Summary
Nós descrevemos um método para quantificar a agregação de misfolded proteínas. Nossos detalhes de protocolo Lentivirus induzida por geração de linha celular estável, imagem latente confocal automatizada e análise de imagens de agregados de proteínas. Como uma aplicação ilustrativa, estudamos o efeito de pequenas moléculas na promoção da SOD1 agregação de maneira tempo e dose-dependente.
Abstract
Esclerose lateral amiotrófica (ela) é uma doença neurodegenerativa fatal que pode ser causada por mutações herdadas no gene codificação cobre-zinco superóxido dismutase 1 (SOD1). A instabilidade estrutural da SOD1 e a detecção de inclusões de SOD1-positivo em pacientes familiar-ALS suporta um potencial papel causal para SOD1 misfolded e/ou agregados em patologia de ALS. Neste estudo, descrevemos o desenvolvimento de um ensaio de baseada em célula projetado para quantificar a dinâmica da agregação de SOD1 em células vivas pelo alto teor de abordagens de triagem. Usando vetores Lentivirus, geramos linha celular estável expressam o tipo selvagem e mutante SOD1 A4V marcados com proteína fluorescente amarela e achei que ambas as proteínas foram expressos no citosol sem qualquer sinal de agregação. Curiosamente, apenas SOD1 A4V expressa estàvel em HEK-293, mas não em linhas de células U2OS ou SH-SY5Y, formaram agregados tratamento inibidor de proteossomo. Mostramos que é possível quantificar a agregação com base na análise de dose-resposta de vários inibidores do Proteassoma e para rastrear agregado-formação cinética por microscopia de lapso de tempo. Nossa abordagem introduz a possibilidade de quantificar o efeito das mutações ALS sobre o papel da SOD1 na formação de agregados, bem como a triagem para pequenas moléculas que impedem a agregação de SOD1 A4V.
Introduction
A agregação de proteínas é um processo biológico pelo qual misfolded grupo de proteínas acima e pode atuar como agentes causadores de doenças neurodegenerativas (amiloidose). Caracterizando a agregação da proteína é essencial compreender o papel dos agregados na disfunção celular, bem como facilitar a descoberta de novos fatores que influenciam o aparecimento da patologia. A visualização de proteínas fluorescência-etiquetadas em células vivas é um método poderoso que pode ajudar no desenvolvimento dos ensaios aplicáveis ao alto teor de triagem (HCS)1,2,3,4.
Esclerose lateral amiotrófica (ela) é considerada uma doença proteopathic causada pela presença de misfolded proteínas com a propensão para agregar e se acumulam nos neurônios motor tanto familiar ALS (fALS) e esporádicos ALS (Vanessa)5,6 . Um subconjunto de ~ 20% dos casos de fALS estão associados com mutações dominantes no gene que codifica a enzima antioxidante citosólica cobre-zinco superóxido dismutase tipo 1 (SOD1)7,8. Foram propostas várias possíveis causas para essa disfunção geneticamente derivada, incluindo alterações na estrutura e função da SOD1 variantes, tais como a estabilidade aberrante, desdobrando-se aumento da taxa e propensão a agregação9, 10. Notavelmente, a única propriedade verificada e potencialmente tóxica compartilhado por ambas as variantes ALS-lig SOD1 e selvagem-tipo (WT) SOD1 é uma maior propensão para formar agregados de proteína compartimentada ou inclusões proteicas11,12 . Misfolded mutante SOD1, persistentemente é polyubiquitinated e degradados pelo sistema ubiquitina-Proteassoma. Como resultado, um baixo nível de inibição da atividade do proteossomo leva ao acúmulo de mutante que SOD1 agrega13,14, quais estruturas de forma amorfa composta de componentes solúveis que podem trocar com solúvel mutante SOD1 no citosol15. Em particular, SOD1 mutante A4V (alanina no códon 4 mudada para valina) é a mutação mais comum causando o ALS e leva a neurodegeneração rápida com um tempo médio de sobrevivência de menos de 2 anos após o aparecimento de doença16. Bioquimicamente, A4V SOD1 tem uma tendência crescente para monomerizar, agregar e formar poros amiloides; seus agregados pore-como são semelhantes aos poros amiloides de outras formas de mutante ligado a doença, tais como synuclein-α e β-amiloide proteína17. Para estudar a dinâmica da acumulação de SOD1-agregado, métodos para monitoramento solúveis e insolúveis SOD1 formas agregadas continuam a ser desenvolvidos.
