Summary
本研究では、C924T 遺伝子型を分析する方法論について述べる。プロトコルは 3 つのフェーズで構成されています: DNA の抽出、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) と、制限断片長多型 (RFLP) agarose のゲルの分析による増幅。
Abstract
トロンボキサン A2 受容体 (TBXA2R) 遺伝子領域の 7 回膜貫通型 G タンパク共役型スーパーファミリーのメンバーであります。粥状動脈硬化の進行、虚血、心筋梗塞になってもいます。患者遺伝子型 TBXA2 受容体遺伝子の 3' 末端に位置しています C924T 多型 (rs4523) の転写後の役割を調査するための方法論をご紹介します。このメソッドは、C924T 変異と野生型および/または制限のダイジェストの分析を使用して突然変異遺伝子の同定を含む TBXA2 遺伝子部分のポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 増幅全血からの DNA 抽出具体的、制限断片長多型 (RFLP) アガロースゲルのゲルします。さらに、結果は、TBXA2R 遺伝子の配列によって確認されました。このメソッドは、高効率、PCR および制限酵素解析による C924T の多型の迅速同定など、いくつかの潜在的な利点を備えています。このアプローチは、患者 TBXA2R C924T 多型遺伝子型を分析することによってプラークとアテローム性動脈硬化進行の予測研究をできます。この方法の適用対象となる危険性の高い、アスピリン投与群でのアテローム血栓性プロセスに影響を受けやすい被験者を識別するために可能性があります。
Introduction
TBXA2R 広く表現し、細胞膜または細胞内構造を1,2のいずれかをローカライズされた 7 回膜貫通領域と G タンパク共役型スーパーファミリーのメンバーであります。TBXA2R シグナル伝達経路は、高度な動脈硬化プロセス3に関与しています。TBXA2 受容体の発現の増加が粥状動脈硬化の進行中に実証され、臨床と実験的研究は虚血や心筋梗塞4でその関連する役割を示した。C924T、TBXA2R 遺伝子の一塩基多型 (SNP) が認められた健康なボランティアで機能的多型と疾患5にリンクされています。さらに、私たちの以前の研究6は TBXA2R 遺伝子 C924T 多型は、トラン スクリプトの安定性に関与していることを実証具体的には、野生型 (CC) に対して変異 (TT) 型転写産物の増加の不安定があります。さらに、アデノシン二リン酸 (ADP)、エピネフリン、異なる濃度でコラーゲンなどのいくつかの刺激は以下の突然変異型 (TT) の効果的な血小板凝集を誘導しました。これは減らされた血栓と止血と一貫性が。したがって、TBXA2R トラン スクリプトの不安定性と血小板凝集の関連付けられている削減は、アテローム血栓症とその合併症ハイリスク アスピリン治療患者6 TBXA2R TT の遺伝子型の保護役割に関連付けられているかもしれない.
ここでは、TBXA2 受容体遺伝子の 3' 末端に位置しています C924T 多型 (rs4523) の転写後の役割を調査するため患者の遺伝子多型の方法論について述べる。このメソッドは、次の手順に依存しています: 全血から (1) DNA の抽出、pcr (2) C924T の突然変異、および (3) 野生型および/または制限のフラグメントの長さを使用して突然変異遺伝子の同定を含む TBXA2R 遺伝子部分の長多型 (RFLP) agarose のゲル。RFLP、相同 DNA シーケンス7バリエーションを悪用する手法です。このアプリケーションは、DNA 多型、特に Snp を検出し、見つけるし、遺伝的変異8生物学的関連性を関連付けるに使用されました。初めて人間の RFLP PCR を使用して分析した多型は ABO 血液9だったRFLP PCR 法は、非常に特定の制限エンドヌクレアーゼ10を使用して DNA の消化力の後の長さの異なるフラグメントの存在を評価することによって相同 DNA 配列の遺伝子の突然変異の分析することができます。
過去数年間、次の方法論利用されている PCR 法を用いた SNP 解析: 短い対立遺伝子特定のオリゴヌクレオチド11、対立遺伝子特定の PCR の12、DNA マイクロ アレイの13日にプライマー拡張の交配オリゴヌクレオチド ligation 試金14, 直接 DNA マトリックス レーザー脱離イオン化飛行時間型の (特定の位置に固有の単一ヌクレオチドの多形15Taqman 法16抽出シーケンスMALDI-TOF) 質量分析法17、および GeneChips18。これらのテクニックを使用する単純ではないと高価な機器が必要な場合があります。逆に、PCR-RFLP 法は安価な使いやすい、便利な高効率であり C924T 多型の迅速な識別を許します。さらに、サンガー法15を用いた TBXA2R 遺伝子の配列によって結果を確認しました。
