Summary
I nuværende undersøgelse, vi beskriver en metode til at analysere C924T genotype. Protokollen består af tre faser: DNA-ekstraktion, forstærkning af Polymerasekædereaktionen (PCR) og analyse af begrænsning fragment længde polymorfisme (RFLP) på agarosegel.
Abstract
Tromboxan A2 receptor (TBXA2R) genet er medlem af G-protein koblet superfamilien med syv-transmembrane regioner. Det er involveret i atherogenesis progression, iskæmi, og myokardieinfarkt. Her præsenterer vi en metode for patient genotypebestemmelse at undersøge C924T-polymorfisme (rs4523) beliggende på regionen 3' af TBXA2 receptor genet post-transcriptional rolle. Denne metode er baseret på DNA-ekstraktion fra fuldblod, polymerase kædereaktion (PCR) forstærkning af TBXA2 gen del indeholdende C924T mutation, og identifikation af vildtype og/eller mutant genotyper ved hjælp af en begrænsning digest analyse, specifikt en restriktion fragment længde polymorfisme (RFLP) på Agarosen gel. Derudover blev resultaterne bekræftet af sekventering TBXA2R genet. Denne metode har flere potentielle fordele, såsom høj effektivitet og hurtig identifikation af C924T polymorfi af PCR og begrænsning enzym analyse. Denne tilgang giver mulighed for en intelligent undersøgelse for plak dannelse og åreforkalkning progression ved at analysere patient genotyper for TBXA2R C924T-polymorfisme. Anvendelsen af denne metode har potentiale til at identificere emner, der er mere modtagelige for aterotrombotiske processer, i bestemte fag i et højrisiko, aspirin-behandlede gruppe.
Introduction
TBXA2R er medlem af G-protein koblet superfamilien med syv-transmembrane regioner, som er bredt udtrykt og lokaliseret cellemembraner eller på intracellulære strukturer1,2. TBXA2R signalvejen er involveret i avanceret aterosklerotisk processer3. Øget udtryk for TBXA2 receptoren var dokumenteret under atherogenesis progression og kliniske og eksperimentelle undersøgelser viste sin relevant rolle i iskæmi og myokardieinfarkt4. C924T, en enkelt nukleotid polymorfisme (SNP) af TBXA2R-genet, blev anerkendt som en funktionel polymorfi i raske frivillige og har været forbundet med kliniske lidelser5. Desuden, vores tidligere undersøgelse6 demonstreret at C924T polymorfi af TBXA2R-genet er involveret i afskriften stabilitet; specifikt, er der en øget ustabilitet af mutant (TT) type afskriften med hensyn til vildtype (CC). Derudover induceret flere stimuli som adenosin ud (ADP), adrenalin og kollagen i forskellige koncentrationer en trombocytaggregation mindre effektiv for den mutante type (TT). Dette er i overensstemmelse med en reduceret blodprop dannelse og hæmostase. Således kan ustabilitet i TBXA2R udskrift og den dermed forbundne reduktion af trombocytaggregation være forbundet med en beskyttende rolle for TBXA2R TT genotype mod atherothrombosis og dens komplikationer i højrisiko aspirin-behandlede patienter6 .
Her, beskriver vi en metode til patient genotypebestemmelse at undersøge C924T polymorfisme (rs4523) beliggende på regionen 3' af TBXA2 receptor genet post-transcriptional rolle. Denne metode bygger på følgende trin: (1) DNA-ekstraktion fra fuldblod, (2) PCR-amplifikation af TBXA2R gen del indeholdende C924T mutation, og (3) identifikation af vildtype og/eller mutant genotyper ved hjælp af begrænsning fragment længde polymorfisme (RFLP) på agarosegel. RFLP er en teknik, der udnytter variationer i homologe DNA sekvenser7. Denne ansøgning blev brugt til at påvise DNA polymorfier, især SNPs, og til at finde og knytte biologisk relevans i genetiske variationer8. Polymorfi analyseret for første gang ved hjælp af RFLP-PCR hos mennesker var ABO blod9. RFLP-PCR-metoden giver mulighed for analyse af genetiske mutationer i homologe DNA sekvenser ved at vurdere tilstedeværelsen af fragmenter af forskellige længder efter DNA fordøjelsen ved hjælp af meget specifikke restriktionsendonukleaser10.