Temos mostrado anteriormente, usando a imagem latente da viver-pilha e células HEK-293 transitoriamente transfected com fluorescente com tag proteína SOD1, que mutações associadas ALS prejudicam SOD1 dimerização e agregação11. Embora a expressão transiente sistemas podem fornecer informações úteis sobre o resultado biológico de curto prazo superexpressão do gene, métodos proporcionando integração estável de genes desejados podem ser preferenciais para o desenvolvimento do ensaio. Como tal, vetores de Lentivirus oferecem a capacidade de conferir a expressão do gene a longo prazo e regulamentado em células de mamíferos 18. Neste estudo, enfocamos a geração de linhas de células estáveis transfectadas com recombinante lentivirus rolamento WT e mutante SOD1 marcou com proteína fluorescente amarela (YFP). Usando microscopia da imagem latente de viver-pilha e quantificação automatizada de agregação de SOD1, desencadeada e quantificada eventos de agregação SOD1 mediante inibição da Proteassoma.
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Protocol
1. produção de lentivirus
Nota: A produção e manipulação de vetores Lentivirus foi realizado de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health (NIH) para pesquisas envolvendo recombinante DNA. A codificação de plasmídeo o selvagem-tipo e A4V mutante SOD1 marcados com YFP reforçada (YFP-SOD1WT e SOD1A4V-YFP) são descritos em Kim et al. 11 ambos os produtos de fusão do gene foram amplificados usando o par de primer PCR 5 ′ - ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC - 3 ′ e 5 ′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3 ′ e inserido o CMV de U3 pTRIP-delta plasmídeo 19 usando sites de restrição XhoI e BsrGI. Em experimentos anteriores, as células HEK-293T foram divididas em uma proporção de 1:4 a 1:6 em dois dias. Evasão de mais de 20 passagens e manutenção de células em menos de 60% confluencia ajuda para garantir a eficiência de transfeccao bom.
- No dia 1, dividir células HEK-293T na confluência de 30-40% em uma placa de cultura de tecido de 10 cm de diâmetro (3 x 10 6 células/prato) em 10 mL de meio de cultura celular (alta-glicose DMEM com 10% FBS e 4 mM L-glutamina) para a produção de vírus.
- Manter a cultura de tecido de 10 cm de diâmetro da placa numa incubadora de CO 2 (37 ° C, 5% CO 2) durante a noite.
- No dia 2, preparar uma solução de Transfeccao de DNA contendo 10 µ g de Lentivirus vetores (pTRIP-delta U3 CMV - YFP-SOD1WT ou - SOD1A4V-YFP) juntamente com as Particulas de Lentivirus de empacotamento (plasmídeos (5 µ g de pVSVg; 10 µ g de pCMV-dR8.71) Figura 2A) 20. Adicionar 125 µ l de 1 M CaCl 2 e ajustar o volume para 500 µ l com água destilada. Acrescente 500 µ l de 0,05 M de HEPES na mistura e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.
- Substituir HEK-293T médio com 10 mL pré-aquecido cultura meio fresco sem antibióticos misturado com 1 mL de solução de transfeccao DNA de células e incubar durante uma noite a 37 ° C, 5% de CO 2.
- No dia 3, substituir a célula sobrenadante com meio de cultura fresco.
- No dia 4, recolher o sobrenadante em um tubo de 15 mL e centrifugar durante 5 min à 500g x para remover as células mortas e detritos. Purifica ainda mais o sobrenadante por passagem através de um filtro de 0,45 µm, utilizando uma seringa de 60ml grande. Imediatamente dispensar em alíquotas de uso único (300 µ l) e armazenar a-80 ° C. Para manter a atividade máxima do produto, evitar um ciclo de congelamento-descongelamento.
