Summary
En el presente estudio, se describe una metodología para analizar el genotipo C924T. El protocolo consta de tres etapas: extracción de ADN, amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR) y análisis del polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción (RFLP) en gel de agarosa.
Abstract
El gen del receptor (TBXA2R) de tromboxano A2 es un miembro de la superfamilia de la proteína G acoplada con regiones siete transmembrana. Está implicado en la progresión de la aterogénesis, isquemia e infarto de miocardio. Aquí presentamos una metodología de genotipado paciente para investigar el papel postranscripcional de los polimorfismos C924T (rs4523) situado en la región 3' del gen del receptor TBXA2. Este método se basa en la extracción de ADN de la sangre entera, la amplificación de la reacción en cadena (PCR) de la porción del gen TBXA2 que contiene la mutación de C924T e identificación de tipo salvaje y mutantes genotipos utilizando un análisis de la recopilación de restricción, polimerasa específicamente un fragmento longitud polimorfismo de restricción (RFLP) en agarose gel. Además, los resultados fueron confirmados por secuenciación del gen TBXA2R. Este método ofrece varias ventajas potenciales, tales como alta eficiencia y la rápida identificación del polimorfismo C924T por análisis de PCR y restricción enzimática. Este enfoque permite un estudio predictivo para la formación de placa y la progresión de aterosclerosis mediante el análisis de pacientes genotipos para el polimorfismo TBXA2R C924T. Aplicación de este método tiene el potencial para identificar a temas que son más susceptibles a los procesos aterotrombóticos, en determinados temas de un grupo de alto riesgo, tratados con aspirina.
Introduction
TBXA2R es miembro de la superfamilia de proteínas G acoplada con regiones siete transmembrana, que son ampliamente expresada y localizada en las membranas celulares o en las estructuras intracelulares1,2. La vía de señalización TBXA2R participa en procesos aterosclerótica avanzada3. Aumento de la expresión del receptor TBXA2 fue demostrado durante la progresión de la aterogénesis y clínicas y estudios experimentales demostraron su papel relevante en la isquemia y el infarto de miocardio4. C924T, un polimorfismo de nucleótido único (SNP) del gen TBXA2R, fue reconocido como un polimorfismo funcional en voluntarios sanos y se ha relacionado con trastornos clínicos5. Además, nuestro anterior estudio6 demostraron que el polimorfismo C924T del gen TBXA2R participa en la estabilidad de la transcripción; en concreto, hay una mayor inestabilidad de la transcripción mutante de tipo (TT) en relación con el tipo salvaje (CC). Además, varios estímulos como adenosina difosfato (ADP), epinefrina y colágeno a diferentes concentraciones indujeron una agregación plaquetaria menos eficaz para el tipo de mutante (TT). Esto es consistente con una formación reducida del trombo y la hemostasia. Así, la inestabilidad de la transcripción TBXA2R y la reducción asociada de la agregación plaquetaria podrían asociarse con un papel protector para el genotipo TT TBXA2R contra aterotrombosis y sus complicaciones en pacientes tratados con aspirina riesgo6 .
Aquí, describimos una metodología de genotipado paciente investigar el papel postranscripcional del polimorfismo C924T (rs4523) situado en la región 3' del gen del receptor TBXA2. Este método se basa en los siguientes pasos: extracción de ADN (1) de la sangre entera, amplificación por PCR (2) de la porción del gen TBXA2R que contiene la mutación de C924T y (3) identificación del tipo salvaje y mutantes genotipos utilizando longitud de fragmento de restricción polimorfismo (RFLP) en gel de agarosa. RFLP es una técnica que aprovecha las variaciones de las secuencias de ADN homólogas7. Esta aplicación se utilizó para detectar polimorfismos del ADN, especialmente SNPs y para encontrar relevancia biológica en variaciones genéticas8. El polimorfismo analizado por primera vez mediante RFLP-PCR en humanos fue el ABO sangre9. El método RFLP-PCR permite el análisis de mutaciones genéticas en las secuencias de ADN homólogas mediante la evaluación de la presencia de fragmentos de diferentes longitudes después de la digestión del ADN con endonucleasas de restricción específica10.
En años anteriores, las siguientes metodologías se han utilizado para el análisis SNP con la técnica de PCR: hibridación de oligonucleótidos específicos de alelo corto11, PCR alelo-específica12, cartilla extensión de microarrays de ADN13, ligadura del oligonucleótido ensayo14, secuencia para la identificación de polimorfismos de nucleótido posición específica15, Taqman método16, extracción mediante láser de desorción/ionización tiempo de vuelo (directa de la DNA MALDI-TOF) espectrometría de masas17y18de GeneChips. Estas técnicas no son fáciles de usar y pueden requerir el equipo costoso. Por el contrario, el método de PCR-RFLP es barato, fácil de usar, cómodo, tiene una alta eficiencia y permite la rápida identificación del polimorfismo C924T. Además, confirmamos los resultados mediante la secuenciación del gen TBXA2R utilizando el método de Sanger15.