I sidste år, de følgende metoder har været udnyttet til SNP analyse ved hjælp af PCR teknik: hybridisering af korte allel-specifik oligonukleotider11, allel-specifik PCR12, primer udvidelse på DNA microarrays13, oligonukleotid ligatur assay14, direkte DNA sekvensering til at identificere holdning-specifikke enkelt-nukleotid polymorfier15, Taqman metode16, udvinding () Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-Of-Flight MALDI-TOF) massespektrometri17og GeneChips18. Disse teknikker er ikke enkle at bruge og kan kræve dyrt udstyr. Omvendt, PCR-RFLP metode er billig, enkel at bruge, praktisk, har en høj effektivitet, og giver mulighed for hurtig identifikation af C924T-polymorfisme. Desuden bekræftede vi resultaterne af sekventering TBXA2R gen ved hjælp af Sanger metode15.
Denne tilgang giver mulighed for en intelligent undersøgelse af plak dannelse og åreforkalkning progression ved at analysere patient genotyper for TBXA2R C924T-polymorfisme. Denne metode kunne identificere emner mere modtagelige for aterotrombotiske processer, især dem blandt højrisiko, aspirin-behandlede patienter.
Protocol
Protokollen følger retningslinjerne i den medicinske forskning etiske komité i Universitet Chieti.
1. reagens Setup
- Forberede Tris-EDTA (TE) buffer (pH 8.0). Tilføje 200 µL af EDTA 0,5 M og 1 mL af Tris-Cl 1 M i et bægerglas og bringe med sterilt vand til 100 mL. TE buffer endelige koncentration: 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA. Opbevares ved stuetemperatur (RT).
- Forberede 1 L 10 x stamopløsning elektroforese buffer (TBE). 108 g af Tris Base, 55 g borsyre og 40 mL af EDTA opløses 0,5 M (pH 8) i et bægerglas, og bringe til volumen på 1 L med sterilt vand. Butik på RT.
- Forberede gel ladning farvestof. 0,25 g bromophenol blå, 0,25 g af xylen cyanol FF, 50 g af glycerol, 1 mM af EDTA (pH 8) i 60 mL deioniseret eller destilleret vand opløses, og bringe til en volumen på 100 mL med sterilt vand. Opbevares ved 4 ° C (for et par måneder) eller ved-20 ° C (i år)
-
Forberede 200 mL 2%-agarosegel. Brug det friske eller, alternativt, gemme solidificeret på RT for op til flere uger.
- 4 g Agarosen i 200 mL af 1 x TBE buffer i et 600 mL bægerglas opløses. Rør ved hjælp af en magnetisk mixer til ca. 5 min. indtil Agarosen er fuldstændigt suspenderet.
- Heat 2% Agarosen løsning i kogende vand eller på en varmeplade (for ca 10 min, indtil Agarosen er fuldstændigt opløst). Bemærk at bægerglasset med agarosegel skal være dækket med aluminiumsfolie. Alternativt, varme udækkede bægerglasset i en mikrobølgeovn på en høj temperatur i ca 3-5 min.
- Swirl 2% Agarosen løsning ved hjælp af en magnetisk mixer, kontrol af at Agarosen er fuldstændigt opløst.
Bemærk: Partikler af Agarosen vises som gennemskinnelige korn før fuldstændig opløsning. Det kan være nødvendigt at genopvarmning partikler i flere minutter (ca. 5 – 10 min). - Hvis en lagret del af agarosegel bruges, varme bægerglasset, dækket med aluminiumsfolie, i et varmt bad (på ca. 60 ° C) indtil Agarosen er opløst. Fjerne med Pasteur pipette enhver "spor" af størknet Agarosen fra overfladen før hælde.
2. DNA oprensning
-
Udfør følgende, før du starter rensning:
- Bruge menneskelige frisk fuldblod prøver, eller tø fuldblod frosne prøver hurtigt (i ca 2-3 min) i et vandbad (ved 37 ° C) anvende en mild uro og derefter reagensglasset RT før brug.
- Bland friske eller optøede blodprøver invertere rør flere gange.
- Start rensning procedure ved at følge leverandørens protokoller for 100 µL af eluering volumen.
-
Kvantificere og beregne renheden af DNA måling af absorbans ved 260, 280 og 320 nm.
- Bruge sterilt vand til at fortynde prøverne og kalibrere spektrofotometret.
