Summary
현재에 연구, 우리 C924T 유전자 형을 분석 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜 구성 3 단계: DNA 추출, 연쇄 반응 (PCR), 및 agarose 젤에 제한 조각의 길이 다형성 (RFLP)의 분석에 의해 증폭.
Abstract
Thromboxane A2 수용 체 (TBXA2R) 유전자 7 막 횡단 영역 G-단백질 결합 superfamily의 구성원입니다. 그것은 atherogenesis 진행, 허 혈, 심근 경색에 관여. 여기 우리는 TBXA2 수용 체 유전자의 3' 지역에 위치한 C924T 다형성 (rs4523)의 post-transcriptional 역할을 조사 하기 위해 환자의 유전형의 방법론을 제시. 이 메서드는 전체 혈액에서 C924T 돌연변이 돌연변이 genotypes 제한 다이제스트 분석을 사용 하 여 야생 타입의 식별을 포함 하는 TBXA2 유전자 부분 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭 DNA 추출에 의존 구체적으로 제한 조각의 길이 다형성 (RFLP) agarose에 젤. 또한, 결과 TBXA2R 유전자 시퀀싱에 의해 확인 되었다. 이 메서드는 높은 효율과 PCR, 제한 효소 분석에 의해 C924T 다형성의 급속 한 식별 같은 몇 가지 잠재적인 이점을 갖추고 있습니다. 이 방법은 TBXA2R C924T 다형성에 대 한 환자 genotypes을 분석 하 여 플 라크 형성과 동맥 경화 진행에 대 한 예측 연구 수 있습니다. 이 방법의 응용 프로그램 atherothrombotic 프로세스, 위험, 아스피린 치료 그룹에서 특정 과목에서에 더 취약 과목을 식별 하는.
Introduction
TBXA2R 7 막 횡단 영역 널리 표현 되 고 세포 막 또는 세포내 구조1,2에 지역화는 G-단백질 결합 superfamily의 구성원입니다. TBXA2R 신호 통로 고급 동맥 경 화성 프로세스3에 포함 된다. TBXA2 수용 체의 증가 식 atherogenesis 진행 동안 시연 및 임상 이었고 실험 연구 허 혈 및 심근 경색4의 관련 역할을 보여주었다. C924T, TBXA2R 유전자의 단일 염기 다형성 (SNP) 건강 한 지원자에서 기능성 다형성으로 인식 되었다 고 임상 장애5에 연결 되었습니다. 또한 우리의 이전 연구6 시연 TBXA2R 유전자의 C924T 다형성은 사본 안정성;에 관여 특히, 야생 타입 (CC)에 관하여 돌연변이 (TT) 유형 증명서의 증가 불안정성이입니다. 또한, 아데노신 diphosphate (ADP), 피 네 프 린, 다양 한 농도에서 콜라겐 등 여러 자극 유발 돌연변이 유형 (TT)에 대 한 효과적인 더 적은 혈소판. 이것은 감소 된 혈전 형성과 hemostasis 일치 합니다. 따라서, TBXA2R 대 본의 불안정과 관련 된 혈소판 감소 수도 있습니다 연결 될 atherothrombosis와 그것의 합병증 위험이 높은 아스피린 치료 환자6 TBXA2R TT 유전자 형에 대 한 보호 역할 .
여기, 우리는 환자의 유전형 TBXA2 수용 체 유전자의 3' 지역에 위치한 C924T 다형성 (rs4523)의 post-transcriptional 역할을 조사 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 다음 단계에 의존: 전 혈에서 (1) DNA 추출, C924T 돌연변이, 그리고 (3) 야생 타입의 돌연변이 genotypes 제한 조각 길이 사용 하 여 id를 포함 하는 TBXA2R 유전자 부분 (2) PCR 증폭 다형성 (RFLP) agarose 젤에. RFLP 동종 DNA 시퀀스7변화를 이용 하는 기술입니다. 이 응용 프로그램이 검출 DNA 동 질 다 상, 특히 Snp를 찾아서 유전자 변이8생물학 관련성 연결 사용 되었다. 처음으로 인간의 RFLP PCR를 사용 하 여 분석 다형성 ABO 혈액9이었다. RFLP PCR 메서드는 매우 구체적인 금지 endonucleases10를 사용 하 여 DNA 소화 후 다른 길이의 파편의 존재를 평가 하 여 동종 DNA 시퀀스에서 유전자 변이의 분석을 수 있습니다.
