Summary
Vi beskriver en metod för att kvantifiera sammanläggning av felveckning proteiner. Våra protokolldetaljer lentiviral inducerad stabil cell linje generation, automatiserade confocal bildbehandling och bildanalys av protein aggregat. Som ett belysande program studerat vi effekten av små molekyler att främja SOD1 aggregation i en tid - och dosberoende sätt.
Abstract
Amyotrofisk lateralskleros (ALS) är en dödlig neurodegenerativ sjukdom som kan orsakas av ärftliga mutationer i den gen kodning koppar-zink superoxid dismutase 1 (SOD1). Strukturella instabiliteten i SOD1 och upptäckt av SOD1-positiv införanden i familjär-ALS-patienter stöder en potentiell kausal roll för felveckning och/eller aggregerade SOD1 i ALS patologi. I denna studie beskriver vi utvecklingen av en cell-baserad analys för att kvantifiera dynamiken i SOD1 aggregation i levande celler av hög halt screening metoder. Använder lentiviral vektorer, genererade vi stabila cellinjer som uttrycker vildtyp och muterade A4V SOD1 märkta med gula fluorescerande protein och fann att båda proteiner uttrycktes i cytosolen utan några tecken på aggregering. Intressant, endast SOD1 A4V uttryckt stabilt i HEK-293, men i U2OS eller SH-SY5Y cellinjer, bildas inte aggregat vid proteasom-hämmare behandling. Vi visar att det är möjligt att kvantifiera aggregering baserat på dos-respons analys av olika proteasomhämmare, och spåra aggregat-formation kinetik av time-lapse mikroskopi. Vår metod införs möjligheten att kvantifiera effekten av ALS mutationer på rollen av SOD1 i sammanlagda formation samt screening för små molekyler som hindrar SOD1 A4V aggregation.
Introduction
Protein är en biologisk process som felveckning proteiner gruppen upp och kan fungera som smittämnen vid neurodegenerativa sjukdomar (amyloidos). Karaktärisera protein aggregering är viktigt för att förstå rollen av aggregat i cellulär dysfunktion såväl som att underlätta upptäckten av nya faktorer som påverkar uppkomsten av patologin. Visualisering av fluorescens-märkta proteiner i levande celler är en kraftfull metod som kan bidra till utvecklingen av testmetoder för hög halt screening (HCS)1,2,3,4.
Amyotrofisk lateralskleros (ALS) betraktas som en proteopathic sjukdom som orsakas av närvaron av felveckning proteiner med benägenheten att aggregera och ackumuleras i motoriska nervceller i både familjär ALS (fALS) och sporadisk ALS (sALS)5,6 . En delmängd av ~ 20% av fALS fall är associerade med dominerande mutationer i den gen som kodar för enzymet cytosoliska antioxidant koppar-zink superoxid dismutase typ 1 (SOD1)7,8. Flera möjliga orsaker till denna genetiskt härledda dysfunktion har föreslagits, inklusive ändringar i struktur och funktion av SOD1 varianter, såsom avvikande stabilitet, ökad utspelas ränta och benägenhet att aggregera9, 10. Framför allt, den enda verifierade och potentiellt giftiga egendom delas av båda ALS-länkade SOD1-varianter och vildtyp (WT) SOD1 är en ökad benägenhet att bilda konkurrensbetingat protein aggregat eller proteinhaltiga inneslutningar11,12 . Felveckning muterat SOD1, är ständigt polyubiquitinated och förstörd av den ubiquitin-proteasomsystemet. Som ett resultat, leder en låg nivå av hämning av proteasom aktivitet till ansamling av muterade SOD1 aggregerar13,14, som bilda amorfa strukturer består av lösliga komponenter som kan byta med lösliga muterat SOD1 i cytosolen15. I synnerhet SOD1 mutant A4V (alanin vid kodon 4 ändras till valin) är den vanligaste ALS-orsakar mutationen, och leder till snabb neurodegeneration med en genomsnittlig överlevnadstid på mindre än 2 år efter sjukdom debut16. Biokemiskt, har SOD1 A4V en ökad tendens till monomerize, aggregera och bilda amyloid porer; dess por-liknande aggregat är liknande i andra sjukdom-länkade muterade former, såsom α-synuclein och β-amyloid protein17amyloid porer. För att studera dynamiken i SOD1-aggregat ackumulering, återstår metoder för övervakning av lösliga och olösliga SOD1 sammansatta former utvecklas.