- Anvende følgende formel for at beregne koncentrationen af DNA-prøve = 50 µg/mL x (en260 − A320) x fortyndingsfaktoren, og renheden af DNA = (en260 − A320) / (en280 − A320), med en acceptabel ratio mellem 1,7 og 1.9.
3. PCR-amplifikation af DNA-prøver
- Forberede 25 µL af reaktionsblandingen i en 0,2 mL micro-forstærkning tube, som vist i tabel 1.
- Udføre en PCR-amplifikation af oprenset DNA prøver ved hjælp af en automatiseret termisk cycler, efter forstærkning programmet vist i tabel 2.
- For enden af PCR-amplifikation stoppe PCR reaktioner ved at forlade DNA-prøver ved 4 ° C.
4. RFLP af PCR produkter
- Forberede 22,5 µL af master-mix løsning for hver prøve, så den valgte begrænsning enzym fordøjer PCR-produkter, som vist i tabel 3.
- Overføre 2,5 µL PCR produkt til en ny PCR rør til hver prøve, ved hjælp af en pipette og filter tips.
- Tilføje 22,5 µL af fordøjelsen master-mix løsning til rør indeholdende PCR produkt af hver prøve, ved hjælp af en pipette og filter tips.
- Inkuber reaktionsblandingen (master-mix løsning og PCR produkt) ved 37 ° C i 4 timer.
5. gel elektroforese analyse af PCR-RFLP prøver
- Pletten agarosegel ved at tilføje ethidiumbromid (EtBr) på 0,5 µg/mL gel til 10 min. EtBr binder sig til DNA, som kan visualiseres under ultraviolet (UV) lys.
OBS: Det er vigtigt at bruge handsker og andre beskyttelsesanordninger under håndtering, oplagring og bortskaffelse af EtBr, fordi det er en mutagen med potentielle carcinogenicitet. - Hæld den forberedte agarosegel i en gel med godt kam på plads, og vente, indtil det er stivnet.
- Placere den størknede agarosegel i boksen gel (elektroforese enhed).
- Udfylde boksen gel med 1 x TBE indtil gel er dækket.
- Med en pipette og filter tip, skal du indlæse 6 µL af den forstærkede digest DNA (specifikt, belastning 5 µL af hver prøve og 1 µL af gel ladning farvestof) i wells af agarosegel. Tilføje en DNA størrelse markør i en separat, godt og parallelt med prøverne.
- Kør gelen i 20-30 min. ved 100 V.
- Med en UV-transilluminator, visualisere kløvet DNA fragmenter eller de ufordøjede PCR produkter, sammenligne fragmenter med DNA størrelse markør, og registrere resultaterne af fotografering efter fabrikantens anvisninger.
Forsigtig: Brug beskyttelsesudstyr (sikkerhedsbriller eller en ansigtsmaske) omkring UV lys kilder.
Representative Results
Målet med denne metode er at evaluere tromboxan A2 receptor genotype med hensyn til C924T polymorfi. Det menneskelige TBXA2R gen ligger på 19p13.3, strækker sig over 15 kbp og består af tre exons adskilt af to introns. C924T polymorfier af TBXA2R-genet (af 539 bp) blev forstærket ved hjælp af PCR primere vist i figur 1, som var godt manipuleret til at forstærke en specifik DNA region, men ikke en orthologous eller paralogous uspecifik region. Desuden en RFLP-analyse ved hjælp af en RsaI begrænsning enzym (figur 1) på PCR-produkter blev udført, og resultaterne blev visualiseret på en agarosegel, for at karakterisere den specifikke studerede SNP.
Baseret på tilstedeværelsen af forskellige fragment længder efter fordøjelsen af DNA, er det muligt at diskriminere en patients genotype for C924T-polymorfisme. I virkeligheden, som vist på figur 2, viser homozygocitet af den store allel (CC) to bands (395 og 144 bp), fordi begrænsningen enzym netop skærer TBXA2R gen del på webstedet C924T polymorfi. Homozygocitet af mindre-allelen (TT) er påvist ved en enkelt band (539 bp), fordi begrænsning enzym skæring ikke opstår. Den heterozygous (CT) allel viser tre bands (539, 395 og 144 bp). Som vist i figur 2, er den C924T polymorfi, defineret af RsaI fordøjelse på PCR produkt, blevet bekræftet af Sekvensanalyse.
