Summary
I denna studie, beskriver vi en metod för att analysera C924T genotypen. Protokollet består av tre faser: DNA-extraktion, förstärkning av polymeras-kedjereaktion (PCR) och analys begränsning fragment längd polymorfism (RFLP) på agarosgel.
Abstract
Tromboxan A2 receptor (TBXA2R) genen är medlem i G-protein kopplade överfamiljen med sju-transmembrana regioner. Det är involverade i aterogenes progression, ischemi och hjärtinfarkt. Här presenterar vi en metod för patientens genotypning att undersöka rollen post-transcriptional C924T polymorfism (rs4523) ligger på 3' regionen av TBXA2 receptor genen. Denna metod förlitar sig på DNA-extraktion från helblod, polymeras-kedjereaktion (PCR) förstärkning av den TBXA2 gen del innehåller C924T mutation och identifiering av vildtyp och/eller muterade genotyper använder en begränsning digest analys, specifikt en begränsning fragment längd polymorfism (RFLP) på agaros gel. Dessutom bekräftades resultaten genom att sekvensera genen TBXA2R. Denna metod har flera potentiella fördelar, såsom hög effektivitet och snabb identifiering av den C924T polymorfism genom PCR och restriktionsenzym analys. Denna metod tillåter en förutsägande studie för plackbildning och åderförkalkning progression genom att analysera patientens genotyper för den TBXA2R C924T polymorfism. Tillämpning av denna metod har potential att identifiera individer som är mer mottagliga för aterotrombotiska processer, i särskilda ämnen i en högrisk, aspirin-behandlade.
Introduction
TBXA2R är medlem i G-protein kopplade överfamiljen med sju-transmembrana regioner, som är allmänt uttryckt och lokaliserade på cellmembranen eller intracellulära strukturer1,2. Den TBXA2R signalvägen är involverade i avancerade aterosklerotiska processer3. Ökat uttryck av TBXA2 receptorn var visat under aterogenes progression, kliniska och experimentella studier visade dess relevanta roll i ischemi och hjärtinfarkt4. C924T, en single nucleotide polymorphism (SNP) av genen TBXA2R, erkändes som en funktionell polymorfism hos friska frivilliga och har kopplats till kliniska sjukdomar5. Dessutom visat vår tidigare studie6 att den C924T polymorfism av genen TBXA2R är inblandade i avskrift stabilitet. specifikt, finns det en ökad instabilitet av mutant (TT) typ utskriften med avseende på den vilda typen (CC). Dessutom inducerade flera stimuli som adenosindifosfat (ADP), epinefrin och kollagen vid olika koncentrationer en trombocytaggregation mindre effektiv för den muterade typ (TT). Detta är förenligt med en nedsatt tromb bildandet och hemostas. Således, instabiliteten i TBXA2R avskriften och associerade minskning av trombocytaggregation kan vara associerad med en skyddande roll för TBXA2R TT genotypen mot aterotrombos och dess komplikationer hos patienter behandlade med acetylsalicylsyra högrisk6 .
Här, beskriver vi en metod för patientens genotypning att undersöka rollen post-transcriptional C924T polymorfism (rs4523) ligger på 3' regionen av TBXA2 receptor genen. Denna metod förlitar sig på följande steg: (1) DNA-extraktion från helblod, (2) PCR-amplifiering av TBXA2R gen portion som innehåller C924T mutation, och (3) identifiering av vildtyp och/eller muterade genotyper med begränsning fragment längd polymorfism (RFLP) på agarosgel. RFLP är en teknik som utnyttjar variationer i homologa DNA sekvenser7. Detta program användes att upptäcka DNA polymorfismer, särskilt SNP, och att hitta och associera biologisk relevans i genetiska variationer8. Den polymorfism analyseras för första gången med RFLP-PCR hos människor var ABO blod9. RFLP-PCR metoden tillåter analys av genetiska mutationer i homologa DNA-sekvenser genom att utvärdera förekomsten av fragment av olika längder efter DNA matsmältningen med mycket specifika begränsning endonucleases10.