2. Transdução de Lentivirus
- dividir a linha celular infectada, na confluência de 60% (células HEK-293 e SH-SY5Y; 5 x 10 5 células por bem e U2OS; 1 x 10 5 células por poço) em uma placa de cultura de tecidos de 6-poços em 2 mL de mídia DMEM suplementada com 10% FBS.
- Manter a placa de cultura de tecidos de 6-poços em uma incubadora de 37 ° C em 5% CO 2 durante a noite.
- Retire os lentivirus congelados do freezer-80 ° C e descongelar uma alíquota no gelo antes de cada utilização; não recongelar.
- Enquanto o vírus está descongelando, aquecer o meio de cultura celular contendo o soro compatível com a linha de células de interesse. Uma vez que o vírus é totalmente descongelado, preparar uma série de diluições (1:3, 01:10, 01:30 e 1: 100) em DMEM em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Trazer o volume nos tubos de 1 mL com mídia de soro reduzida.
- Adicionar 2 µ l de Polybrene (em um estoque de 4 µ g / µ l) a 1 mL de vírus/mídia. Misture bem por pipetagem e adicione 1 mL da mistura para as células. Incubar as células com o vírus por 24 h.
- Remover a mídia de vírus e substituir com mídia DMEM normal suplementada com 10% FBS. Manter as células a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Monitorar o crescimento das células e alterar os meios de cultura em dois dias. Na confluência, expandir o prato 6-poços em uma placa de cultura de tecido de 10 cm de diâmetro.
- , Uma vez que as células têm sido suficientemente expandidas, células de 4 sementes 1.5 x 10 por bem em 50 µ l de mídia DMEM em placas de ensaio 384-bem para verificar o nível de expressão da YFP etiquetado proteína por microscopia. Se a YFP tagged proteína celular expressão mostra uma relação sinal-ruído ≥ 3, preparar o estoque de célula para a correspondente linha de celular.
3. Tempo de efeito dependente do inibidor de proteossomo na agregação da proteína
Nota: realizar a aquisição de imagens usando um microscópio automatizado (ver materiais).
- Dispensar 0,25 µ l de DMSO ou Proteassoma inibidor dissolvido em 100% DMSO (fixador, 2mm) em placas de fundo plano 384-bem. Mídia
- manualmente semente 1.5 x 10 4 células por poço em 50 µ l de DMEM no mesmo ensaio de placa. A concentração final de proteossomo inibidor (fixador) deve ser de 10 µM.
- Configurar a unidade de controle ambiental do sistema de microscópio a 37 ° C e 5% de CO 2. Uma imagem da instalação experimental é mostrada na Figura 3.
- Operar o microscópio em modo de fluorescência de campo largo, usando o software com as seguintes configurações: LWD 20 X objetivo, modo non-confocal, 4 campos/bem, com um intervalo de captura de uma hora. No final de cada corrida, as imagens capturadas são automaticamente enviadas para o servidor.
4. Tempo de imagem lapso para expressão YFP em células vivas e análise (canal único) da imagem
Nota: as etapas a seguir descrevem a aplicação do software (por exemplo, Colombo).
Algoritmo de- selecionar o apropriado para segmentar os objetos primários (citosol e agregados). Se necessário, ajustar parâmetros limite e o contraste de fundo ( Figura 4).
- Contagem de células usando ' encontrar células ' com um limiar individual de 0,1 para o canal de intensidade YFP. Determinar agregados usando uma ' encontrar pontos ' algoritmo com uma intensidade relativa de ponto YFP > 0.2 e um coeficiente de divisão de 1.0.
5. Efeito de resposta de inibidores do Proteassoma na agregação de proteínas em células vivas coradas para seus núcleos (dois canais) de dose
Nota: realizar a aquisição de imagens usando um microscópio automatizado. Determinar o intervalo de concentração de inibidores do Proteassoma (fixador, Epoxomicin e MG132) baseado no IC 50 valor esperado para garantir um ajuste de curva ideal.