Vi har tidigare visat, med hjälp av live-cell imaging och HEK-293 celler transfekterade normalnivå med fluorescerande protein-taggade SOD1, att ALS-mutationer försämra SOD1 dimerization och aggregering11. Även om övergående uttryck system kan ge användbar information om biologiska resultatet av kortsiktiga gen överuttryck, kan metoder som stabil integrering av önskad gener vara att föredra för assay utveckling. Som sådan, erbjuder lentiviral vektorer möjligheten att ge långsiktiga och reglerat genuttryck på däggdjursceller 18. I denna studie fokuserade vi på generering av stabil cellinjer sensorik med rekombinant lentivirus bär WT och muterat SOD1 märkta med gula fluorescerande protein (YFP). Använda live-cell imaging mikroskopi och automatiserade kvantifiering av SOD1 aggregering, vi utlöses och kvantifierade SOD1 aggregering händelser vid hämning av proteasomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. lentivirus produktion
Obs: produktion och manipulation av lentiviral vektorer genomfördes enligt National Institutes of Health (NIH) riktlinjerna för forskning som involverar rekombinant DNA. Plasmid kodning av vildtyp och A4V-muterat SOD1 märkta med förbättrad YFP (SOD1WT-YFP och SOD1A4V-YFP) beskrivs i Kim et al. 11 båda genprodukter fusion var förstärkt med hjälp av PCR-primer paret 5 ′ - ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC - 3 ′ och 5 ′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3 ′ och infogas i den pTRIP-delta U3 CMV plasmid 19 med XhoI och BsrGI begränsning sites. I tidigare experiment delades HEK-293T cellerna i förhållandet 1:4 till 1:6 varannan dag. Undvikande av mer än 20 passager och underhåll av celler vid mindre 60% confluency bidrar till att säkerställa bra transfection effektivitetsvinster.
- På dag 1, dela HEK-293T celler på 30-40% confluence i en 10-cm diameter vävnadsodling tallrik (3 x 10 6 celler/maträtt) i 10 mL cellodlingsmedium (hög-glukos DMEM med 10% FBS och 4 mM L-glutamin) för virus produktion.
- Hålla 10-cm diameter vävnadskultur plattan i en CO 2 inkubator (37 ° C, 5% CO 2) över natten.
- På dag 2, förbereda en DNA transfection lösning innehållande 10 µg av lentiviral vektorer (pTRIP-delta U3 CMV - SOD1WT-YFP eller -SOD1A4V-YFP) tillsammans med den lentiviral förpackning () plasmider (5 µg pVSVg; 10 µg av pCMV-dR8.71) figur 2A) 20. Tillsätt 125 µL av 1 M CaCl 2 och justera volymen till 500 µL med destillerat vatten. Varsamt tillsätt 500 µL av 0,05 M HEPES i blandningen och inkubera i 10 min i rumstemperatur.
- Ersätt HEK-293T cellerna medium med 10 mL före värmde färskt odlingssubstrat antibiotikum-fri blandas med 1 mL DNA transfection lösning och inkubera över natten vid 37 ° C, 5% CO 2.
- På dag 3, ersätta cellen supernatanten med färska odlingsmedium.
- På dag 4, skörda supernatanten i en 15 mL rör och Centrifugera under 5 minuter vid 500 x g för att ta bort döda celler och skräp. Ytterligare rena supernatanten genom passering genom ett 0,45 µm filter med en stor 60 mL spruta. Omedelbart fördela i engångsbruk alikvoter (300 µL) och lagra vid-80 ° C. För att bibehålla maximal produkt aktivitet, undvika en frysning-tining cykel.