I senaste åren, följande metoder har använts för SNP-analys med PCR-teknik: hybridisering av kort allel-specifika oligonukleotider11, allel-specifika PCR-12, på DNA microarrays13, förlängningen på primer oligonukleotid ligation assay14, direkt DNA sekvensering för identifierande position-specifika single-nucleotide polymorphisms15, Taqman metod16, extraktion () laser Laser Desorption/jonisering Time-Of-Flight MALDI-TOF) masspektrometri17och GeneChips18. Dessa tekniker är inte enkel att använda och kan kräva dyr utrustning. Däremot metoden PCR-RFLP är billig, bekväm och enkel att använda, har en hög verkningsgrad och tillåter snabb identifiering C924T polymorfism. Dessutom bekräftade vi resultaten genom att sekvensera genen TBXA2R använder de Sanger metod15.
Denna metod tillåter en förutsägande studie av plackbildning och åderförkalkning progression genom att analysera patientens genotyper för den TBXA2R C924T polymorfism. Denna metod kunde identifiera patienter mer mottagliga för aterotrombotiska processer, i synnerhet de bland högrisk, aspirin-behandlade patienter.
Protocol
Protokollet följer riktlinjerna i den medicinska forskningsetisk kommitté i Chieti universitet.
1. reagens Setup
- Förbereda Tris-EDTA (TE) bufferten (pH 8,0). Tillsätt 200 µL av EDTA 0,5 M och 1 mL Tris-Cl 1 M i en bägare och med sterilt vatten till 100 mL. TE buffert slutlig koncentration: 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA. Förvara i rumstemperatur (RT).
- Laga 1 L 10 x stamlösning elektrofores buffert (TBE). Upplösa 108 g för Tris Base, 55 g borsyra och 40 mL av EDTA 0,5 M (pH 8) i en bägare, och föra volymen av 1 L med sterilt vatten. Butiken på RT.
- Förbereda gelen lastning färgämne. Lös 0,25 g bromofenolblått, 0,25 g xylen cyanol FF, 50 g glycerol, 1 mM EDTA (pH 8) i 60 mL avjoniserat eller destillerat vatten, och föra till en volym på 100 mL med sterilt vatten. Förvaras vid 4 ° C (för ett par månader) eller vid-20 ° C (i år)
-
Förbereda 200 mL 2% agarosgel. Använd det färska eller, alternativt, lagra stelnat på RT för upp till flera veckor.
- Lös 4 g av agaros i 200 mL 1 x TBE buffert i en 600 mL-bägare. Rör om med en magnetisk mixer för ca 5 min tills Agarens avbryts helt.
- Värm 2% agaros lösningen i kokande vatten eller på en värmeplatta (i ca 10 min, tills Agarens är helt upplöst). Observera att bägaren med agarosgel måste vara täckt med aluminiumfolie. Alternativt värme avtäckta bägaren i mikrovågsugn på hög temperatur under ca 3 – 5 min.
- Swirl 2% agaros lösningen med hjälp av en magnetisk mixer, kontrollera att Agarens är helt upplöst.
Obs: Partiklar av agaros visas som halvgenomskinliga korn innan fullständig upplösning. Det kan vara nödvändigt att värma partiklar i flera minuter (ca 5 – 10 min). - Om en lagrad del av agarosgel används, Värm bägaren, täckt med aluminiumfolie, i ett hett vatten bad (vid ca 60 ° C) tills Agarens är upplöst. Ta bort med en Pasteur-pipett ”spår” av stelnad agaros från ytan före hälla.
2. DNA-rening
-
Utför följande innan du börjar rening:
- Använda mänskliga färskt helblod prover, eller Tina helblod frysta prover snabbt (för ca 2 – 3 min) i ett vattenbad (vid 37 ° C) tillämpa en mild agitation och sedan temperera vid RT före användning.
- Blanda färska eller tinade blodprov Invertera rören flera gånger.
- Starta rening proceduren genom att följa leverantörens protokoll för 100 µL av elutionsvolymen.
-
Kvantifiera och beräkna renheten av DNA mäta absorbansen vid 260, 280 och 320 nm.
- Använd sterilt vatten att späda ut proverna och kalibrera spektrofotometern.
- Tillämpa följande formel, för att beräkna koncentrationen av DNA-prov = 50 µg/mL x (en260 − A320) x utspädningsfaktorn och renheten av DNA = (en260 − A320) / (en280 − A320), med en acceptabel ratio mellan 1,7 och 1,9.