- Preparar diluições em série de compostos em polipropileno um armazenamento 384-poço da placa pela norma série de diluição de 1:3. Certifique-se de misturar as diluições compostas bem para garantir que as concentrações de compostos são precisas.
- Dispensar 0,25 µ l de inibidores do Proteassoma em placas de ensaio vazio de 384-bem preto de fundo plano. Nós usamos um manipulador líquido equipado com uma cabeça de 384-capilar capaz de transferir volumes.
- Sementes de 1,5 x 10 4 células por poço em 50 µ l de DMEM Media em placas de ensaio. Incubar as placas de ensaio em 37 ° C e 5% CO 2 por 24 h.
- Adicionar 10 µ l de DMEM Media (pré aquecido a 37 ° C), com coloração de solução (Hoechst 33342 em um estoque de 10 mg/mL) e incubar a temperatura ambiente por 10 min.
- Lançar a microslidar o software operacional. Uma imagem da instalação experimental é mostrada na Figura 6. Selecione o " configuração " guia e selecione 20 X objetivo e o tipo de placa correta. Certifique-se de " colar " é definido como o valor correto no objectivo permitindo foco adequado com tipos diferentes de placa.
- Selecione o " microscópio " Tab. definir exposição 1 como YFP (488 laser) e exposição 2 como Hoechst (laser 405). Ativar o filtro em ambas as exposições e atribuir a exposição 1 a câmera 1 e 2 de exposição a câmera 2. Conjunto de tempos de exposição para ~ 800 ms para exposição 1 e ~ 40 ms para exposição 2. Exposição de
- select 1. Definir a altura de foco a 0 µm. Select " foco ". Uma vez focado, exponha a câmara 1. Ajustar a altura do foco para otimizar o avião de exposição e clique no " tomar altura ". Alterar os tempos de exposição e poder dar uma intensidade máxima de pixel de ~ 3.000 laser. Salve os parâmetros de exposição. Repita para exposição 2.
- Select " definição de experimento " Tab criar um layout e sublayout. Arraste e solte o layout relevante, exposição, imagem de referência, o arquivo skewcrop e sublayout. Salvar o experimento.
- Select " experimento automático " guia e adquirir imagens. No final de cada corrida, as imagens capturadas são automaticamente enviadas para o servidor.
6. Análise de duas imagens de canal de imagem
- selecionar o algoritmo de software para segmentar os objetos primários (núcleos, citoplasma e agregados) ( Figura 7).
- Selecione o método que segmentos núcleos com precisão por inspeção visual dos objetos segmentados. Objetos Hoechst-manchado no canal 1 (Ch1) serão usados para determinar o número de células. A coloração YFP de mutante SOD1-A4V no canal 2 (Ch2) será usado para determinar a quantidade de agregados.
- Contagem de células usando o ' encontrar núcleos ' algoritmo como regiões Hoechst-coloração > 20 µm 2, com um fator de divisão de 7.0, um limiar individual de 0,40 e um contraste > 0,10.
- Criar a tabela de dados e determinar CE 50 para cada um dos compostos usando a ' regressão não-linear ' equação no gráfico software.
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Representative Results
Gerar a linha de celular estável usando lentivirus: A estratégia global para o monitoramento de agregados de proteína SOD1 é ilustrada na Figura 1. Em uma primeira etapa, geramos um vetor de Lentivirus expressão para entrega de estável do gene SOD1 em linha de celular (etapa 1). Dois vetores Lentivirus codificação YFP-tag SOD1 WT e SOD1 A4V (YFP-SOD1WT e SOD1A4V-YFP, respectivamente) com embalagem e envelope plasmídeos foram preparados (Figura 2A). Em cima de transdução Lentivirus (etapa 2) a célula linhas testado (HEK-293, U2OS e SH-SY5Y) manteve-se níveis saudáveis, mostrou alta expressão (Figura 2B) e a longo prazo YFP rotulagem independentemente da forma de SOD1. Curiosamente, WT nem mutante SOD1 expressado nas linhas de três células que mostrou agregação visível, em contraste com o modelo de celular expressão transiente previamente testados11.