2. Lentiviral transduktion
- Split cell linjen att smittas på 60% confluence (HEK-293 celler och SH-SY5Y; 5 x 10 5 celler per brunn och U2OS, 1 x 10 5 celler per brunn) i en 6-väl vävnadsodling platta i 2 mL DMEM media kompletteras med 10% FBS.
- Hålla 6-väl vävnadsodling plattan i en 37 ° C inkubator på 5% CO 2 över natten.
- Bort den frysta lentivirus från-80 ° C frysen och Tina en alikvot på is före varje användning; inte frysas.
- Medan viruset upptining, varma i cellodlingsmedium som innehåller serumet kompatibel med cell linje av intresse. När viruset är helt tinade, förbereda en rad utspädningar (1:3, 1:10, 1:30 och 1: 100) i DMEM i ett färskt 1,5 mL mikrofugrör.
- Få upp volymen i rören för att 1 mL med reducerad serum media.
- Add 2 µL av Polybrene (på ett lager av 4 µg/µL) till 1 mL av virus/media. Blanda väl genom pipettering och tillsätt 1 mL av blandningen till cellerna. Inkubera cellerna med viruset för 24 h.
- Ta bort virus materialet och ersätta med normala DMEM media kompletteras med 10% FBS. Upprätthålla cellerna vid 37 ° C, 5% CO 2.
- Övervaka tillväxten av cellerna och ändra kultur media varannan dag. Vid sammanflödet, expandera 6-väl skålen till en 10-cm diameter vävnadsodling tallrik.
- När cellerna har utvidgats tillräckligt, utsäde 1,5 x 10 4 celler per brunn i 50 µL DMEM media på 384-väl assay tallrikar att kontrollera uttryck av YFP märkta proteinet av mikroskopi. Om YFP taggade proteinuttryck cell visar en signal-brus-förhållande ≥ 3, förbereda cell lager för den motsvarande cellinje.
3. Tid beroende effekten av proteasomhämmare på protein aggregering
Obs: utföra bild förvärv genom en automatiserad Mikroskop (se material).
- Dispensera 0,25 µL av DMSO eller proteasom-hämmare upplöst i 100% DMSO (ALLN, 2 mM) på 384-well platta bottenplåtar.
- Manuellt utsäde 1,5 x 10 4 celler per brunn i 50 µL DMEM media på samma assay plattan. Proteasom-hämmare (ALLN) slutliga koncentration bör vara 10 µM.
- Ställa in mikroskopet miljökontroll systemenheten till 37 ° C och 5% CO 2. En skärmdump av den experimentella setup visas i figur 3.
- Använda mikroskopet i brett fält fluorescens-läge, använda programvaran med följande inställningar: LWD 20 X mål, icke-confocal läge, 4 fält per brunn, med en fånga intervall på en timme. I slutet av varje körning, tagna bilder automatiskt laddas upp till servern.
4. Tid förflutit imaging för YFP uttryck i levande celler, och bildanalys (enda kanal)
Obs: I följande steg beskrivs tillämpningen av programvaran (t.ex., Columbus).
- Välj lämplig algoritm för att segmentera de primära objekt (cytosol och aggregat). Om det behövs, justera bakgrunden tröskel och kontrast parametrar ( figur 4).
- Räkna celler använder ' hitta celler ' med en individuell tröskel för 0,1 för kanalen YFP intensitet. Bestämma aggregat med en ' hitta ställen ' algoritm med en relativ YFP spot intensitet > 0,2 och 1,0 blixtra koefficienten.
5. Dos svar effekten av proteasomhämmare på protein aggregation på levande celler färgas för deras kärnor (två kanaler)
Obs: utföra bild förvärv genom en automatiserad Mikroskop. Fastställa koncentrationen proteasomhämmare (ALLN Epoxomicin och MG132) baserat på det förväntade IC 50 värdet för att säkerställa en optimal kurva passform.
- Förbered seriespädningar av föreningar på en 384-väl lagring polypropylen tallrik av standard 1:3 spädningsserien. Se till att blanda de sammansatta utspädningarna väl för att säkerställa att de sammansatta koncentrationerna är korrekta.