3. PCR-amplifiering av DNA-prover
- Förbereda 25 µL av reaktionsblandningen i en 0,2 mL mikro-amplifiering röret, som visas i tabell 1.
- Utföra en PCR-amplifiering av de renade DNA-prover med hjälp av en automatiserad termocykel, efter vilken förstärkning som visas i tabell 2.
- I slutet av den PCR-amplifieringen, stoppa de PCR-reaktionerna genom att lämna de DNA-proverna vid 4 ° C.
4. RFLP av PCR-produkter
- Förbereda 22,5 µL master-mix lösning för varje prov, så att den valda restriktionsenzym smälter de PCR-produkterna, som visas i tabell 3.
- Överföra 2,5 µL av PCR-produkten till en ny PCR-röret för varje prov, med hjälp av en pipett och filter tips.
- Lägga till 22,5 µL matsmältningen master-mix lösning till rören med PCR-produkten av varje prov, med hjälp av en pipett och filter tips.
- Inkubera reaktionsblandningen (master-mix lösning och PCR-produkt) vid 37 ° C i 4 h.
5. gel elektrofores analys av PCR-RFLP prover
- Fläcken på agarosgel genom att lägga till etidiumbromid (EtBr) på 0,5 µg/mL gel för 10 min. EtBr binder till DNA, vilket kan visualiseras under ultraviolett (UV) ljus.
Varning: Det är viktigt att använda handskar och andra skyddsanordningar under hantering, lagring och bortskaffande av EtBr, eftersom det är ett mutagen med potentiella carcinogeniteten. - Häll den beredda agarosgel en gel-facket med väl kammen på plats, och vänta tills det är stelnat.
- Placera den stelnad agarosgel i rutan gel (elektrofores unit).
- Fyll rutan gel med 1 x TBE tills gelen är täckt.
- Med en pipett och filter tips, ladda 6 µL av den förstärkta digest DNA (specifikt belastning 5 µL av varje prov och 1 µL gel lastning färgämne) i brunnar av agarosgel. Lägga till en markör för DNA-storlek i ett separat väl och parallellt med prover.
- Kör gelen för 20 – 30 min vid 100 V.
- Med en UV-transilluminator, visualisera de klyvs DNA-fragment eller osmält PCR-produkterna, jämföra fragment med DNA storlek markör och registrera resultaten av fotografi följa tillverkarens instruktioner.
Varning: Använd skyddsanordningar (skyddsglasögon eller ansiktsmask) runt UV-ljus källor.
Representative Results
Målet med denna metod är att utvärdera receptor tromboxan A2 genotypen när det gäller den C924T polymorfism. Den mänskliga TBXA2R-genen ligger på 19p13.3, sträcker sig över 15 kbp och består av tre exoner åtskilda av två introner. De C924T polymorfismer i genen TBXA2R (av 539 bp) förstärktes med PCR primers visas i figur 1, som var väl utformad att förstärka en viss DNA-region men inte en orthologous eller paralogous ospecifik region. Dessutom utfördes en RFLP analys med hjälp av en RsaI restriktionsenzym (figur 1) på PCR-produkter och resultaten var visualiserat på en agarosgel, för att karakterisera särskilda studerade SNP.
Baserat på förekomsten av olika fragment längder efter rötning av DNA, är det möjligt att diskriminera en patients genotyp för den C924T polymorfism. I själva verket som visas på bild 2, visar homozygosity av stora allelen (CC) två band (395 och 144 bp), eftersom restriktionsenzym nedskärningar just den TBXA2R gen delen på webbplatsen C924T polymorfism. Homozygosity av mindre allelen (TT) framgår av ett enda band (539 bp), eftersom restriktionsenzym styckning inte uppstår. Den heterozygota (CT)-allelen visar tre band (539, 395 och 144 bp). Som visas i figur 2, har den C924T polymorfism, definieras av RsaI matsmältningen på PCR-produkten, bekräftats av sekvensanalys.