Célula estável Validating linhas para agregação de SOD1 e estudar a sua dinâmica: Para disparar a formação de agregados SOD1 mediante acumulação celular de misfolded SOD1 mutante, usamos inibidor de proteossomo fixador (também chamado Calpaína I e inibidor II; Ki = 190 e 220 nM, respectivamente), previamente validada usando um transiente SOD1 expressão celular modelo11. Agregação de SOD1 foi examinada com HEK-293, U2OS e SH-SY5Y linhas de células transfectadas com YFP-SOD1WT e SOD1A4V-YFP. Tratamento com inibidor de proteossomo fixador (10 µM) para 24 horas fortemente promovido a acumulação dos agregados de SOD1A4V-YFP em células HEK-293 (Figura 2). No entanto, nenhuma agregação foi encontrada em SOD1WT-YFP transfectada linhas celulares e níveis muito baixos de agregação foi encontrado em U2OS e SH-SY5Y linhas de células SOD1A4V-YFP transfectadas YFP-SOD1WT e SOD1A4V-YFP (Figura 2). Baseia-se estas observações, utilizamos microscopia de lapso de tempo para investigar a dinâmica de formação de SOD1A4V-YFP agregação induzida pela inibição do Proteassoma (etapa 3, Figura 3) e quantificar a agregação de SOD1A4V-YFP usando uma única fluorescência YFP canal para detectar as células expressando e agregados em células vivas (etapa 4, Figura 4). Células foram semeadas na presença e na ausência de fixador e monitoradas por um período de 50 horas (Figura 5A). Nas nossas condições experimentais, encontramos a formação de agregação induzida pelo fixador alcançado um platô em 24 horas e manteve-se estável nas próximas 12 horas. Mostramos que a densidade celular diminuiu significativamente após 28 horas como resultado o efeito citotóxico do fixador, enquanto célula multiplicaram-se na experiência negativa DMSO-tratados.
Characterizing pequena molécula CE 50 para formação de agregação usando SOD1 celular modelo: Células expressando SOD1A4V-YFP foram tratadas de forma dose-dependente com inibidores do Proteassoma pequena molécula. Usamos um marcador nuclear para rotular a linha celular YFP-SOD1A4V, que é vantajosa para a deteção de agregação dentro do compartimento do citosol. Com efeito, uma vez que cada célula contém um núcleo, por segmentar os núcleos e usá-los como sementes em segmentação de bacia hidrográfica das células, segmentação de citoplasma é simplificado21. Nós costumávamos Hoechst coloração, que é sabido para ter nenhuma toxicidade quando usada por um período de curto prazo e em baixas concentrações22, condições que não foram utilizados no lapso de tempo anterior experiência de imagem. Após 24 horas de cultivo de células na presença de inibidores do Proteassoma, células SOD1A4V-YFP foram coradas com solução de Hoechst (10 µ g/mL) por 10 min. Em seguida, adquirimos imagens de fluorescência para Hoechst e YFP usando um objectivo de at 20 X 0.4 (etapa 5, Figura 6). Usando um algoritmo de análise de imagem que leva em conta o núcleo de células e distribuição SOD1A4V-YFP, células foram analisadas utilizando o software de análise de imagem (etapa 6, Figura 7). Objetos Hoechst-manchado, exibindo a intensidade fluorescente apropriada acima o fundo e as características morfológicas do tamanho de um núcleo (largura, comprimento e área) foram identificados e classificados por segmentação de imagens. A máscara nuclear derivada Hoechst coloração foi usada para controlar a distribuição de SOD1A4V-YFP proximal local dentro da área de célula citosólico e para determinar a presença ou ausência de agregados. Baseado na deteção de núcleos e manchas, calculou-se uma proporção de agregados detectado contra células. Para determinar a sensibilidade do nosso ensaio, em seguida quantificado agregação de células SOD1A4V-YFP HEK-293 tratados com três inibidores do Proteassoma diferentes (fixador, MG132 e epoxomicin), de forma dose de concentração, que permitiu a montagem os dados quantificados e Calculamos a valores de50 CE de 6,53 ± 1,17, 0,17 ± 0,06 e 0,03 ± 0,03 µM para fixador, MG132 e epoxomicin, respectivamente (Figura 8B). A toxicidade relativa para todos os três inibidores de proteossomo foi quantificada pela medição do número de células aderentes, permanecendo no poço rotulado com corante Hoechst. Nós achamos que o número total de células tende a diminuir em resposta aos efeitos compostos, como evidenciado por valores semelhantes de50 CE de 6.58 ± 1,06, 0,19 ± 0,03 e 0,05 ± 0,01 µM para fixador, MG132 e epoxomicin, respectivamente.