Este enfoque permite un estudio predictivo de la formación de placa y la progresión de aterosclerosis mediante el análisis de pacientes genotipos para el polimorfismo TBXA2R C924T. Este método puede identificar a sujetos más susceptibles a los procesos aterotrombóticos, en particular aquellos pacientes de alto riesgo, tratados con aspirina.
Protocol
El protocolo sigue las directrices de la Comisión de ética de investigación médica de la Universidad de Chieti.
1. reactivo configuración
- Preparar el tampón Tris-EDTA (TE) (pH 8.0). Añadir 200 μL de EDTA 0,5 M y 1 mL de Tris-Cl 1 M en un matraz y llevar a 100 mL con agua estéril. Concentración final de tampón TE: 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA. Almacenar a temperatura ambiente (RT).
- Preparar 1 L de 10 x buffer de electroforesis de solución madre (TBE). Disolver 108 g de Tris Base, 55 g de ácido bórico y 40 mL de EDTA 0,5 M (pH 8) en un vaso y llevar a volumen de 1 L con agua destilada. Tienda a TA.
- Preparar el gel colorante de carga. Disolver 0,25 g de bromofenol azul, 0,25 g de xileno cyanol FF, 50 g de glicerina, 1 mM EDTA (pH 8) en 60 mL agua destilada o desionizada y llevar a un volumen de 100 mL con agua estéril. Almacenar a 4 ° C (algunos meses) o a-20 ° C (por años)
-
Preparar 200 mL de gel de agarosa al 2%. Uso fresco o, alternativamente, almacenar solidificó a temperatura ambiente por hasta varias semanas.
- Disolver 4 g de agarosa en 200 mL de buffer de x TBE 1 en un vaso de precipitados de 600 mL. Mezclar con un mezclador magnético de alrededor de 5 minutos hasta que la agarosa se suspende completamente.
- Calentar la solución de agarosa al 2% en agua hirviendo o en una placa caliente (por unos 10 minutos, hasta que la agarosa se disuelva completamente). Tenga en cuenta que el vaso con el gel de la agarosa debe cubrirse con papel de aluminio. Por otra parte, calentar el vaso destapado en el microondas a temperatura alta unos 3 – 5 minutos.
- Agite la solución de agarosa al 2% utilizando un mezclador magnético, comprobando que la agarosa se disuelva completamente.
Nota: Las partículas de agarosa aparecen como granos translúcidos antes de la disolución completa. Puede ser necesario calentar las partículas durante varios minutos (5 – 10 min.). - Si una porción almacenada del gel de la agarosa se utiliza calentar el vaso, cubierto con papel de aluminio, en un baño de agua caliente (a unos 60 ° C) hasta que la agarosa se disuelve. Extraiga con una pipeta Pasteur "indicios" de agarosa solidificada de la superficie antes de verter.
2. purificación de DNA
-
Realice lo siguiente antes de comenzar la purificación:
- Utilizar muestras de sangre humana fresca, o descongelar sangre congeladas las muestras rápidamente (de unos 2 a 3 minutos) en un baño de agua (a 37 ° C) aplicando una suave agitación y luego alcancen la RT antes de su uso.
- Mezclar las muestras de sangre fresca o descongelada invertir los tubos varias veces.
- Iniciar el procedimiento de purificación siguiendo los protocolos del proveedor de 100 μl de volumen de elución.
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Cuantificar y calcular la pureza de ADN midiendo la absorbancia a 260, 280 y 320 nm.
- Utilizar agua estéril para diluir las muestras y para calibrar el espectrofotómetro.
- Aplicar la siguiente fórmula, para calcular la concentración de la muestra de ADN = 50 μg/mL x (un260 − A320) x factor de dilución y la pureza del ADN = (un260 − A320) / (un280 − A320), con una aceptable relación entre 1.7 y 1.9.
3. PCR la amplificación de las muestras de ADN
- Preparar 25 μl de mezcla de reacción en un tubo de micro-amplificación de 0,2 mL, como se muestra en la tabla 1.
- Llevar a cabo una amplificación mediante PCR de las muestras de ADN purificadas utilizando a un termociclador automatizado, siguiendo el programa de amplificación que se muestra en la tabla 2.