| Komponent | Volym (µL) | Slutlig koncentration |
| 10 x PCR buffer Tween-20 (15 M MgCl2) | 0,25 | 1.5 MgCl2 mmol/L |
| dNTP mix (10 mM) | 1 | 200 ΜM |
| Primer (fram) (10 pmol/µM) | 1 | 0,4 ΜM/ΜL |
| Primer (omvänd) (10 pmol/µM) | 1 | 0,4 ΜM/ΜL |
| Taq -polymeras (5 U/µL) | 0,2 | 1 U/ΜL |
| Prova DNA (42 ng/µL) | 1 | 42 ng/µL |
| DNAS-gratis-vatten | 20,55 | |
| Totalt | 25 |
Tabell 1: PCR-amplifiering setup. En 25 µL master-mix reaktionsblandningen inrättades en 0,2 mL PCR-rör att förstärka en enda DNA-provet.
| Standard PCR | |||
| Aktiverande initsteget | 5 min | 95 ° C | |
| 3-steg cykling | |||
| Denaturering | 30 s | 94 ° C | |
| Glödgning | 60 s | 55 ° C | |
| Förlängning | 60 s | 72 ° C | |
| Antal cykler | 30 cykler | ||
| Slutliga förlängning | 8 min | 72 ° C | |
Tabell 2: PCR-amplifiering program. Ställa in en automatiserad termocykel för att utföra PCR och förstärka mallen DNA. PCR-reaktioner stoppas av kylning på 4 ° C.
| Komponent | Volym (µL) (n = 1) | Volym (µL) (n = 10) * |
| 10 x enzym buffert | 2.5 | 27,5 |
| Restriktionsenzym (5 U/µL) | 0,5 | 5.5 |
| DNAS-gratis-vatten | 19,5 | 214,5 |
| Totalt | 22,5 | 247.5 |
Tabell 3: Restriktionsenzym rötning av PCR produkter. En master-mix lösningen bereds så att den valda restriktionsenzym smälter de PCR-produkterna. *: Ställ in en master-mix lösning för 10 prover, lägga till 10% mer, äntligen göra upp 11 prover.
Figur 1: PCR primers och RsaI restriktionsenzym. Framåt och bakåt primers designad för att förstärka den TBXA2R gen delen av 539 bp som innehåller de C924T polymorfism. RsaI är den restriktionsenzym valt att erkänna de GTAC platserna. ˅: skär platsen för RsaI enzym. C(/T): C924T polymorfism. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: elektroforetiska mönster och DNA sekvens analys. (A), den C924T genotyp är erkänd av RFLP mönster efter rötning med det särskilda RsaI enzymet. (B) DNA sekvens analys: de resultat som erhålls med RFLP efter uppslutning med enzymet RsaI begränsning bekräftades med sekvensanalys visar den C924T polymorfism. Denna siffra har ändrats från De Iuliis et al., prostaglandiner & andra Lipid medlare6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
I den aktuella studien, har vi beskrivit en metod som gör att patienten genotypning för att undersöka rollen post-transcriptional C924T polymorfism (rs4523) ligger på 3' regionen av TBXA2R-genen. Först, denna metod förlitar sig på DNA-extraktion från helblod. I synnerhet består denna första process av en rening av totala mänskligt DNA, genomisk och mitokondrie, från hela blodprover färska eller frysta, behandlas med EDTA (citrat eller heparin). Kort sikt förvaring av helblod prover, förvaras vid 2-8 ° C i upp till 10 dagar. För lagring under 10 dagar, lagra prover vid-70 ° C. Automatiserad reningsprocessen består av 4 steg: lyse, binda, tvätta och eluera. Andra åberopat metoden PCR-amplifiering av TBXA2R gen portion som innehåller C924T mutationen. Slutligen, identifiering av vildtyp eller muterade genotyp genom en analys av restriktionsenzym (RFLP) agarosgel sker.