Figura 1. Fluxo de trabalho e cronograma para celular-linha a geração e análise de conteúdo elevado (HCA) de agregação da proteína. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. SOD1 WT e geração de A4V linha estável.
(A) diagrama esquemático de vetores Lentivirus e embalagens (embalagem e envelope plasmídeos) para geração de lentivirus tipo selvagem e mutante SOD1 A4V. (B) selecionei imagens confocal de três células (HEK-293, U2OS e SH-SY5Y) transfectadas com o tipo selvagem de lentivirus SOD1 (WT) e mutante SOD1 (A4V). (C) imagens representativas das três células estáveis trataram durante 24 h com o inibidor de proteossomo, fixador (10). Agregados de SOD1A4V-YFP foram encontrados para ser abundantemente presente (setas vermelhas) em HEK-293, mas escassamente presente nas células U2OS ou SH-SY5Y. Imagens foram adquiridas utilizando um objectivo X 20. Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. As quatro etapas necessárias para a análise de imagem de agregação usando o canal YFP para detectar células e agregados.
(1) importar imagens do sistema de armazenamento e análise de dados imagem. (2) selecione "Pesquisar células" para a contagem de células. (3) selecione "encontra pontos" para determinar agregados. (4) defina resultados com base em cada algoritmo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Inibição do Proteassoma levando ao acúmulo de agregados de SOD1A4V-YFP em células HEK-293.
(A) selecionado imagens confocal de células SOD1A4V-YFP HEK-293 tratadas com 10 µM de fixador. (B) análise quantitativa da formação de agregação induzida com fixador (10) e contagens de células em uma maneira tempo-dependente. Imagens foram adquiridas utilizando um objectivo LWD 20 X cada 60 min. escala barra = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Tiro do conjunto experimental de tela acima para dois canais de aquisição (YFP e Hoechst). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. As quatro etapas necessárias para a análise de imagem de agregados de SOD1 e células marcadas com YFP e Hoechst.
(1) imagens de entrada do sistema de armazenamento e análise de dados imagem. (2) selecione "Pesquisar núcleos" para a contagem de células. (3) selecione "encontra pontos" para determinar agregados. (4) defina resultados com base em cada algoritmo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8. Análise quantitativa de SOD1 A4V agregação e concentração de inibidor de proteossomo dose-dependente.