지난 몇 년 동안, 다음 방법론 이용 되었습니다 SNP 분석 PCR 기술을 사용 하 여: 짧은 대립 유전자 특정 oligonucleotides11, 대립 유전자 특정 PCR12, DNA microarrays13, 뇌관 연장의 교 잡 oligonucleotide 결 찰14, Matrix-Assisted 레이저 탈 착/이온화 시간의-비행 (식별 위치 특정 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상15, Taqman 방법16, 추출에 대 한 시퀀싱 직접 DNA 분석 결과 MALDI-TOF) 질량 분석17및 GeneChips18. 이러한 기술을 사용 하 여 간단 하지 않습니다 그리고 비싼 장비를 요구할 수 있습니다. 반대로, PCR RFLP 방법 저렴 한, 사용이 간단, 편리, 높은 효율, 있으며 C924T 다형성의 급속 한 식별 수 있습니다. 또한, 우리15생어 메서드 사용 하 여 TBXA2R 유전자 시퀀싱 하 여 결과를 확인 했다.
이 방법은 TBXA2R C924T 다형성에 대 한 환자 genotypes을 분석 하 여 플 라크 형성과 동맥 경화 진행에의 한 예측 연구 수 있습니다. 이 방법을 식별할 수 있는 atherothrombotic 프로세스에 더 취약 과목 특히 높은 위험, 아스피린 치료 환자 가운데 그.
Protocol
프로토콜 티 대학교의 의학 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.
1. 시 약 설치
- 트리 스-EDTA (테) 버퍼 (pH 8.0)를 준비 합니다. 200 µ L의 0.5 M EDTA, 트리 스-Cl 1 M의 1 mL 비 커에 추가 하 고 메 마른 물 100 mL를가지고. TE 버퍼 최종 농도: 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA. 실내 온도 (RT)에 저장 합니다.
- 재고 솔루션 전기 이동 법 버퍼 (TBE) x 10의 1 리터를 준비 합니다. 분해 트리 스 기지의 108 g, 붕 소 산의 55 g, EDTA의 40 mL 비 커에 0.5 M (pH 8) 살 균 물 1 L의 볼륨을. 실시간에 저장소
- 염료를 로드 하는 젤을 준비 합니다. Bromophenol 블루, 크 실 렌 cyanol FF, 글리세롤, 60 mL에 EDTA (pH 8)의 1mm의 50 g의 0.25 g 이온 또는 증류수, 0.25 g을 녹이 고 멸 균 물 100 mL의 볼륨을. 4 ° C에서 (몇 개월) 또는-20 ° C에서 (년)
-
2 %agarose 젤 200ml를 준비 합니다. 사용 신선한 또는, 양자 택일로, 그것은 저장에 대 한 실시간에 몇 주까지 경화.
- 600 mL 비 커에 1 x TBE 버퍼의 200 ml에서 agarose의 4 g 용 해. agarose는 완전히 중단 될 때까지 약 5 분 동안 자기 믹서를 사용 하 여 저 어.
- (약 10 분 동안,는 agarose는 완전히 용 해 될 때까지) 핫 플레이트 또는 끓는 물에 2 %agarose 솔루션을 열. 참고 agarose 젤 비 커 알루미늄 호 일로 덮여 있어야 합니다. 또는, 약 3-5 분에 대 한 높은 온도에서 전자 레인지에 발견된 비 커를 열.
- 마그네틱 믹서는 agarose는 완전히 용 해 검사를 사용 하 여 2 %agarose 솔루션을 소용돌이 친다.
참고: 입자 agarose의 완전 한 해체 이전 반투명 곡물으로 나타납니다. 그것은 몇 분 (약 5-10 분) 동안 데워 입자에 필요할 수 있습니다. - 경우의 저장된 부분 agarose 젤 사용, 열 비 커, 알루미늄 호 일로 덮여는 agarose까지 (약 60 ° C)에서 뜨거운 물을 욕조에 녹아. "흔적" 응고 agarose의 표면에서 따르기 이전 파스퇴르 피 펫을 제거 합니다.