- Dispensera 0,25 µL proteasomhämmare på tom platt-botten svart 384-väl assay tallrikar. Vi använder en flytande hanterare utrustade med 384-kapillär huvud kan överföra volymer.
- Utsäde 1,5 x 10 4 celler per brunn i 50 µL DMEM Media på assay tallrikar. Inkubera assay plattorna vid 37 ° C och 5% CO 2 för 24 h.
- Tillsätt 10 µL DMEM Media (pre värmas vid 37 ° C) med färgning lösning (Hoechst 33342 på ett lager av 10 mg/mL) och inkubera i rumstemperatur i 10 min.
- Starta microsHantera operativsystem. En skärmdump av den experimentella setup visas i figur 6. Välj den " Configuration " fliken och välj 20 X mål och rätt platta typen. Säkerställa " krage " är inställd på rätt värde på målet så att korrekt fokus med olika plattan typer.
- Välj det " Mikroskop " tab. definiera exponering 1 som YFP (488 laser) och exponering 2 som Hoechst (405 laser). Aktivera filtret på båda exponeringar och tilldela exponering 1 kamera 1 och exponering 2 kamera 2. Ställa in exponering gånger till ~ 800 ms för exponering 1 och ~ 40 ms för exponering 2.
- Välj exponering 1. Ställa in fokus höjd till 0 µm. Välj " fokus ". När fokuserad, exponera kamera 1. Justera fokus höjden för att optimera exponering planet och klicka på " ta höjd ". Ändra exponeringstiderna och laser power att ge en maximal pixel intensitet ~ 3000. Spara exponeringsparametrar. Upprepa för exponering 2.
- Välj " Experiment Definition " tab. skapa en layout och sublayout. Dra och släpp den relevanta layout, exponering, referensbilden, skewcrop fil och sublayout. Spara experimentet.
- Välj " automatisk Experiment " fliken och förvärva bilder. I slutet av varje körning, tagna bilder automatiskt laddas upp till servern.
6. Bildanalys av två kanal bilder
- Välj mjukvaran algoritmen att segmentera de primära objekt (kärnor, cytosol och aggregat) ( figur 7).
- Välj den metod som segmenterar atomkärnor exakt efter okulärbesiktning av segmenterade objekt. Hoechst-färgade objekt i kanal 1 (Ch1) används för att bestämma antalet celler. YFP färgningen från muterade SOD1-A4V i kanal 2 (Ch2) används för att fastställa beloppet för ballast.
- Räkna celler som använder den ' hitta nuclei ' algoritm som Hoechst-färgning regioner > 20 µm 2, med en split-faktor på 7,0, en individuell tröskel för 0,40 och en kontrast > 0,10.
- Skapa datatabellen och fastställa EG 50 för var och en av de föreningar som använder den ' icke-linjär regression ' ekvation i programvaran grafritande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genererar stabil cellinje med lentivirus: Den övergripande strategin för övervakning av SOD1 protein aggregat illustreras i figur 1. I ett första steg genererade vi en lentiviral uttryck vektor för SOD1 stabil gen leverans i cellinjer (steg 1). Två lentiviral vektorer kodning YFP-taggade SOD1 WT och SOD1 A4V (SOD1WT-YFP och SOD1A4V-YFP, respektive) med packning och kuvert plasmider utarbetades (figur 2A). Vid lentiviral transduction (steg 2) cellen förblev linjer testade (HEK-293, U2OS och SH-SY5Y) frisk, visade hög uttryck nivåer (figur 2B) och långsiktiga YFP märkning oberoende SOD1 form. Intressant, varken WT eller muterat SOD1 uttryckt i de tre cellinjer som visade synlig aggregering, i motsats till den övergående uttryck cellular-modellen tidigare testade11.