このアプローチは、患者 TBXA2R C924T 多型遺伝子型を分析することによってプラーク形成、動脈硬化進行の予測研究をできます。このメソッドが特定科目アテローム血栓性プロセスになりやすいハイリスク、アスピリン治療患者の中の人。
Protocol
プロトコルは、キエーティ大学の医学研究倫理委員会のガイドラインに従います。
1. 試薬のセットアップ
- (PH 8.0) トリス EDTA (TE) バッファーを準備します。ビーカーに 200 μ L 0.5 M の EDTA のとトリス Cl 1 M の 1 つの mL を追加し、滅菌水で 100 mL にもたらします。TE バッファーの最終濃度: 10 mM トリス-Cl 1 mM EDTA。常温 (RT) を格納します。
- 原液電気泳動バッファー (TBE) x 10 の 1 L を準備します。トリス基地の 108 g、ホウ酸、55 g、EDTA の 40 mL を溶かす、ビーカーに 0.5 M (pH 8) し、滅菌水で 1 L のボリュームをもたらします。室温ストア
- ゲルのローディングの染料を準備します。プロムフェノール ブルーとキシレンシアノール FF、グリセリン、1 mM EDTA (pH 8) の 60 mL に 50 g の 0.25 g 純水や蒸留水、0.25 g を溶かし、滅菌水で 100 mL の容積をもたらします。(数ヶ月) のための 4 ° C または-20 ° C (長年) で格納します。
-
2% の agarose のゲルの 200 mL を準備します。それ新鮮なまたは、代わりに、ストアを使用は数週までの常温固化。
- 600 mL ビーカー 1 x TBE バッファーの 200 mL の寒天 4 g を溶解します。約 5 分間磁気ミキサーを使用して agarose が完全に中断されるまでかき混ぜなさい。
- 沸騰水または (約 10 分間、agarose を完全に溶解するまで) ホット プレート上の 2% アガロース溶液を加熱します。アルミ箔覆わ agarose のゲルとビーカー必要がありますに注意してください。また、熱は高温約 3-5 分電子レンジで覆いを取られたビーカー。
- Agarose が完全に解散したことをチェック、磁気のミキサーを使用して 2% アガロース溶液を旋回します。
注: agarose の粒子は完全な溶解の前に半透明の粒として表示されます。いくつかの分 (約 5-10 分) 粒子再熱する必要があります。 - 場合のストアド部分 agarose のゲル、ビーカーを熱、アルミ箔で覆われては、agarose まで (約 60 ° C) で湯浴が解散しました。パスツール ピペット「痕跡」凝固 agarose の表面からを注ぐ前に削除します。
2. DNA 精製
-
浄化を開始する前に、次を実行します。
- ひと新鮮な全血サンプルを使用や軽度の動揺を適用する (37 ° C) で水バースの迅速に (約 2-3 分) のサンプルを冷凍血液を解凍して使用する前に RT に釣り合います。
- 新鮮なまたは解凍血液サンプル チューブを数回反転をミックスします。
- 溶出容量 100 μ L のサプライヤーのプロトコルに従うことによって精製の手順を開始します。
-
定量化し、260、280、320 で吸光度を測定する DNA の純度を計算する nm。
- サンプルを希釈して分光光度計を校正するために、滅菌水を使用します。
- DNA サンプルの濃度を計算するために次の数式を適用 (260 − A320) x 50 μ G/ml 倍の希釈倍率と DNA の純度を = = (260 − A320)/(280 − A320)、許容比1.7 と 1.9。
3. DNA のサンプルの Pcr
- 表 1に示すように、0.2 mL マイクロ増幅管で反応混合物の 25 μ L を準備します。
- 次の表 2に示されている増幅プログラム自動サーマルサイクラーを使用して浄化された DNA サンプルの PCR 増幅を行います。
- PCR の拡大の終わりに、4 ° C で DNA サンプルを残すことによって PCR の反作用を停止します。
4。 PCR の製品の RFLP
- 選択した制限の酵素のダイジェスト PCR の製品表 3に示すように各サンプルのマスター ミックス ソリューションの 22.5 μ L を準備します。
- PCR の製品の 2.5 μ L をピペットとフィルターのヒントを使用して、各サンプルの新しい PCR チューブに転送します。
- ピペットとフィルターのヒントを使用して、各サンプルの PCR の製品を含むチューブに消化マスター ミックス ソリューションの 22.5 μ L を追加します。
- 4 h の 37 ° C で反応混合物 (マスター ミックス ソリューションおよび PCR の製品) を孵化させなさい。
5 PCR-RFLP 法試料のゲル電気泳動分析
- 汚れは 10 分 EtBr 用ゲルを 0.5 μ g/mL に臭化エチジウム (EtBr) を追加することによって agarose のゲルに紫外線 (UV) 光の下で視覚化することができます DNA にバインドします。