2. DNA 정화
-
정화를 시작 하기 전에 다음을 수행:
- 인간의 신선한 전 혈 샘플을 사용 하 여 또는 전체 혈액 샘플 신속 하 게 (약 2-3 분) (37 ° C)에서 물 욕조에 온화한 동요 적용 냉동을 해 동 하 고 equilibrate RT를 사용 하기 전에.
- 혼합 신선한 또는 해 동 혈액 샘플 튜브를 여러 번 반전.
- 차입 볼륨의 100 µ L에 대 한 공급 업체의 프로토콜에 따라 정화 절차를 시작 합니다.
-
계량 및 260, 280, 320에서 흡 광도 측정 하는 DNA의 순도 계산 nm.
- 샘플을 희석 하기 위해 살 균 물을 사용 하는 분 광 광도 계를 보정 합니다.
- DNA 샘플의 농도 계산 하려면 다음 수식을 적용 = 50 µ g/mL (는260 − A320) x 희석 비율과 DNA의 순수성을 x = (는260 − A320) / (는280 − A320), 허용 비율 1.7 1.9 사이.
3. PCR 증폭 DNA 샘플의
- 표 1에서 보는 바와 같이 0.2 mL 마이크로 증폭 튜브에 반응 혼합물의 25 µ L를 준비 합니다.
- 자동화 된 열 cycler, 표 2에 표시 된 확대 프로그램을 사용 하 여 순화 된 DNA 샘플의 PCR 증폭을 실시 합니다.
- PCR 확대의 끝에, 4 ° c.에 DNA 샘플을 떠나는 하 여 PCR 반응 중지
4입니다. PCR 제품의 RFLP
- 그렇게 선택한 금지 효소 다이제스트 PCR 제품, 표 3에서 같이 각 샘플에 대 한 마스터-믹스 솔루션의 22.5 µ L를 준비 합니다.
- 피 펫 필터 팁을 사용 하 여 각 샘플에 대 한 새로운 PCR 튜브에 PCR 제품의 2.5 µ L를 전송.
- 포함 하는 피 펫 필터 팁을 사용 하 여 각 샘플의 PCR 제품 튜브를 소화 마스터-믹스 솔루션의 22.5 µ L를 추가 합니다.
- 4 h 37 ° C에서 반응 혼합물 (마스터 믹스 솔루션 및 PCR 제품)를 품 어.
5. 젤 전기 이동 법 분석의 PCR RFLP 샘플
- 얼룩은 0.5 µ g/mL에서 10 분 EtBr에 젤 ethidium 평범한 사람 (EtBr)를 추가 하 여 agarose 젤 자외선 (UV) 빛 아래 구상 될 수 있다 DNA에 바인딩합니다.
주의: 그건 처리, 저장 및 처리, EtBr의 중 장갑 및 기타 보호 장치를 사용 하는 것이 중요 때문에 잠재적인 발암으로 등재. - 부 어 장소에 잘 빗 젤 트레이에 준비 agarose 젤 하 고 응고가 될 때까지 기다립니다.
- 응고 agarose 젤을 젤 상자 (전기 장치)에 놓습니다.
- 1 젤 상자 채우기 x TBE 젤 커버까지.
- 피 펫 및 필터 팁, agarose 젤의 우물으로 증폭 된 다이제스트 DNA (특히, 각 샘플의 부하 5 µ L 및 염료를 로드 하는 젤의 1 µ L)의 6 µ L을 로드 합니다. 잘와 예제와 함께 동시에 별도 DNA 크기 마커를 추가 합니다.
- 100 V에서 20-30 분 젤을 실행 합니다.
- UV transilluminator 쪼개진된 DNA 파편 또는 파편 DNA 크기 마커에 비교 소화 되지 않은 PCR 제품 시각화와 제조업체의 지침에 따라 사진에 의해 결과 등록.
주의: UV 광원 주위 보호 장치 (안전 안경 또는 얼굴 마스크)를 사용 합니다.