Kritiska steg i protokollet är följande: (i) i ärendet som en del av agarosgel lagrade på RT används, stelnad Agarens kan vara åter löst över ett kokande vattenbad (vid 60 ° C i ca 15-20 min) eller i en mikrovågsugn (3-5 min) innan hälla. Obs: lossa locket när omsmältning agaros i en flaska. (ii), dessutom när åter värme agaros, avdunstning kommer att orsaka en ökning av dess koncentration. Därför kan det vara bra att kompensera genom att lägga till en liten mängd vatten. (iii) DNA fragment av mindre än 1 000 bp var åtskilt av agarosgel och TBE buffert rekommenderas att erhålla bästa möjliga separation. (iv) vi föredrar att använda en agarosgel snarare än en polyakrylamidgel eftersom beredningen av den senare är svårare, och det tar mycket längre tid att ställa in. (v) valet av den rinnande tiden av gelelektrofores är beroende av den förväntade storleken på produkterna som förstärkning. Baserat på detta protokoll, är det tillräckligt att utföra en elektrofores för 20-30 min vid 100 V i 2% agarosgel, eftersom storleken på PCR fragment varierar från 100-500 bp. (vi) är det obligatoriskt att erhålla 10 till 50 ng av en god kvalitet DNA utvinns ur mänskliga prover . Därför föredrar vi att använda en automatiserad DNA-rening snarare än en halvautomatisk eller manuell. (vii) Förbered master-mix reaktionen för PCR-amplifiering och master-mix lösning för PCR-produkter matsmältning, lägga till 10% mer (för att beakta förlust av vätska under pipettering) till volymen beräknas multiplicerat med antalet prover för den volym som krävs för en DNA-provet.
Den vanligaste fallgropen för metoden är förekomsten av extra förstärkning produkter på grund av en felaktig termocykel program, en felaktiga förstärkning master-mix förberedelse eller en DNA mall förorening. Dessutom kan avsaknad av PCR-produkter bero på inaktiverade Taq -polymeras eller en felaktig termocykel kör. Dessutom, kan närvaron av oväntade fragment vara på grund av kontaminering med PCR-produkt eller en ofullständig matsmältning från antingen ett inaktiverat enzym, för lite mängden restriktionsenzym volym eller en alltför kort inkubationstid.
Under de senaste åren, följande metoder har använts för SNP-analys med PCR-teknik: hybridisering av kort allel-specifika oligonukleotider11, allel-specifika PCR-12, primer filändelsen på DNA microarrays13 , oligonukleotid ligation assay14, direkt DNA-sekvensering för att identifiera position-specifika single-nucleotide polymorphisms15, Taqman metod16, utvinning laser Laser Desorption/jonisering Time-Of-Flight (MALDI-TOF) masspektrometri17, och GeneChips18. Dessa metoder är inte idealiska eftersom de inte är enkel att använda och/eller kräver dyr utrustning. Däremot den PCR-RFLP-metod som beskrivs i denna studie är billig, bekväm och enkel att använda, har en hög verkningsgrad och tillåter snabb identifiering C924T polymorfism. En begränsning till denna metod är att den endast kan användas för ett litet antal SNP och några prover i ett arbetsmöte.
För framtida tillämpningar, kan denna metod användas för förutsägande studier gällande plackbildning och åderförkalkning progression genom att analysera de tålmodiga genotyperna för den TBXA2R C924T polymorfism. Dessutom denna metod kunde identifiera patienter mer mottagliga för aterotrombotiska processer, i synnerhet högriskpatienter behandlas med acetylsalicylsyra. Slutligen, denna metod skulle kunna tillämpas för att studera andra polymorfismer som är inblandade i personlig medicin för specifika läkemedel (t ex antikoagulantia och antiepileptika) för att förstå den lämpliga läkemedel doseringen och individen farmakologiska och kliniskt svar för varje patient innan behandling inleds och att undvika negativa effekter.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Projektet finansierades delvis av 60% Ateneo bidrag från Ministero dell'Università, Italien att S.M. och E.T. Vi fick också delvis bidrag för att undersöka kostnader av Institutionen för medicin, Oral och bioteknologiska fakulteten, universitetet i Chieti ”G. d'Annunzio”.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAsymphony SP | QIAGEN | 937055 | |
| Spectrophotometer | EPPENDORF | 6131-02222 | |
| UV-transilluminator | UVP | 732-110 | |
| PCR tubes | EPPENDORF | H0030121589 | |
| PCR thermal cycler | EPPENDORF | 5331-03721 | |
| Pipettors and filter tips | EPPENDORF | H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02 | |
| Horizontal minigel electrophoresis apparatus | DIATECH PHORESIS 10 | RI002-10 | |
| Dry block heater | TWIN INCUBATOR | DG210 | |
| QIAsymphony DNA Midi Kit | QIAGEN | 931255 | |
| 10x PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase) | DIATECH AND TAKARA | T0100 AND R0001DM | |
| Taq polymerase | TAKARA | R0001DM | |
| dNTP mixture | DIATECH pharmacogenetics | NM001 | dNTP MIX 10x 100 microliters, 10 mM |
| PCR primers | DIATECH pharmacogenetics | \\ | |
| Restriction enzyme RsaI | New England biolabs | R0167L | |
| Restriction enzyme 10x buffer | New England biolabs | R0167L | |
| Agarose | Sigma | A9539 | DNA fragments are best separated in TBE buffer |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| Boric acid | Sigma | B7901 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Sigma | E7889 | |
| 10% (wt/vol) ammonium persulfate | Sigma | E3678 | prepared fresh each time |
| EtBr (0.5 μg/μL) | Sigma | E8751 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
| Xylene cyanol FF | Sigma | X4126 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| DNA size marker | DIATECH pharmacogenetics | R1002-10 | Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI |
| Sterile water (autoclaved) | DIATECH pharmacogenetics | \\ |
References
- Shen, R. F., Tai, H. H. Thromboxanes: synthase and receptors. J Biomed Sci. 5 (3), 153-172 (1998).