- Al final de la amplificación de PCR, detener las reacciones de PCR por dejar las muestras de ADN a 4 º C.
4. RFLP de productos de PCR
- Preparar 22,5 μl de la solución de mezcla maestra para cada muestra, de manera que el las enzimas de restricción digiere los productos PCR, como se muestra en la tabla 3.
- 2,5 μl del producto de PCR de transferencia a un nuevo tubo PCR para cada muestra, utilizando una pipeta y extremidades de filtro.
- Añadir 22,5 μl de la solución de mezcla maestra de digestión en los tubos que contiene el producto PCR de cada muestra, utilizando una pipeta y extremidades de filtro.
- Incubar la mezcla de reacción (solución de mezcla maestra y producto de la polimerización en cadena) a 37 ° C durante 4 horas.
5. gel electroforesis análisis de muestras de PCR-RFLP
- Tinción del gel de agarosa mediante la adición de bromuro de etidio (EtBr) a 0,5 μg/mL el gel durante 10 minutos EtBr se une al DNA, que puede ser visualizado bajo luz ultravioleta (UV).
PRECAUCIÓN: Es importante utilizar guantes y otros dispositivos de protección durante su manipulación, almacenamiento y disposición de EtBr, ya que es un mutágeno con carcinogenicidad potencial. - Verter el gel de agarosa preparado en una bandeja de gel con el peine bien en su lugar y esperar hasta que se solidifica.
- Colocar el gel de agarosa solidificada en la caja de gel (unidad de electroforesis).
- Llene la caja de gel con 1 x TBE hasta cubre el gel.
- Con una pipeta y extremidades de filtro, carga 6 μl de la digest amplificada DNA (específicamente, carga 5 μl de cada muestra y 1 μl de gel colorante de carga) en los pocillos del gel de agarosa. Agregar un marcador del tamaño de ADN en un separado bien en paralelo con las muestras.
- Correr el gel para 20-30 min a 100 V.
- Con un transiluminador UV, visualizar los fragmentos de ADN cortados o los productos PCR sin digerir, comparando fragmentos con el marcador del tamaño de ADN y registrar los resultados por la fotografía siguiendo las instrucciones del fabricante.
PRECAUCIÓN: Utilice los dispositivos de protección (gafas de seguridad o una máscara) alrededor de las fuentes de luz UV.
Representative Results
El objetivo de este método es evaluar el genotipo del receptor de tromboxano A2 en relación con el polimorfismo C924T. El gene humano de TBXA2R encuentra en 19p13.3 abarca 15 kbp y consta de tres exones separados por dos intrones. Los polimorfismos de C924T del gene TBXA2R (de 539 bp) se amplificó utilizando los cebadores PCR se muestra en la figura 1, que fueron bien diseñados para amplificar una región específica de ADN pero no un orthologous o parálogo región inespecífica. Además, se realizó un análisis RFLP utilizando la enzima de restricción RsaI (figura 1) en los productos PCR y los resultados fueron visualizados en un gel de agarosa, para caracterizar el SNP específico estudiado.
Basado en la presencia de longitudes diferentes fragmentos después de la digestión del ADN, es posible discriminar el genotipo de un paciente para el polimorfismo C924T. De hecho, como se muestra en la figura 2, la calidad de homozigoto del alelo principales (CC) muestra dos bandas (395 y 144 PB), porque la enzima de restricción corta precisamente la porción del gen TBXA2R en el sitio de polimorfismo de C924T. La calidad de homozigoto del alelo menor (TT) se demuestra por una sola banda (539 bp), porque no se produce el corte de la enzima de la restricción. El alelo heterozigótico de (CT) muestra tres bandas (539, 395 y 144 bp). Como se muestra en la figura 2, el polimorfismo de C924T, definido por la digestión de la RsaI en producto de la polimerización en cadena, ha sido confirmado por análisis de la secuencia.
| Componente | Volumen (μL) | Concentración final |
| 10 x buffer PCR Tween-20 (15 M MgCl2) | 0.25 | 1.5 MgCl2 mmol/L |
| mezcla de dNTP (10 mM) | 1 | 200 ΜM |
| Cartilla (hacia adelante) (10 pmol/μm) | 1 | 0.4 ΜM/ΜL |
| Cartilla (inversa) (10 pmol/μm) | 1 | 0.4 ΜM/ΜL |
| Taq polimerasa (5 U/μL) | 0.2 | 1 U/ΜL |
| ADN de la muestra (42 ng/μL) | 1 | 42 ng/μl |
| Agua libre de DNAsas | 20.55 | |
| Total | 25 |
Tabla 1: Configuración de amplificación PCR. Una mezcla de mezcla maestra reacción de 25 μl montada en un tubo PCR de 0.2 mL para amplificar una sola muestra de DNA.