| Komponent | Volumen (µL) | Endelig koncentration |
| 10 x PCR buffer Tween-20 (15 M MgCl2) | 0,25 | 1.5 MgCl2 mmol/L |
| dNTP mix (10 mM) | 1 | 200 ΜM |
| Primer (frem) (10 pmol/µM) | 1 | 0,4 ΜM/ΜL |
| Primer (omvendt) (10 pmol/µM) | 1 | 0,4 ΜM/ΜL |
| Taq -polymerase (5 U/µL) | 0,2 | 1 U/ΜL |
| Prøve DNA (42 ng/µL) | 1 | 42 ng/µL |
| DNase-gratis-vand | 20.55 | |
| I alt | 25 |
Tabel 1: Opsætning af PCR-amplifikation. En 25 µL master-mix reaktionsblanding sat op i en 0,2 mL PCR rør til at forstærke en enkelt DNA-prøve.
| Standard PCR | |||
| Første skridt i aktiverende | 5 min | 95 ° C | |
| 3-trins cykling | |||
| Denaturering | 30 s | 94 ° C | |
| Udglødning | 60 s | 55 ° C | |
| Udvidelse | 60 s | 72 ° C | |
| Antal cyklusser | 30 cykler | ||
| Endelige udvidelse | 8 min | 72 ° C | |
Tabel 2: PCR forstærkning program. Oprette en automatiseret termisk cycler for at udføre PCR og forstærke DNA-template. PCR-reaktionerne er stoppet af nedkøling ved 4 ° C.
| Komponent | Volumen (µL) (n = 1) | Volumen (µL) (n = 10) * |
| 10 x enzym buffer | 2.5 | 27,5 |
| Begrænsning enzym (5 U/µL) | 0,5 | 5.5 |
| DNase-gratis-vand | 19,5 | 214.5 |
| I alt | 22,5 | 247.5 |
Tabel 3: Begrænsning enzym fordøjelsen af PCR produkter. En master-mix løsning er forberedt, så de valgte begrænsning enzym fordøjer PCR-produkter. *: Hvis du vil konfigurere en master-mix løsning for 10 prøver, tilføje 10% flere, endelig gør op 11 prøver.
Figur 1: PCR primere og RsaI begrænsning enzym. De frem og bak primere designet til forstærke TBXA2R gen del af 539 bp indeholdende C924T polymorfi. RsaI er den restriktion enzym valgt at genkende GTAC websteder. ˅: opskæring site af RsaI enzym. C(/T): C924T polymorfi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: elektroforese mønster og DNA sekvens analyse. (A) C924T genotype er anerkendt af RFLP mønster efter fordøjelse med specifikke RsaI enzym. (B) DNA sekvens analyse: RFLP resultater efter fordøjelse med RsaI begrænsning enzym blev bekræftet ved hjælp af Sekvensanalyse viser C924T polymorfi. Dette tal er blevet ændret fra De Iuliis et al., prostaglandiner & andre Lipid mæglere6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
I den foreliggende undersøgelse, har vi beskrevet en metode, der giver patienten genotypebestemmelse for at undersøge C924T polymorfisme (rs4523) beliggende på regionen 3' af TBXA2R-genet post-transcriptional rolle. Første, denne metode er baseret på DNA-ekstraktion fra fuldblod. Især består denne første proces af en rensning af samlede menneskelige DNA, genomisk og mitokondriel, fra hele blodprøver friske eller frosne, behandlet med EDTA (citrat eller heparin). Kortvarig oplagring af hele blodprøver, opbevares ved 2-8 ° C i op til 10 dage. For oplagring over 10 dage, opbevare prøver ved-70 ° C. Den automatiserede rensningsprocessen består af 4 trin: lyse, binder, vaske og elueres. For det andet bygger metoden på PCR-amplifikation af TBXA2R gen del indeholdende C924T mutation. Endelig udføres identifikation af vildtype og/eller mutant genotype ved hjælp af en Restriktionsenzymanalyse (RFLP) på agarosegel.