Validating stabil cell linjer för SOD1 aggregering och studera dess dynamiska: För att utlösa SOD1 sammanlagda bildandet på cellulära ackumulering av felveckning SOD1 mutant, vi använde proteasomhämmare ALLN (även kallad calpain I och II-hämmare; KI = 190 och 220 nM respektive), tidigare validerade med en övergående SOD1 uttryck cellular-modell11. SOD1 aggregering undersöktes med HEK-293, U2OS och SH-SY5Y cellinjer sensorik med SOD1WT-YFP och SOD1A4V-YFP. Behandling med proteasomhämmare ALLN (10 µM) för 24 timmar främjas starkt ackumulering av SOD1A4V-YFP aggregat i HEK-293 celler (figur 2 c). Dock hittades ingen aggregering i SOD1WT-YFP sensorik cellinjer och mycket låga nivåer av aggregation hittades i U2OS och SH-SY5Y cellinjer SOD1A4V-YFP sensorik SOD1WT-YFP och SOD1A4V-YFP (figur 2 c). Baserat på dessa iakttagelser, använde vi time-lapse mikroskopi att undersöka dynamiken i SOD1A4V-YFP aggregering bildandet induceras av proteasom hämning (steg 3, figur 3) och kvantifiera SOD1A4V-YFP aggregering med hjälp av en enda YFP fluorescens kanal att upptäcka uttrycker cellerna och aggregat i levande celler (Steg4, figur 4). Cellerna var seedad i närvaro och frånvaro av ALLN och övervakas under en period av 50 timmar (figur 5A). Under våra experimentella förhållanden hittade vi sammanlagda bildandet induceras av ALLN nått en platå på 24 timmar och varit stabil under de närmaste 12 timmarna. Vi visar att cell densiteten minskade signifikant efter 28 timmar till följd av den cytotoxiska effekten av ALLN, medan antalet celler ökade i DMSO-behandlade negativa experimentet.
Karaktärisering småmolekylära EG 50 för aggregering bildas med hjälp av SOD1 cell modell: Celler som uttrycker SOD1A4V-YFP behandlades på ett dosberoende sätt med liten molekyl proteasomhämmare. Vi använde en nukleär markör för att märka SOD1A4V-YFP cell linjen, vilket är fördelaktigt för sammanlagda upptäckt inom cytosol facket. Eftersom varje cell innehåller en kärna, genom segmentering atomkärnor och använda dem som frön i vattendelare segmentering av cellerna, faktiskt cytoplasman segmentering förenklade21. Vi brukade Hoechst färgning, som är känd har ingen toxicitet när de används under en kort sikt och på låga koncentrationer22, villkor som inte användes i tidigare tidsfördröjning imaging experiment. Efter 24 timmars cell odling i närvaro av proteasomhämmare, var SOD1A4V-YFP celler fläckad med Hoechst lösning (10 µg/mL) i 10 min. Nästa förvärvat vi fluorescens bilder för Hoechst och YFP använder ett 20 X 0,4 NA mål (steg 5, figur 6). Använda en bild analys algoritm som tar i beaktande av cellkärnor och SOD1A4V-YFP distribution, analyserades celler med hjälp av bild analys programvara (steg 6, figur 7). Hoechst-färgade objekt uppvisar lämpliga fluorescerande intensiteten ovan bakgrund och de morfologiska storlek som kännetecknar en atomkärnor (bredd, längd och area) identifierades och klassificeras av bild segmentering. Nukleära masken härrör från Hoechst färgning användes att spåra den proximala SOD1A4V-YFP spot fördelningen inom området cell cytosoliska och att fastställa närvaro eller frånvaro av aggregat. Baserat på identifiering av atomkärnor och ställen, beräknades förhållandet av aggregat upptäckt kontra celler. För att avgöra känsligheten i vår analys, vi nästa kvantifieras aggregering av SOD1A4V-YFP HEK-293 celler behandlas med tre olika proteasomhämmare (ALLN, MG132 och epoxomicin) i en dos koncentration sätt som aktiverat passande de kvantifierade uppgifter och Vi beräknade EG50 värden på 6,53 ± 1.17, 0.17 ± 0,06 och 0,03 ± 0,03 µM för ALLN, MG132 och epoxomicin, respektive (figur 8B). Den relativa toxiciteten för alla tre proteasomhämmare kvantifierades genom att mäta antalet vidhäftande celler kvar i brunnen märkt med Hoechst färgämne. Vi hittade att den totala cellantal tenderade att minska svar till sammansatta effekter, vilket framgår av liknande EG50 värden 6,58 ± 1.06, 0,19 ± 0,03 och 0,05 ± 0,01 µM för ALLN, MG132 och epoxomicin, respektive.