(A) aqui nós apresentamos a imagem e método de análise de quantificação para manchas e célula conta usando o sistema de análise de imagem de Colombo. Imagens correspondentes a dois canais fluorescentes específicos para Hoechst (Ch1) e YFP (Ch2) foram adquiridos sequencialmente. Hoechst-manchado (à esquerda) objetos foram identificados pela segmentação de imagens. A máscara nuclear (centro), derivada do algoritmo "encontrar núcleos" aplicou-se para contar o número de células, seguido pelo ponto máscara (à direita) "encontrar pontos" algoritmo usado para detectar agregados. (B) estudo de resposta de Dose de efeito dos inibidores do Proteassoma na agregação de mutante SOD1 A4V, que mostra um ranking de50 CE variável de 6,53 µM, fixador, 0.17 µM para MG132, e 0,03 µM para Expoxomicin. Selecionei imagens confocal de mutante SOD1 A4V tratados Proteassoma em concentração de50 CE. Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Existem duas abordagens principais para a geração de linhas de células estáveis. A primeira leva várias semanas e requer seleção transitória do transfection e resistência dos vetores de DNA genômico de plasmídeo integrado. A segunda leva a uma questão de horas através do uso de lentivirus, tornando este protocolo favorável para a efetiva expressão da proteína do alvo em várias linhas de célula com esforço limitado. A viagem-CMV vector19 foi um vetor sustentado de usar, com eficiência de transdução conservada e expressão do transgene estável. Para nossa surpresa, as linhas de três célula geradas mostraram nenhuma agregação visível do mutante SOD1, em contraste com o protocolo experimental baseado na expressão transiente descrito anterior11. É provável que expressão transiente favorece a agregação da proteína que produz maior expressão de proteínas em um período relativamente curto de tempo. Em cima do transfection transiente, o sistema ubiquitina-Proteassoma, que degrada a maioria das proteínas, atinge um ponto de saturação em que sua capacidade de degradar proteínas propensas a agregação é totalmente utilizada. No entanto, podemos afirmar que linhas estáveis são mais propensos a reproduzir a situação fisiológica em que as proteínas são expressas em um nível relativamente constante, que coincide com a eliminação de misfolded proteínas através da Proteassoma, autophagosome-lisossoma e exocitose. Embora os eventos primários, levando a ALS ainda são desconhecidos, envelhecimento em conexão com a diminuição da atividade do sistema proteossomo de ubiquitina, é um fator de risco significativo de23. Conforme ilustrado por nosso ensaio celular, inibição do Proteassoma promove a agregação de misfolded proteínas (SOD1 A4V). Como tal, este ensaio cria novas oportunidades para a tela para ativadores pequena molécula da autofagia sinalizando o caminho ou a rede de acompanhante. De fato, esta avenida para indução de acompanhante parece promissor, como ilustrado no relatório de Kieran et al . mostrando que o tratamento com um indutor co do calor resposta de choque foi encontrada para ter benefícios terapêuticos, estendendo a vida útil do SODG93A os ratos24.
É importante mencionar que existem algumas armadilhas para considerar antes de usar este ensaio. Tal como acontece com o protocolo de otimização do ensaio, encontramos que as concentrações de DMSO em 1% ou acima aumenta a intensidade média da YFP medido no nosso ensaio. Portanto, é importante reduzir a concentração de DMSO para 0,5% para evitar qualquer tal artefato. Além disso, a seleção de ampliação da lente e densidade de pilha na placa de ensaio são importantes a considerar para otimizar a robustez do ensaio.
Em nosso estudo, mostramos que utiliza um sistema de particulas de Lentivirus linhagem celular SOD1A4V-YFP HEK-293 é bem adequada para monitoramento mutante SOD1 A4V formação agregada após indução por inibidores do Proteassoma. O estudo de misfolded proteínas e agregação é essencial para compreender os mecanismos da proteinopathies. Embora as ferramentas de pesquisa para analisar a agregação da proteína expandiram-se nas últimas décadas, abordagens eficientes para detectar e quantificar a agregação são obrigadas a moléculas de tela que proíbem a formação de agregados. Este trabalho fornece um protocolo detalhado para desenvolvimento de ensaio e estudos de agregação da proteína. Espero que, com o apoio de HCS, HCA e uso de produto químico ou bibliotecas CRISPR/siRNA, este trabalho deve abrir novos caminhos para a descoberta de alvo terapêutica ou romance.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por um fundo financiado pelo governo coreano (MSIP) (NRF-2014K1A4A7A01074642) e o programa de apoio à pesquisa nacional Fundação da Coreia (NRF) cientista individual (NRF-2013M3A9B5076486/NRF-2015R1D1A1A09057239).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
| MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
| Epoxomicin (C28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
| Operetta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
| CyBi Hummingwell liquid handling | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |
References
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