Kritiske trin i protokollen er følgende: (i) i tilfælde af at en del af agarosegel gemt på RT er anvendt, den størknede Agarosen kan være re opløst over et bad med kogende vand (ved 60 ° C i ca 15-20 min) eller i en mikrobølgeovn (3-5 min) før hælde. Bemærk: Løsn fælles landbrugspolitik, når omsmeltning Agarosen i en flaske. (ii), endvidere, når re varme agarosegelelektroforese, fordampning vil forårsage en stigning på dets koncentration. Derfor kunne det være nyttigt at kompensere ved at tilføje en lille mængde vand. (iii) DNA fragmenter af mindre end 1.000 bp blev differentieret af agarosegel, og TBE buffer anbefales at få den bedst mulige adskillelse. (iv) vi foretrækker at bruge en agarosegel snarere end en polyacrylamid gel, fordi udarbejdelsen af sidstnævnte er vanskeligere, og det tager meget længere tid at oprette. (v) valget af køretid på gelelektroforese er afhængig af den forventede størrelse af forstærkning produkter. Baseret på denne protokol, er det tilstrækkeligt at udføre en elektroforese for 20-30 min. ved 100 V i 2%-agarosegel, da størrelsen af PCR fragmenter spænder fra 100-500 bp. (vi) det er obligatorisk at opnå 10 til 50 ng af en god kvalitet skabelon DNA ekstraheret fra menneskelige prøver . Af denne grund foretrækker vi at bruge en automatiseret DNA-oprensning i stedet en semi-automatisk eller manuel. (vii) Forbered master-mix reaktion til PCR-amplifikation og master-mix løsning til PCR produkter fordøjelse, tilføjer 10% mere (for at tage hensyn til tab af væske under pipettering) til volumen beregnet ganget med antallet af prøver for volumen kræves for en DNA prøve.
Den hyppigste faldgrube i metoden er tilstedeværelsen af ekstra forstærkning produkter på grund af en forkert termisk cycler program, en forkert forstærkning master-mix forberedelse eller en DNA-skabelon forurening. Desuden, mangel af PCR produkter kan skyldes inaktiverede Taq -polymerase eller en forkert termisk cycler køre. Derudover kan tilstedeværelsen af uventede fragmenter være på grund af PCR produktkontaminering eller en ufuldstændig fordøjelse fra enten en inaktiveret enzym, alt for lille mængde begrænsning enzym volumen eller en for kort inkubationstiden.
I de seneste år, de følgende metoder har været udnyttet til SNP analyse ved hjælp af PCR teknik: hybridisering af korte allel-specifik oligonukleotider11, allel-specifik PCR12, primer udvidelse på DNA microarrays13 , oligonukleotid ligatur assay14, direkte DNA-sekventering til at identificere holdning-specifikke enkelt-nukleotid polymorfier15, Taqman metode16, udvinding Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time Of Flight (MALDI-TOF) massespektrometri17, og GeneChips18. Disse metoder er ikke ideel, fordi de ikke er enkel at bruge og/eller kræver dyrt udstyr. Omvendt, PCR-RFLP-metoden i denne undersøgelse er billig, enkel at bruge, praktisk, har en høj effektivitet, og giver mulighed for hurtig identifikation af C924T-polymorfisme. En begrænsning for den nuværende metode er, at det kun kan bruges til et lille antal SNPs og for et par prøver i en arbejdssession.
For fremtidige ansøgninger, kan denne metode bruges til prædiktive undersøgelser vedrørende plak dannelse og åreforkalkning progression ved at analysere de patient genotyper for TBXA2R C924T-polymorfisme. Desuden, denne metode kunne identificere emner mere modtagelige for aterotrombotiske processer, navnlig højrisiko patienter behandlet med aspirin. Endelig vil denne metode kunne anvendes til at studere andre polymorfier involveret i personlig medicin for specifikke stoffer (f.eks antikoagulantia og antikonvulsiva) for at forstå den passende lægemiddeldosering og den enkelte farmakologiske og klinisk respons for hver patient, før du begynder behandling og at undgå skadelige virkninger.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette projekt blev delvist finansieret af 60% Ateneo tilskud fra Ministero dell'Università, Italien S.M. og E.T. Vi har også modtaget delvis bidrag til forskning udgifter ved Institut for medicinsk, Oral og bioteknologiske videnskaber, universitetet i Chieti "G. d'Annunzio".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAsymphony SP | QIAGEN | 937055 | |
| Spectrophotometer | EPPENDORF | 6131-02222 | |
| UV-transilluminator | UVP | 732-110 | |
| PCR tubes | EPPENDORF | H0030121589 | |
| PCR thermal cycler | EPPENDORF | 5331-03721 | |
| Pipettors and filter tips | EPPENDORF | H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02 | |
| Horizontal minigel electrophoresis apparatus | DIATECH PHORESIS 10 | RI002-10 | |
| Dry block heater | TWIN INCUBATOR | DG210 | |
| QIAsymphony DNA Midi Kit | QIAGEN | 931255 | |
| 10x PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase) | DIATECH AND TAKARA | T0100 AND R0001DM | |
| Taq polymerase | TAKARA | R0001DM | |
| dNTP mixture | DIATECH pharmacogenetics | NM001 | dNTP MIX 10x 100 microliters, 10 mM |
| PCR primers | DIATECH pharmacogenetics | \\ | |
| Restriction enzyme RsaI | New England biolabs | R0167L | |
| Restriction enzyme 10x buffer | New England biolabs | R0167L | |
| Agarose | Sigma | A9539 | DNA fragments are best separated in TBE buffer |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| Boric acid | Sigma | B7901 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Sigma | E7889 | |
| 10% (wt/vol) ammonium persulfate | Sigma | E3678 | prepared fresh each time |
| EtBr (0.5 μg/μL) | Sigma | E8751 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
| Xylene cyanol FF | Sigma | X4126 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| DNA size marker | DIATECH pharmacogenetics | R1002-10 | Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI |
| Sterile water (autoclaved) | DIATECH pharmacogenetics | \\ |
References
- Shen, R. F., Tai, H. H. Thromboxanes: synthase and receptors. J Biomed Sci. 5 (3), 153-172 (1998).