- Nusing, R. M., Hirata, M., Kakizuka, A., Eki, T., Ozawa, K., Narumiya, S. Characterization and chromosomal mapping of the human thromboxane A2 receptor gene. J Biol Chem. 268 (33), 25253-25259 (1993).
- Cyrus, T., Ding, T., Praticò, D. Expression of thromboxane synthase, prostacyclin synthase and thromboxane receptor in atherosclerotic lesions: correlation with plaque composition. Atherosclerosis. 208 (2), 376-381 (2010).
- Cipollone, F., et al. A Polymorphism in the Cyclooxygenase 2 Gene as an Inherited Protective Factor Against Myocardial Infarction and Stroke. JAMA. 291 (18), 2221-2228 (2004).
- Fontana, P., et al. Identification of functional polymorphisms of the thromboxane A2 receptor gene in healthy volunteers. Thromb Haemost. 96 (3), 356-360 (2006).
- De Iuliis, V., et al. Differential TBXA2 receptor transcript stability is dependent on the C924T polymorphism. Prostaglandins Other Lipid Mediat. pii. (17), (2017).
- Saiki, R. K., et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230 (4732), 1350-1354 (1985).
- Collins, F. S., Brooks, L. D., Chakravarti, A. A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation. Genome Res. 8 (12), 1229-1231 (1998).
- Lee, J. C. -I., Chang, J. -G. ABO genotyping by polymerase chain reaction. J. Forensic Sci. 37 (5), 1269-1275 (1992).
- Masao, O., Hirofumi, F., Jerzy, K. K., Hidetoshi, I. Single nucleotide polymorphism detection by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism. Nature Protocols. 2 (11), 2857-2864 (2007).
- Iwasaki, H., et al. Accuracy of genotyping for single nucleotide polymorphisms by a microarray-based single nucleotide polymorphism typing method involving hybridization of short allele-specific oligonucleotides. DNA Res. 9 (2), 59-62 (2002).
- Papp, A. C., Pinsonneault, J. K., Cooke, G., Sadee, W. Single nucleotide polymorphism genotyping using allele-specific PCR and fluorescence melting curves. Biotechniques. 34 (5), 1068-1072 (2003).
- O'Meara, D., Ahmadian, A., Odeberg, J., Lundeberg, J. SNP typing by apyrase-mediated allele-specific primer extension on DNA microarrays. Nucleic Acids Res. 30 (15), e75 (2002).
- Pickering, J. Integration of DNA ligation and rolling circle amplification for the homogeneous, end-point detection of single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Res. 30 (12), e60 (2002).
- Chatterjee, P. D. Direct sequencing of bacterial and P1 artificial chromosome-nested deletions for identifying position-specific single-nucleotide polymorphisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (23), 13276-13281 (1999).
- Livak, K. J. Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay. Genet. Anal. 14 (5-6), 143-149 (1999).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Res. 7 (4), 378-388 (1997).
- Gunderson, K. L., Steemers, F. L., Lee, G., Mendoza, L. G., Chee, M. A genome-wide scalable SNP genotyping assay using microarray technology. Nat. Genet. 37 (5), 549-554 (2005).
