Isolering av dendrittiske celler fra den menneskelige kvinnelige skjede for Phenotypical og funksjonelle studier
Summary
Her beskriver vi en metode for å isolere og rense dendrittiske celler fra ulike anatomiske rom i den menneskelige kvinnelige skjede for vurdering av deres phenotypical og funksjonelle egenskaper. Denne metoden kan tilpasses å isolere andre immunceller eller dendrittiske celler fra andre mucosal vev.
Abstract
Karakterisering av de menneskelige dendrittiske cellene (DCs) bosatt i slimhinnene vev er utfordrende på grunn av vanskelighetene med å få prøver det lave antallet DCs presentere per vev. Likevel, som fenotypen og funksjon av DCs endres av vev miljøet, er det nødvendig å analysere vev bosatt DC befolkninger, siden blod avledet DCs ufullstendig reflekterer kompleksiteten i DCs i vev. Her presenterer vi en protokoll for å isolere DCs fra den menneskelige kvinnelige skjede (FRT) bruker hysterektomi prøver som gjør at både phenotypical og funksjonell analyser. Protokollen består av vev fordøyelsen å generere en enkeltcelle mikset celle suspensjon, etterfulgt av positiv magnetiske perlen valg. Vårt vev fordøyelsen protokollen ikke cleave overflate markører, som lar phenotypical og funksjonell analyse av DCs i steady state, uten overnatting inkubasjon eller celle aktivering. Denne protokollen kan tilpasses for isolering av andre immun celletyper eller isolering av DCs fra andre vev.
Introduction
FRT har dobbelt funksjonen beskytter mot patogener mens implantasjon og graviditet1. Dette compartmentalized FRT, med hver anatomiske region viser unike histologiske, immunologiske og funksjonelle egenskaper1.
DCs tilstede på slimhinnene overflater gjøre kontakt med mikrober i lungene, tarmen og genital tract og gi immun overvåking for potensielle patogener2. DCs har unike prime naiv T-celler og utløse adaptive immunreaksjoner3. DCs i FRT er også spesialiserte for å tolerere utenlandske antigener, som finnes i sæden og fosteret, slik at vellykket graviditet4. Derfor av blir DC fenotypen og funksjonen tydelig. Det er kjent at DCs er sterkt påvirket av vev miljø, slik at deres tall, fenotype og funksjoner er endret av vev miljøet der de bor3. Derfor, for å forstå rollen som FRT DCs spille i infeksjonssykdommer, graviditet og kreft i FRT, bosatt DCs må studeres, siden blod avledede DC modeller er utilstrekkelig til å adressere regulatoriske kompleksiteten i FRT vev.
Karakterisering av menneskelig vev bosatt DCs er utfordrende på grunn av det lave antallet celler i slimhinnene vev og problemer med å skaffe menneskelige vevsprøver. DCs har vært studert i FRT bruker immunohistochemistry5,6, som informerer om celleplassering i vevet, men utelukker funksjonelle studier, og er begrenset i antall identifisere cellen indikatorer som kan analyseres samtidig. Videre har enkeltcelle isolasjon protokoller for flyt cytometric analyse vært utviklet7,8,9. Noen av disse protokollene utnytte vandrende kapasiteten til DCs isolere celler som overfører. Disse metodene vanligvis krever overnatting incubations og utvalg av aktivert DCs, men tillater ikke for studiet av DCs i steady state.
Her bruker hysterektomi prøver, vi optimalisert en protokoll for å isolere DCs fra ulike anatomiske steder i FRT, endometrium (EM), i livmorhalsen (CX) og ectocervix (ECX), som gjør at både phenotypical og funksjonell analyser. Bruker en ikke-proteolytisk enzymatisk fordøyelsen protokoll, kan vi fortsette umiddelbart etter vev fordøyelsen til celle isolasjon og flow cytometric karakterisering uten celle aktivering. Bruker multicolor flowcytometri og tilpasse funksjonelle studier for lavt antall celler, kan vi identifisere og karakterisere sjeldne delsett av DCs i de ulike nettstedene i FRT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Slimhinnene DCs er en sjelden celle befolkning sterkt påvirket av vev miljøet, som endrer deres fenotypen og funksjon når de skriver vev3. Mens blod avledet DCs er en meget nyttig modell, de representerer ikke fullt mangfoldet av DC bestander funnet i vev. Derfor, for å forstå de unike egenskapene til mucosal DCs, isolering av primære celler fra vev er nødvendig. Isolering av DCs fra ulike anatomiske steder i FRT tilbyr muligheten til å studere DC funksjon i vitro og sammenligne m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien støttes av NIH gir AI102838 og AI117739 (CRW). Vi takker Richard Rossoll for teknisk assistanse. Flyt cytometric analyse ble gjennomført i DartLab, den delte ressursen på Dartmouthsupported av (P30CA023108-37) og (P30GM103415-15).
Materials
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Hyclone | SH30015.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| HEPES (1M) | Hyclone | 15630-080 | |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical | LS002140 | |
| D-glucose | Sigma Aldritch | 50-99-7 | |
| 0.22 um Stericup 500 mL filter | Millipore | SCGPU05RE | |
| 100mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| 150mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875714 | |
| 150mm x 25mm polystyrene dish | Corning | 430599 | Treated cell culture dish |
| Isotemp Incubator | Fisher Scientific | FICO3500TABB | 5.0% CO2 |
| American Rotator V | American DADE | R4140 | |
| 250 um nylon mesh | Sefar | 03-250/50 | |
| 20 um nylon mesh | Sefar | 03-20/14 | |
| Beckman GS-6R Centrifuge | Beckman | 358702 | |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | Lonza | 04-418Q | |
| Human AB Serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldritch | 10771 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | pH 7.4 |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Pre-separation filter (30um) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-410 | |
| Quadro MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS multi-stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| EDTA | USB | 15694 | |
| CD1a Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-051-001 | |
| CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| eFluor 670 cell proliferation dye | eBiosciences | 65-0840-85 | |
| 96 well round bottom plate | Falcon | 9/8/2866 | |
| Zombie yellow viability dye | Biolegend | 423104 | |
| CD3 APC/Cy7, anti-human | Tonbo Biosciences | 25-0038-T100 | |
| CD4 PE, anti-human | eBiosciences | 12-0048-42 | |
| CD8a FITC, anti-human | Tonbo Biosciences | 35-0086-T100 | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter Life Sciences | B43618 | 10 color, VBR |
| MACSquant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | 8 color, VBR |
References
- Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract. Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
- Tagliani, E., Erlebacher, A. Dendritic cell function at the maternal-fetal interface. Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).
- Kaldensjo, T., et al. Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection. PLoS One. 6 (6), e21344 (2011).
- Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle. Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).
- Ballweber, L., et al. Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells. J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).
- Hladik, F., et al. Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1. Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).
- Duluc, D., et al. Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses. Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).
- Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. J Vis Exp. (89), (2014).
- Givan, A. L., et al. Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina. Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).
- Rodriguez-Garcia, M., et al. Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV. Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).
- Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract. Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).
- Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues. Am J Reprod Immunol. , (2017).