- Nusing, R. M., Hirata, M., Kakizuka, A., Eki, T., Ozawa, K., Narumiya, S. Characterization and chromosomal mapping of the human thromboxane A2 receptor gene. J Biol Chem. 268 (33), 25253-25259 (1993).
- Cyrus, T., Ding, T., Praticò, D. Expression of thromboxane synthase, prostacyclin synthase and thromboxane receptor in atherosclerotic lesions: correlation with plaque composition. Atherosclerosis. 208 (2), 376-381 (2010).
- Cipollone, F., et al. A Polymorphism in the Cyclooxygenase 2 Gene as an Inherited Protective Factor Against Myocardial Infarction and Stroke. JAMA. 291 (18), 2221-2228 (2004).
- Fontana, P., et al. Identification of functional polymorphisms of the thromboxane A2 receptor gene in healthy volunteers. Thromb Haemost. 96 (3), 356-360 (2006).
- De Iuliis, V., et al. Differential TBXA2 receptor transcript stability is dependent on the C924T polymorphism. Prostaglandins Other Lipid Mediat. pii. (17), (2017).
- Saiki, R. K., et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230 (4732), 1350-1354 (1985).
- Collins, F. S., Brooks, L. D., Chakravarti, A. A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation. Genome Res. 8 (12), 1229-1231 (1998).
- Lee, J. C. -I., Chang, J. -G. ABO genotyping by polymerase chain reaction. J. Forensic Sci. 37 (5), 1269-1275 (1992).
- Masao, O., Hirofumi, F., Jerzy, K. K., Hidetoshi, I. Single nucleotide polymorphism detection by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism. Nature Protocols. 2 (11), 2857-2864 (2007).
- Iwasaki, H., et al. Accuracy of genotyping for single nucleotide polymorphisms by a microarray-based single nucleotide polymorphism typing method involving hybridization of short allele-specific oligonucleotides. DNA Res. 9 (2), 59-62 (2002).
- Papp, A. C., Pinsonneault, J. K., Cooke, G., Sadee, W. Single nucleotide polymorphism genotyping using allele-specific PCR and fluorescence melting curves. Biotechniques. 34 (5), 1068-1072 (2003).
- O'Meara, D., Ahmadian, A., Odeberg, J., Lundeberg, J. SNP typing by apyrase-mediated allele-specific primer extension on DNA microarrays. Nucleic Acids Res. 30 (15), e75 (2002).
- Pickering, J. Integration of DNA ligation and rolling circle amplification for the homogeneous, end-point detection of single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Res. 30 (12), e60 (2002).
- Chatterjee, P. D. Direct sequencing of bacterial and P1 artificial chromosome-nested deletions for identifying position-specific single-nucleotide polymorphisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (23), 13276-13281 (1999).
- Livak, K. J. Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay. Genet. Anal. 14 (5-6), 143-149 (1999).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Res. 7 (4), 378-388 (1997).
- Gunderson, K. L., Steemers, F. L., Lee, G., Mendoza, L. G., Chee, M. A genome-wide scalable SNP genotyping assay using microarray technology. Nat. Genet. 37 (5), 549-554 (2005).