Representative Results
이 방법의 목표 C924T 다형성에 관해서는 Thromboxane A2 수용 체 유전자 형을 평가 하는 것입니다. 인간 TBXA2R 유전자는 19p13.3에, 15 kbp에 걸쳐 있으며 두 introns를 구분 하는 3 개의 exons의 구성 됩니다. TBXA2R 유전자의 C924T 동 질 다 상 (539의 bp) 그림 1에 표시 된 잘 설계 된 특정 DNA 영역 하지만 아니라 orthologous 또는 paralogous 일반적인 지역 증폭 된 PCR 뇌관을 사용 하 여 증폭 되었다. 또한, RFLP 분석 PCR 제품에는 RsaI 제한 효소 (그림 1)를 사용 하 여 수행 하 고 결과 특정 공부 SNP 성격을 나타내기 위하여는 agarose 젤에 시각화 했다.
DNA의 소화 후 다른 조각 길이의 존재에 따라, C924T 다형성에 대 한 환자의 유전자 형 판별 가능 하다. 사실, 그림 2에 표시 된 주요 대립 유전자 (CC)의 homozygosity 제한 효소는 정확 하 게 C924T 다형성 사이트에서 TBXA2R 유전자 부분을 잘라냅니다 때문에 두 개의 밴드 (395 및 144 혈압) 표시 됩니다. 사소한 대립 유전자 (TT)의 homozygosity 단일 밴드에 의해 설명 된다 (539 bp), 제한 효소 절단 발생 하지 않습니다 때문에. Heterozygous (CT) 대립 유전자 표시 3 밴드 (539, 395, 및 144 bp). 그림 2에서처럼 RsaI 소화 PCR 제품에 의해 정의 된 C924T 다형성 시퀀스 분석에 의해 확인 됐다.
| 구성 요소 | 볼륨 (µ L) | 최종 농도 |
| PCR 버퍼 트윈-20 (15 M MgCl2) x 10 | 0.25 | 1.5 MgCl2 mmol/L |
| dNTP 믹스 (10mm) | 1 | 200 Μ M |
| 뇌관 (앞으로) (10 pmol / µ M) | 1 | 0.4 Μ M/Μ L |
| 뇌관 (역) (10 pmol / µ M) | 1 | 0.4 Μ M/Μ L |
| Taq 중 합 효소 (5 U / µ L) | 0.2 | 1 U/Μ L |
| DNA 샘플 (42 ng / µ L) | 1 | 42 기 / µ l |
| DNase 무료 물 | 20.55 | |
| 총 | 25 |
표 1: PCR 증폭 설치. 25 µ L 마스터 혼합 반응 혼합물 증폭 한 DNA 샘플을 0.2 mL PCR 튜브에 설정.
| 표준 PCR | |||
| 초기 활성화 단계 | 5 분 | 95 ° C | |
| 3 단계 자전거 | |||
| 변성 | 30 s | 94 ° C | |
| 어 닐 링 | 60 s | 55 ° C | |
| 확장 | 60 s | 72 ° C | |
| 사이클 수 | 30 사이클 | ||
| 마지막 확장 | 8 분 | 72 ° C | |
표 2: PCR 증폭 프로그램. PCR을 수행 하 고 템플릿 DNA 증폭 자동된 열 cycler를 설정 합니다. PCR 반응 4 ° c.에서 놀 아 요 여 중지
| 구성 요소 | 볼륨 (µ L) (n = 1) | 볼륨 (µ L) (n = 10) * |
| 효소 버퍼 x 10 | 2.5 | 27.5 |
| 제한 효소 (5 U / µ L) | 0.5 | 5.5 |
| DNase 무료 물 | 19.5 | 214.5 |
| 총 | 22.5 | 247.5 |
표 3: PCR 제품의 금지 효소 소화. 믹스 마스터 솔루션을 선택한 금지 효소 다이제스트 PCR 제품 준비가 되어 있습니다. *: 10 샘플에 대 한 마스터-믹스 솔루션을 설정 하려면, 추가 10% 이상, 마침내 11 샘플을 만들고.