Figur 1. Arbetsflöde och tidslinjen för cellinje generation och hög innehållsanalys (HCA) protein aggregeringsnivå. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. SOD1 WT och A4V stabil linje generation.
(A) Schematisk bild av lentiviral och förpackningar vektorer (packning och omsluta plasmider) för vildtyp och muterat SOD1 A4V lentivirus generation. (B) valt confocal bilder av tre celler (HEK-293, U2OS och SH-SY5Y) sensorik med lentivirus vildtyp SOD1 (WT) och muterat SOD1 (A4V). (C) representativa bilder av tre stabila celler behandlas för 24 h med proteasom-hämmaren ALLN (10µM). SOD1A4V-YFP aggregat befanns vara rikligt (röda pilar) i HEK-293, men glest presentera i U2OS eller SH-SY5Y celler. Bilder förvärvades använder ett 20 X-objektiv. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4. De fyra steg som krävs för bildanalys av aggregation använder YFP kanal för att upptäcka celler och aggregat.
(1) importera bilder från systemet bild data lagring och analys. (2) Välj ”hitta celler” för att räkna celler. (3) Välj ”hitta ställen” att bestämma aggregat. (4) definiera resultat baserat på varje algoritm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Proteasom hämning leder till ackumulering av SOD1A4V-YFP aggregat i HEK-293 celler.
(A) valt confocal bilder av SOD1A4V-YFP HEK-293 celler behandlas med 10 µM av ALLN. (B) kvantitativ analys av aggregerade bildandet inducerad med ALLN (10µM) och blodkroppar i en tidsberoende sätt. Bilder förvärvades använder ett LWD 20 X mål varje 60 min. skala bar = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6. Skärmbild av den experimentella uppsättningen upp för tvåkanaligt förvärv (YFP och Hoechst). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. De fyra steg som krävs för bildanalys av SOD1 ballast och celler märkta med YFP och Hoechst.
(1) input bilder från systemet bild data lagring och analys. (2) Välj ”hitta nuclei” för att räkna celler. (3) Välj ”hitta ställen” att bestämma aggregat. (4) definiera resultat baserat på varje algoritm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8. Kvantitativ analys av SOD1 A4V aggregation och dosberoende proteasom-hämmare koncentration.
(A) presenterar här vi bilden och kvantifiering analysmetod för fläckar och cell räknar med hjälp av Columbus bild analys systemet. Bilder som motsvarar två fluorescerande kanaler som är specifika för Hoechst (Ch1) och YFP (Ch2) förvärvades sekventiellt. Hoechst-färgade objekt (vänster) identifierades genom bild segmentering. Nukleära masken (center) härrör från den ”hitta nuclei” algoritmen användes för att räkna antalet celler, följt av spot mask (höger) ”hitta ställen” algoritmen används för att upptäcka aggregat. (B) dos svar studie av den proteasomhämmare effekt på aggregering av muterade SOD1 A4V, som visar en variabel EG50 ranking från 6.53 µM, ALLN, 0.17 µM för MG132 och 0,03 µM för Expoxomicin. Valda confocal bilder av muterade SOD1 A4V behandlade proteasom vid EG50 koncentration. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns två huvudsakliga metoder för att generera stabil cellinjer. Först tar flera veckor och kräver övergående transfection och motstånd urval av genomisk integrerad plasmid DNA vektorer. Andra tar några timmar med hjälp av lentivirus, att göra detta protokoll kan bli föremål för effektiva uttrycket av målproteinet i flera cellinjer med begränsad ansträngning. RESA-CMV vektor19 var en ihållande vektor att använda, med bevarade transduktion effektivitet och stabil transgenens uttryck. Till vår förvåning visade de tre cellinjer som genereras ingen synlig aggregering muterade SOD1, i motsats till de experimentellt protokoll baserat på övergående uttryck beskrivs tidigare11. Det är troligt att övergående uttryck gynnar protein aggregering som den producerar högre proteinuttryck i en relativt kort tidsperiod. Vid övergående transfection