| Polimerización en cadena estándar | |||
| Paso inicial de activación | 5 min | 95 ° C | |
| ciclo de 3 pasos | |||
| Desnaturalización | 30 s | 94 ° C | |
| De recocido | 60 s | 55 ° C | |
| Extensión | 60 s | 72 ° C | |
| Número de ciclos de | 30 ciclos | ||
| Extensión final | 8 min | 72 ° C | |
Tabla 2: Programa de amplificación PCR. Configurar un termociclador automatizado para realizar PCR y ampliar la plantilla de ADN. Reacciones de PCR son detenidas por refrigeración a 4 ° C.
| Componente | Volumen (μL) (n = 1) | Volumen (μL) (n = 10) * |
| 10 x buffer de la enzima | 2.5 | 27.5 |
| Enzima de restricción (5 U/μL) | 0.5 | 5.5 |
| Agua libre de DNAsas | 19.5 | 214.5 |
| Total | 22.5 | 247.5 |
Tabla 3: Digestión de la enzima de la restricción de productos de la PCR. Se prepara una solución de mezcla maestra para que el las enzimas de restricción digiere los productos PCR. *: Para configurar una solución de mezcla maestra para 10 muestras, añadir 10% más, que finalmente componen 11 muestras.
Figura 1: PCR primers y enzima de restricción RsaI. Los iniciadores de adelante y atrás diseñados para amplificar la porción del gen TBXA2R de 539 bp con el polimorfismo C924T. RsaI es la enzima de restricción seleccionada para reconocer los sitios GTAC. ˅: sitio de corte de la enzima RsaI. C(/T): C924T polimorfismo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de la secuencia del patrón electroforético y el ADN. Patrón (A) el genotipo es reconocido por el RFLP de C924T después de la digestión con la enzima RsaI específica. Análisis de la secuencia de ADN (B): los resultados obtenidos por RFLP después de la digestión con la enzima de restricción RsaI fueron confirmados con análisis de la secuencia que muestra el polimorfismo C924T. Esta figura ha sido modificada desde De preve et al., las prostaglandinas y otros mediadores de lípidos6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
En el presente estudio, hemos descrito una metodología que permite genotyping paciente para investigar el papel postranscripcional de polimorfismos de C924T (rs4523) situado en la región 3' del gen TBXA2R. En primer lugar, este método se basa en la extracción de ADN de la sangre entera. En particular, este primer proceso consiste en una purificación de ADN humano total, genómica y mitocondrial, de muestras de sangre entera frescas o congeladas, tratados con EDTA (citrato o heparina). Para el almacenamiento de corto plazo de muestras de sangre, almacenar a 2-8 ° C durante 10 días. Para el almacenamiento durante 10 días, almacenar las muestras a-70 ° C. El proceso de purificación automatizado consta de 4 pasos: lyse, enlazar, lave y responsables. En segundo lugar, el método se basa en la amplificación por PCR de la porción del gen TBXA2R que contiene la mutación C924T. Por último, se realiza la identificación del tipo salvaje o genotipo mutante con un análisis de enzimas de restricción (RFLP) en gel de agarosa.
Pasos críticos en el protocolo son los siguientes: (i) en caso de que una porción del gel de agarosa almacenada en el RT se utiliza, la agarosa solidificada puede ser volver a disuelto en baño de agua hirviendo (a 60 ° C por unos 15-20 min) o en un horno de microondas (3-5 min) antes de verter. Nota: Afloje la tapa al volver a derretir la agarosa en un frasco. (ii), además, al volver a calentar la agarosa, evaporación causará un aumento de su concentración. Por esta razón, podría ser útil compensar añadiendo un pequeño volumen de agua. (iii) fragmentos de menos de 1.000 bp fueron distinguidos por el gel de agarosa y almacenador intermediario TBE se recomienda para obtener la mejor separación posible. (iv) preferimos utilizar un gel de agarosa en lugar de un gel de poliacrilamida, debido a la preparación de este último es más difícil y lleva mucho más tiempo para configurar. (v) la elección del tiempo de la electroforesis en gel se basa en el tamaño esperado de los productos de amplificación. Basado en este protocolo, es suficiente para llevar a cabo una electroforesis durante 20-30 min a 100 V en gel de agarosa al 2%, ya que el tamaño de la PCR los fragmentos oscila entre 100-500 BP (vi) es obligatorio para obtener de 10 a 50 ng de una plantilla de buena calidad DNA extraída de muestras humanas . Por esta razón, preferimos utilizar una purificación de ADN automatizada en lugar de uno manual o semiautomático. (vii) Prepare la mezcla maestra reacción para amplificación por PCR y la solución de mezcla maestra para la digestión de productos PCR, agregando 10% más (para tener en cuenta la pérdida de líquido durante el pipeteo) al volumen calculan multiplicado por el número de muestras para el volumen de para una muestra de ADN.