그림 1: PCR 뇌관 및 RsaI 금지 효소. 정방향 및 역방향 뇌관 539의 TBXA2R 유전자 부분을 증폭을 위한 bp C924T 다형성을 포함. RsaI는 제한 효소 인식 GTAC 사이트를 선정. ˅: RsaI 효소의 절단 사이트. C(/T): C924T 동 질 다 상 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 전기 이동 패턴 및 DNA 순서 분석. 특정 RsaI 효소 소화 후 (A) 유전자는 RFLP에 의해 인식 된다 C924T 패턴입니다. (B) DNA 순서 분석: 결과 RFLP RsaI 제한 효소로 소화 후 C924T 다형성을 보여주는 시퀀스 분석을 사용 하 여 확인 되었다. 이 그림은 De Iuliis 그 외 여러분, Prostaglandins 및 다른 지질 중재자6에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
현재 연구에서 우리는 TBXA2R 유전자의 3' 지역에 위치한 C924T 다형성 (rs4523)의 post-transcriptional 역할을 조사 하기 위해서는 환자의 유전형을 허용 하는 방법을 설명 했습니다. 첫째,이 메서드는 전체 혈액 으로부터 DNA 추출에 의존합니다. 특히,이 첫 번째 과정 이루어져 총 인간 DNA, 게놈 및 미토 콘 드리 아, 신선 또는 냉동, 전체 혈액 샘플에서의 정화 EDTA (구 연산 염 또는 헤 파 린)으로 치료. 전체 혈액 샘플의 단기 저장, 최대 10 일 동안 2-8 ° C에 저장 합니다. 스토리지에 대 한 일 이상,-70 ° c.에 샘플 저장 자동된 정화 과정 4 단계 구성: lyse, 바인딩, 세척, 그리고 elute. 둘째, 방법은 C924T 돌연변이 포함 하는 TBXA2R 유전자 부분의 PCR 증폭에 의존 합니다. 마지막으로, 야생 타입 agarose 젤에 제한 효소 분석 (RFLP)을 사용 하 여 돌연변이 유전자의 식별 수행 됩니다.
중요 한 단계는 프로토콜에는 다음: (i) agarose 젤의 일부에 저장 하는 경우에 RT 사용, 응고 agarose (약 15-20 분 동안 60 ° C)에 끓는 물을 욕조에 다시 녹아 수 또는 렌지 (3-5 분) 따르기 이전에. 참고: 때 다시 agarose 병에 뚜껑을 풉니다. (ii), 또한 때 다시 agarose, 난방 증발 하면 그 농도의 증가. 이러한 이유로, 물 한 작은 볼륨을 추가 하 여 보상에 유용할 수 있었다. (iii) DNA 파편의 미만 1000 bp는 agarose 젤에 의해 분화 되었다와 TBE 버퍼 최상의 가능한 분리를 얻을 것이 좋습니다. (4) 우리 때문에 후자의 준비 더 어렵습니다, 그리고 그것은 설정 하는 데 시간이 더 오래 걸립니다 polyacrylamide 젤 보다는 agarose 젤을 사용 하 여 선호 합니다. (젤 전기 이동 법의 실행 시간 v)는 선택 증폭 제품의 예상된 크기에 의존합니다. 이 프로토콜에 따라, 그것은 20-30 분 2 %agarose 젤에 100 V에서 전기 이동 법을 수행 하기에 충분 한, PCR의 크기 조각 범위 100-500 bp. (vi)에서 10 ~ 50를 필수이 좋은 품질 템플릿 인간의 샘플에서 추출 된 DNA의 ng . 이러한 이유로, 우리는 반자동 또는 수동 한 실행 하는 것이 아니라 자동된 DNA 정화를 사용 하 여 선호 합니다. (vii) PCR 증폭에 대 한 마스터-혼합 반응 및 PCR 제품 소화, 볼륨 (pipetting 동안 액체의 손실에 대 한 계정)에 10% 더 추가 대 한 마스터-믹스 솔루션 필요 볼륨에 대 한 샘플의 수를 곱한 계산 준비 하나의 DNA 샘플에 대 한.