når den ubiquitin-proteasomsystemet, vilket försämrar en majoritet av proteiner, en mättnad som är dess kapacitet att försämra aggregat-benägen proteiner utnyttjas fullt ut. Men vi hävdar att stabila linjer är mer benägna att återskapa fysiologisk situation där proteiner uttrycks på en relativt konstant nivå som matchar eliminering av felveckning protein via proteasomen, autophagosome-lysosomen, och exocytos. Även om de primära händelser som ledde till ALS är fortfarande okänd, är åldrande i samband med minskad aktivitet av ubiquitin-proteasomsystemet, en betydande riskfaktor23. Som illustreras av våra cellulära assay, främjar proteasom hämning aggregering av felveckning protein (SOD1 A4V). Som sådan, skapar denna analys nya möjligheter till skärmen för liten molekyl aktivatorer av den autofagi signalering utbildningsavsnitt eller förkläde nätverket. I själva verket denna aveny för förkläde induktion verkar lovande, vilket illustreras av rapporten från Kieran et al. visar att behandling med en samtidig inducerare av värme chock svar befanns ha terapeutiska fördelar genom att förlänga livslängden på SODG93A möss24.
Det är viktigt att nämna att det finns några fallgropar att överväga innan du använder denna analys. Som med protokollet assay optimering, hittade vi att koncentration av DMSO på 1% eller däröver ökar genomsnittliga intensiteten i den uppmätta YFP i vår analys. Det är därför viktigt att minska koncentrationen av DMSO till 0,5% till undvika någon sådan artefakt. Valet av linsen förstoringen och cell densiteten i assay plattan är dessutom viktigt att tänka på att optimera robustheten i analysen.
I vår studie har vi visat att lentiviral system med SOD1A4V-YFP HEK-293 cell raden är väl lämpad för övervakning muterade SOD1 A4V sammanlagda bildning vid induktion av proteasomhämmare. Studien av felveckning protein och aggregering är viktigt för att förstå mekanismerna bakom proteinopathies. Även om de forskningsverktyg för att analysera protein sammanläggning har utökats under de senaste decennierna, krävs effektiva metoder att påvisa och kvantifiera aggregering till skärmen molekyler som förbjuder sammanlagda bildandet. Detta arbete ger ett detaljerat protokoll för assay utveckling och studier av protein aggregation. Förhoppningsvis, bör detta arbete med stöd av HCS, HCA och användning av kemiska eller CRISPR/siRNA bibliotek öppna nya vägar för therapeutics eller roman läkemedelsutveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av ett bidrag som finansieras av den koreanska regeringen (MSIP) (NRF-2014K1A4A7A01074642), och National Research Foundation i Korea (NRF) enskilda forskare stöd programmet (NRF-2013M3A9B5076486/NRF-2015R1D1A1A09057239).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
| MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
| Epoxomicin (C28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
| Operetta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
| CyBi Hummingwell liquid handling | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |
References
- Schulte, J., Sepp, K. J., Wu, C., Hong, P., Littleton, J. T. High-content chemical and rnai screens for suppressors of neurotoxicity in a huntington's disease model. PLoS ONE. 6 (8), e23841 (2011).
- Honarnejad, K., et al. Development and implementation of a high-throughput compound screening assay for targeting disrupted ER calcium homeostasis in Alzheimer's disease. PLoS ONE. 8 (11), 1-12 (2013).
- Burkhardt, M. F., et al. A cellular model for sporadic ALS using patient-derived induced pluripotent stem cells. Mol Cell Neurosci. 56, 355-364 (2013).
- Mattiazzi, U., et al. High-Content Screening for Quantitative Cell Biology. Trends Cell Biol. 26 (8), 598-611 (2016).
- Kato, S. Amyotrophic lateral sclerosis models and human neuropathology: Similarities and differences. Acta Neuropathologica. 115 (1), 97-114 (2008).