La trampa más frecuente del método es la presencia de productos de amplificación adicional debido a un programa del termociclador incorrecta, una preparación de mezcla maestra de amplificación incorrecta o una contaminación de la plantilla de ADN. Además, la ausencia de productos de la PCR puede ser inactivada Taq polimerasa o un termociclador incorrecto funcionamiento. Además, la presencia de fragmentos inesperados puede ser debido a la contaminación del producto PCR o a una digestión incompleta de una enzima inactiva, muy poca cantidad de enzima de la restricción de volumen o un tiempo de incubación demasiado corto.
En los últimos años, se han utilizado las siguientes metodologías para el análisis SNP con la técnica de PCR: hibridación de oligonucleótidos específicos de alelo corto11, PCR alelo-específica12, cartilla extensión de microarrays de DNA13 , ligadura del oligonucleótido14de ensayo, dirigir la secuencia de la DNA para la identificación de polimorfismos de nucleótido posición específica15, Taqman método16, extracción mediante desorción/ionización del Laser Espectrometría de masas de tiempo de vuelo (MALDI-TOF)17y18de GeneChips. Estos métodos no son ideales porque no son fáciles de utilizar o requerir el equipo costoso. Por el contrario, el método de PCR-RFLP que se describe en este estudio es barato, fácil de usar, cómodo, tiene una alta eficiencia y permite la rápida identificación del polimorfismo C924T. Una limitación para el presente método es que sólo se puede utilizar para un pequeño número de SNPs y unas muestras en una sesión de trabajo.
Para futuras aplicaciones, este método puede utilizarse para estudios predictivos sobre la formación de placa y la progresión de aterosclerosis mediante el análisis de los genotipos de paciente para el polimorfismo TBXA2R C924T. Además, este método podría identificar sujetos más susceptibles a los procesos aterotrombóticos, en particular, pacientes de alto riesgo trataron con aspirina. Por último, este método podría aplicarse para estudiar otros polimorfismos implicados en la medicina personalizada para drogas específicas (por ejemplo, anticoagulantes y anticonvulsivos) para entender la dosis del fármaco apropiado y el individuo farmacológico y respuesta clínica de cada paciente antes de comenzar la terapia y para evitar efectos adversos.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este proyecto fue parcialmente financiado por % 60 que Ateneo otorga del Ministero dell'Università, Italia a S.M. y E.T. También recibimos contribuciones parciales a la investigación de gastos por el Departamento de medicina, Oral y Ciencias biotecnológicas de la Universidad de Chieti "G. d'Annunzio".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAsymphony SP | QIAGEN | 937055 | |
| Spectrophotometer | EPPENDORF | 6131-02222 | |
| UV-transilluminator | UVP | 732-110 | |
| PCR tubes | EPPENDORF | H0030121589 | |
| PCR thermal cycler | EPPENDORF | 5331-03721 | |
| Pipettors and filter tips | EPPENDORF | H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02 | |
| Horizontal minigel electrophoresis apparatus | DIATECH PHORESIS 10 | RI002-10 | |
| Dry block heater | TWIN INCUBATOR | DG210 | |
| QIAsymphony DNA Midi Kit | QIAGEN | 931255 | |
| 10x PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase) | DIATECH AND TAKARA | T0100 AND R0001DM | |
| Taq polymerase | TAKARA | R0001DM | |
| dNTP mixture | DIATECH pharmacogenetics | NM001 | dNTP MIX 10x 100 microliters, 10 mM |
| PCR primers | DIATECH pharmacogenetics | \\ | |
| Restriction enzyme RsaI | New England biolabs | R0167L | |
| Restriction enzyme 10x buffer | New England biolabs | R0167L | |
| Agarose | Sigma | A9539 | DNA fragments are best separated in TBE buffer |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| Boric acid | Sigma | B7901 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Sigma | E7889 | |
| 10% (wt/vol) ammonium persulfate | Sigma | E3678 | prepared fresh each time |
| EtBr (0.5 μg/μL) | Sigma | E8751 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
| Xylene cyanol FF | Sigma | X4126 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| DNA size marker | DIATECH pharmacogenetics | R1002-10 | Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI |
| Sterile water (autoclaved) | DIATECH pharmacogenetics | \\ |
References
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