注意: それはそれは潜在的な発がん性と変異原ため処理、ストレージ、および EtBr、処分時に手袋やその他の保護デバイスを使用する重要です。 - 所でよく櫛でゲル トレイに準備された agarose のゲルを注ぎ、それが固化するまで待ちます。
- ジェル ボックス (電気泳動装置) に凝固 agarose のゲルを配置します。
- ジェル ボックス 1 で塗りつぶす x TBE ゲルが覆われるまで。
- ピペットとフィルターのヒント、agarose のゲルの井戸に増幅されたダイジェスト DNA (具体的には、各サンプルのロード 5 μ L とゲルのローディングの染料の 1 μ L) の 6 μ L をロードします。よく、サンプルと並行して別の DNA サイズ マーカーを追加します。
- 100 V で 20-30 分のためのゲルを実行します。
- UV transilluminator とに裂かれた DNA のフラグメントまたは DNA サイズ マーカーとフラグメントを比較する未消化の PCR の製品を視覚化し、製造元の指示に従って撮影して結果を登録します。
注意: は、UV 光源周り保護装置 (安全メガネまたは顔マスク) を使用します。
Representative Results
このメソッドの目的は、トロンボキサン A2 受容体遺伝子 C924T 多型についてを評価することです。人間 TBXA2R 遺伝子 19p13.3 にある、15 kbp にまたがるし、2 つのイントロンで区切られた 3 つのエクソンので構成されています。TBXA2R 遺伝子 C924T 多型 (539 の bp) がよく設計された DNA の特定の領域はない、オーソログまたは paralogous 無指定地域を増幅する PCR のプライマーの図 1に示すを使用して増幅されました。さらに、PCR の製品につくっ制限酵素 (図 1) を用いた RFLP 分析を行ったし、結果は、特定の研究の SNP を特徴付けるために agarose のゲル, 可視化されました。
DNA の消化後異なるフラグメントの長さの存在に基づいて、C924T 多型の患者さんの遺伝子を識別することが可能です。実際には図 2に示すように、主要な対立遺伝子 (CC) の homozygosity の制限の酵素は正確に C924T 多型サイトで TBXA2R 遺伝子部分を切るため 2 つのバンド (395 と 144 bp) が表示されます。マイナーな対立遺伝子 (TT) の homozygosity は単一のバンドによって示されて (539 bp) 制限酵素切断が発生しないため、します。ヘテロ接合体 (CT) 対立遺伝子は 3 つのバンドを示しています (539、395, 144 bp)。図 2に示すように、シーケンス解析による PCR の製品につくっ消化によって定義される C924T の多型を確認されています。
| コンポーネント | (Μ l) | 最終濃度 |
| PCR バッファー トゥイーン 20 (15 M MgCl2) x 10 | 0.25 | 1.5 MgCl2モル/L |
| dNTP ミックス (10 mM) | 1 | 200 Μ M |
| プライマー (前方) (10 pmol/μ M) | 1 | 0.4 Μ M/Μ L |
| プライマー (逆) (10 pmol/μ M) | 1 | 0.4 Μ M/Μ L |
| Taqのポリメラーゼ (5 U/μ L) | 0.2 | 1 U/Μ L |
| DNA のサンプル (42 ng/μ L) | 1 | 42 ng/μ l |
| DNase 自由水 | 20.55 | |
| 合計 | 25 |
表 1:PCR 増幅セットアップします。25 μ L マスター ミックス反応混合物単一 DNA のサンプルを増幅する 0.2 mL PCR チューブに設置。
| 標準 PCR | |||
| 活性化の第一歩 | 5 分 | 95 ° C | |
| 3 ステップのサイクリング | |||
| 変性 | 30 s | 94 ° C | |
| アニール | 60 s | 55 ° C | |
| 拡張機能 | 60 s | 72 ° C | |
| サイクル数 | 30 サイクル | ||
| 最終的な拡張 | 8 分 | 72 ° C | |
表 2:PCR 増幅プログラム。PCR を行い、テンプレート DNA を増幅するために自動化されたサーマルサイクラーを設定します。PCR の反作用は 4 ° C の低温で停止してください。
| コンポーネント | (Μ l) (n = 1) | (Μ l) (n = 10) * |
| 酵素バッファー x 10 | 2.5 | 27.5 |
| 制限酵素 (5 U/μ L) | 0.5 | 5.5 |
| DNase 自由水 | 19.5 | 214.5 |
| 合計 | 22.5 | 247.5 |
テーブル 3:PCR の製品の制限の酵素の消化力。マスター ミックス溶液を調製して、選択した制限の酵素のダイジェスト PCR の製品。*: 10 サンプルのマスター ミックス ソリューションを設定する追加 10% 以上、最終的に 11 のサンプルを作っています。