- Strong, M. J., Kesavapany, S., Pant, H. C. The pathobiology of amyotrophic lateral sclerosis: a proteinopathy? J neuropathol exp neurol. 64 (8), 649-664 (2005).
- Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat rev Neurosci. 2 (11), 806-819 (2001).
- Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. Unraveling the Mechanisms Involved in Motor Neuron Degeneration in Als. Annu Rev Neurosci. 27 (1), 723-749 (2004).
- Vassall, K. a, et al. Decreased stability and increased formation of soluble aggregates by immature superoxide dismutase do not account for disease severity in ALS. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (6), 2210-2215 (2011).
- Hwang, Y. M., et al. Nonamyloid aggregates arising from mature copper/zinc superoxide dismutases resemble those observed in amyotrophic lateral sclerosis. J Biol Chem. 285 (53), 41701-41711 (2010).
- Kim, J., et al. Dimerization, Oligomerization, and Aggregation of Human Amyotrophic Lateral Sclerosis Copper/Zinc Superoxide Dismutase 1 Protein Mutant Forms in Live Cells. J Biol Chem. 289 (21), 15094-15103 (2014).
- Shaw, B. F., et al. Detergent-insoluble aggregates associated with amyotrophic lateral sclerosis in transgenic mice contain primarily full-length, unmodified superoxide dismutase-1. J Biol Chem. 283 (13), 8340-8350 (2008).
- Banci, L., et al. SOD1 and amyotrophic lateral sclerosis: Mutations and oligomerization. PLoS ONE. 3 (2), 1-8 (2008).
- Johnston, J. a, Dalton, M. J., Gurney, M. E., Kopito, R. R. Formation of high molecular weight complexes of mutant Cu, Zn-superoxide dismutase in a mouse model for familial amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci. 97 (23), 12571-12576 (2000).
- Niwa, J. I., et al. Disulfide bond mediates aggregation, toxicity, and ubiquitylation of familial amyotrophic lateral sclerosis-linked mutant SOD1. J Biol Chem. 282 (38), 28087-28095 (2007).
- Juneja, T., et al. Prognosis in familial amyotrophic lateral sclerosis: progression and survival in patients with glu100gly and ala4val mutations in Cu,Zn superoxide dismutase. Neurology. 48 (1), 55-57 (1997).
- Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. Mutant SOD1 mediated pathogenesis of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Gene. 577 (2), 109-118 (2016).
- de Bruyns, A., Geiling, B., Dankort, D. Construction of Modular Lentiviral Vectors for Effective Gene Expression and Knockdown. Methods Mol Biol. 1448, 3-21 (2016).
- Sirven, A. Enhanced Transgene Expression in Cord Blood CD34+-Derived Hematopoietic Cells, Including Developing T Cells and NOD/SCID Mouse Repopulating Cells, Following Transduction with Modified TRIP Lentiviral Vectors. Mol Ther. 3 (4), 438-448 (2001).
- Wu, C., Lu, Y. High-titre retroviral vector system for efficient gene delivery into human and mouse cells of haematopoietic and lymphocytic lineages. J gen virol. 91 (Pt 8), 1909-1918 (2010).
- Irshad, H., Veillard, A., Roux, L., Racoceanu, D. Methods for nuclei detection, segmentation, and classification in digital histopathology: A review-current status and future potential. IEEE Rev Biomed Eng. 7, 97-114 (2014).
- Purschke, M., Rubio, N., Held, K. D., Redmond, R. W. Phototoxicity of Hoechst 33342 in time-lapse fluorescence microscopy. Photochem Photobiol Sci. 9 (12), 1634-1639 (2010).
- Jaskova, K., Pavlovicova, M., Jurkovicova, D. Calcium transporters and their role in the development of neuronal disease and neuronal damage. Gen physiol biophys. 31 (4), 375-382 (2012).
- Kieran, D., et al. Treatment with arimoclomol, a coinducer of heat shock proteins, delays disease progression in ALS mice. Nat Med. 10 (4), 402-405 (2004).
