemble those observed in amyotrophic lateral sclerosis. J Biol Chem. 285 (53), 41701-41711 (2010).
- Kim, J., et al. Dimerization, Oligomerization, and Aggregation of Human Amyotrophic Lateral Sclerosis Copper/Zinc Superoxide Dismutase 1 Protein Mutant Forms in Live Cells. J Biol Chem. 289 (21), 15094-15103 (2014).
- Shaw, B. F., et al. Detergent-insoluble aggregates associated with amyotrophic lateral sclerosis in transgenic mice contain primarily full-length, unmodified superoxide dismutase-1. J Biol Chem. 283 (13), 8340-8350 (2008).
- Banci, L., et al. SOD1 and amyotrophic lateral sclerosis: Mutations and oligomerization. PLoS ONE. 3 (2), 1-8 (2008).
- Johnston, J. a, Dalton, M. J., Gurney, M. E., Kopito, R. R. Formation of high molecular weight complexes of mutant Cu, Zn-superoxide dismutase in a mouse model for familial amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci. 97 (23), 12571-12576 (2000).
- Niwa, J. I., et al. Disulfide bond mediates aggregation, toxicity, and ubiquitylation of familial amyotrophic lateral sclerosis-linked mutant SOD1. J Biol Chem. 282 (38), 28087-28095 (2007).
- Juneja, T., et al. Prognosis in familial amyotrophic lateral sclerosis: progression and survival in patients with glu100gly and ala4val mutations in Cu,Zn superoxide dismutase. Neurology. 48 (1), 55-57 (1997).
- Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. Mutant SOD1 mediated pathogenesis of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Gene. 577 (2), 109-118 (2016).
- de Bruyns, A., Geiling, B., Dankort, D. Construction of Modular Lentiviral Vectors for Effective Gene Expression and Knockdown. Methods Mol Biol. 1448, 3-21 (2016).
- Sirven, A. Enhanced Transgene Expression in Cord Blood CD34+-Derived Hematopoietic Cells, Including Developing T Cells and NOD/SCID Mouse Repopulating Cells, Following Transduction with Modified TRIP Lentiviral Vectors. Mol Ther. 3 (4), 438-448 (2001).
- Wu, C., Lu, Y. High-titre retroviral vector system for efficient gene delivery into human and mouse cells of haematopoietic and lymphocytic lineages. J gen virol. 91 (Pt 8), 1909-1918 (2010).
- Irshad, H., Veillard, A., Roux, L., Racoceanu, D. Methods for nuclei detection, segmentation, and classification in digital histopathology: A review-current status and future potential. IEEE Rev Biomed Eng. 7, 97-114 (2014).
- Purschke, M., Rubio, N., Held, K. D., Redmond, R. W. Phototoxicity of Hoechst 33342 in time-lapse fluorescence microscopy. Photochem Photobiol Sci. 9 (12), 1634-1639 (2010).
- Jaskova, K., Pavlovicova, M., Jurkovicova, D. Calcium transporters and their role in the development of neuronal disease and neuronal damage. Gen physiol biophys. 31 (4), 375-382 (2012).
- Kieran, D., et al. Treatment with arimoclomol, a coinducer of heat shock proteins, delays disease progression in ALS mice. Nat Med. 10 (4), 402-405 (2004).