図 1: PCR プライマーとつくっ制限酵素。539 の TBXA2R 遺伝子の一部を増幅するために設計された前方および逆プライマー bp C924T 多型を含みます。つくっ GTAC サイトを認識する制限酵素であります。˅: つくっ酵素切断サイト。C(/T): C924T ポリモーフィズム。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 電気泳動パターンおよび DNA シーケンス解析します。特定のつくっ酵素で消化した後、RFLP による遺伝子型を認識 C924T (A) パターン。(B) DNA シーケンス解析: C924T 多型を示すシーケンス解析を用いた RFLP つくっ制限の酵素と消化後に得られた結果を認めた。この図は、デ Iuliisら、プロスタグランジン及び他の脂質メディエーターの6から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
本研究では TBXA2R 遺伝子の 3' 末端に位置しています C924T 多型 (rs4523) の転写後の役割を調査するために患者の遺伝子型を可能にする方法を説明しました。最初に、このメソッドは全血からの DNA 抽出に依存します。特に、この最初のプロセスで構成されています全人間 DNA、ゲノムとミトコンドリア、新鮮なまたは冷凍、全血のサンプルからの浄化の EDTA (クエン酸またはヘパリン) で扱われます。全血サンプルの短期記憶、10 日間 2-8 ° C で保存します。ストレージの 10 日間は-70 ° C で試料を保存します。自動精製プロセスに 4 つのステップが装備されている: 溶解、バインド、洗って溶出します。第二に、メソッドは C924T の突然変異を含む TBXA2R 遺伝子部分の PCR 増幅に依存します。最後に、野生型および/または agarose のゲルの制限酵素分析 (RFLP) による突然変異遺伝子の同定が行われます。
プロトコルで重要な手順次のとおりです: (i) agarose のゲルの部分に格納されている場合に RT を使用、凝固のアガロースを (約 15-20 分の 60 ° C) で沸騰水浴上再溶解することができますまたは注ぐ前に電子レンジ (3-5 分)。注: は、ボトルのアガロースを再溶解するときにキャップを緩めます。(ii)、さらに、アガロースを再加熱蒸発させるその濃度の増加。このため、それは水の少量を追加することで補正するために役に立つかもしれない。(iii) DNA のフラグメント未満 1,000 bp は agarose のゲルによって区別された、TBE バッファーを最高の可能な分離を入手しておきます。(iv) は後者の準備はより困難であり、かかるを設定するようになりますので、電気泳動法ではなく、agarose のゲルを使用することを好みます。(v) ゲルの電気泳動の実行時間の選択は、予想される増幅製品のサイズに依存します。このプロトコルに基づいて、2% アガロースゲルで 100 V で 20-30 分のための電気泳動法を実行するだけで十分です、PCR のサイズ フラグメント範囲 100-500 跪く (vi) から 10 に 50 を取得するために必須です良質テンプレートひと試料から抽出した DNA の ng.このため、自動 DNA 精製ではなく、半自動または手動のいずれかを使うことが望ましい。(vii) pcr 用マスター ミックス反応と PCR 製品消化 (ピペッティング中に液体の損失アカウント) を 10% 以上をボリュームに追加するマスター ミックス ソリューションは必要なボリュームのためのサンプルの数を乗じて計算の準備1 つの DNA のサンプル。
メソッドの最も頻繁な落とし穴は、不適切なサーマルサイクラー プログラム、不適切な増幅マスター ミックス準備、または DNA テンプレートの汚染のための余分な増幅製品の存在です。さらに、不活化のTaqのポリメラーゼまたは実行不適切なサーマルサイクラー PCR の製品がない場合可能性があります。さらに、予期しないフラグメントの存在だったり PCR 製品汚染による不完全な消化に不活化酵素、制限酵素量少なすぎる量も短い培養時間のいずれかから。
過去数年間、次の方法論は、PCR 法を用いた SNP 解析のため利用されている: 短い対立遺伝子特定のオリゴヌクレオチド11、対立遺伝子特定の PCR の12、DNA マイクロ アレイ13 プライマー拡張の交配、オリゴヌクレオチド ligation14の分析、位置特定一塩基多型15Taqman 法16、抽出マトリックス レーザー脱離/イオン化を識別するための DNA 塩基配列を直接飛行時間 (MALDI-TOF) 質量分析法17、および GeneChips18。これらのメソッドは、使用および/または高価な機器を必要とする簡単ではないためには適していません。逆に、本研究で説明した PCR-RFLP 法で安価な使いやすい、便利な高効率、C924T 多型の迅速な識別を許します。本手法に制限は、それだけ使える Snp の数が少ない、作業セッションでいくつかのサンプルです。