방법의 가장 빈번한 문제는 잘못 된 열 cycler 프로그램, 잘못 된 증폭 마스터-믹스 준비, 또는 DNA 템플릿 오염 추가 증폭 제품의 존재 이다. 게다가, PCR 제품의 부재 비활성된 Taq 중 합 효소 또는 잘못 된 열 cycler 실행 될 수 있습니다. 또한, 예기치 않은 파편의 존재에서 불활성된 효소, 너무 적은 양의 제한 효소 볼륨, 또는 너무 짧은 보육 시간 PCR 제품 오염 또는 불완전 한 소화에 있을 수 있습니다.
지난 몇 년 동안, 다음 방법론 PCR 기법을 사용 하 여 SNP 분석에 대 한 이용 되었습니다: 짧은 대립 유전자 특정 oligonucleotides11, 대립 유전자 특정 PCR12, DNA microarrays13에 뇌관 연장의 교 잡 , oligonucleotide 결 찰14시험, 직접 위치 특정 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상15, Taqman 방법16, 추출 Matrix-Assisted 레이저 탈 착/이온화 식별을 위한 DNA 시퀀싱 시간의 비행 (TOF MALDI) 질량 분석17, 그리고 GeneChips18. 간단한 사용 및/또는 비싼 장비를 요구 하지 않기 때문에 이러한 방법은 적합 되지 않습니다. 반대로,이 연구에서 설명 하는 PCR RFLP 방법을 저렴 한, 사용이 간단, 편리, 높은 효율, 있으며 C924T 다형성의 급속 한 식별 수 있습니다. 현재 메서드는 제한은 것만 사용할 수 소수 Snp 및 작업 세션에 몇 가지 샘플입니다.
미래의 응용 프로그램에 대 한 TBXA2R C924T 다형성에 대 한 환자 genotypes을 분석 하 여 플 라크 형성과 동맥 경화 진행에 관한 예측 연구를 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. 또한,이 메서드는 atherothrombotic 프로세스에 더 취약 과목을 식별할 수 있는, 특히 위험이 높은 환자 아스피린으로 치료. 마지막으로,이 방법은 적절 한 약물 복용량과 개별 약리를 이해 하기 위해 다른 동 질 다 상 특정 약물 (예, 응고 및 경련)에 대 한 맞춤된 의학에 관련 된 연구에 적용할 수 및 치료를 시작 하기 전에 하 고 부작용을 피하기 위해 각 환자에 대 한 임상 응답.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 Ateneo Ministero dell' 사크, S.M., 및 동부에 이탈리아에서에서 부여 하는 60%에 의해 부분적으로 투자 되었다 우리는 또한 의료 학과, 구강 및 바이오 과학, 티 "G. d'Annunzio"의 대학 비용을 연구에 일부 기여를 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAsymphony SP | QIAGEN | 937055 | |
| Spectrophotometer | EPPENDORF | 6131-02222 | |
| UV-transilluminator | UVP | 732-110 | |
| PCR tubes | EPPENDORF | H0030121589 | |
| PCR thermal cycler | EPPENDORF | 5331-03721 | |
| Pipettors and filter tips | EPPENDORF | H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02 | |
| Horizontal minigel electrophoresis apparatus | DIATECH PHORESIS 10 | RI002-10 | |
| Dry block heater | TWIN INCUBATOR | DG210 | |
| QIAsymphony DNA Midi Kit | QIAGEN | 931255 | |
| 10x PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase) | DIATECH AND TAKARA | T0100 AND R0001DM | |
| Taq polymerase | TAKARA | R0001DM | |
| dNTP mixture | DIATECH pharmacogenetics | NM001 | dNTP MIX 10x 100 microliters, 10 mM |
| PCR primers | DIATECH pharmacogenetics | \\ | |
| Restriction enzyme RsaI | New England biolabs | R0167L | |
| Restriction enzyme 10x buffer | New England biolabs | R0167L | |
| Agarose | Sigma | A9539 | DNA fragments are best separated in TBE buffer |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| Boric acid | Sigma | B7901 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Sigma | E7889 | |
| 10% (wt/vol) ammonium persulfate | Sigma | E3678 | prepared fresh each time |
| EtBr (0.5 μg/μL) | Sigma | E8751 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
| Xylene cyanol FF | Sigma | X4126 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| DNA size marker | DIATECH pharmacogenetics | R1002-10 | Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI |
| Sterile water (autoclaved) | DIATECH pharmacogenetics | \\ |
References
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