将来のアプリケーションのため TBXA2R C924T 多型の遺伝子型の患者を分析することによってプラーク形成と動脈硬化進展予測研究のこのメソッドを使用することができます。さらに、このメソッドは、アテローム血栓性のプロセスに影響を受けやすい対象を識別することが、特に、ハイリスク患者がアスピリンと扱われます。最後に、このメソッドは適切な薬の投与量と個々 の薬理学を理解するために特定の薬剤 (抗凝固薬、抗けいれん薬など) のオーダーメイド医療に関与する他の多型の研究に適用できると治療を開始する前に、副作用を避けるために各患者の臨床応答は。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
このプロジェクト部分的に資金が供給されたアテネオ付与 Ministero dell' そして、スウェンと e. t. にイタリアから 60%また、医学、口腔バイオ テクノロジー科学、キエーティ」g. ダンヌンツィオ「大学費用を研究する部分的な貢献を受けた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAsymphony SP | QIAGEN | 937055 | |
| Spectrophotometer | EPPENDORF | 6131-02222 | |
| UV-transilluminator | UVP | 732-110 | |
| PCR tubes | EPPENDORF | H0030121589 | |
| PCR thermal cycler | EPPENDORF | 5331-03721 | |
| Pipettors and filter tips | EPPENDORF | H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02 | |
| Horizontal minigel electrophoresis apparatus | DIATECH PHORESIS 10 | RI002-10 | |
| Dry block heater | TWIN INCUBATOR | DG210 | |
| QIAsymphony DNA Midi Kit | QIAGEN | 931255 | |
| 10x PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase) | DIATECH AND TAKARA | T0100 AND R0001DM | |
| Taq polymerase | TAKARA | R0001DM | |
| dNTP mixture | DIATECH pharmacogenetics | NM001 | dNTP MIX 10x 100 microliters, 10 mM |
| PCR primers | DIATECH pharmacogenetics | \\ | |
| Restriction enzyme RsaI | New England biolabs | R0167L | |
| Restriction enzyme 10x buffer | New England biolabs | R0167L | |
| Agarose | Sigma | A9539 | DNA fragments are best separated in TBE buffer |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| Boric acid | Sigma | B7901 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Sigma | E7889 | |
| 10% (wt/vol) ammonium persulfate | Sigma | E3678 | prepared fresh each time |
| EtBr (0.5 μg/μL) | Sigma | E8751 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
| Xylene cyanol FF | Sigma | X4126 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| DNA size marker | DIATECH pharmacogenetics | R1002-10 | Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI |
| Sterile water (autoclaved) | DIATECH pharmacogenetics | \\ |
References
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