Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ביצוע הנוצרות על-ידי ההטיה של חלקיקים דמויי וירוס PEGylated פלורסנט מאת כימיה Dibromomaleimide-דיסולפידי

Published: May 27, 2018 doi: 10.3791/57712
Automatic Translation
1, 2, 3, 4
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of Texas at Dallas, 2Undergraduate Biology, University of Texas at Dallas, 3Undergraduate Healthcare Studies, University of Texas at Dallas, 4Departments of Chemistry & Biochemistry and Biomedical Engineering, University of Texas at Dallas

Summary

כאן, אנו מציגים את הליך כדי fluorescently functionalize את disulfides על האח מים Qβ עם dibromomaleimide. אנו מתארים Qβ ביטוי טיהור, הסינתזה של מולקולות dibromomaleimide-functionalized, ואת התגובה ההטיה בין dibromomaleimide לבין Qβ. וכתוצאה מכך צהוב הניאון מצומדת החלקיק יכול לשמש מכשיר בדיקה קרינה פלואורסצנטית בתוך תאים.

Abstract

העלייה האחרונה חלקיקים דמויי וירוס (האח מים) בביו, מחקר בנושא החומרים ניתן לייחס שלהם קלות ביוסינטזה, דיסקרטית, תיכנות גנטי בגודל biodegradability. בזמן שהם לבצע bioconjugation תגובות עבור הוספת ליגנדים סינתטי אל פני השטח שלהם, הטווח ב bioconjugation מתודולוגיות על אלה capsids נולד מימית מצומצמת יחסית. כדי להקל על הכיוון של biomaterials פונקציונלי מחקר, יש לקחת בחשבון תגובות bioconjugation לא מסורתיות. התגובה שמתואר פרוטוקול זה משתמש dibromomaleimides כדי להציג את הפונקציונליות החדשה של הממס דיסולפידי חשוף חוב של מישהו מיוחד המבוסס על Bacteriophage Qβ. יתר על כן, המוצר הסופי הוא פלורסנט, אשר יש ערך מוסף של יצירת החללית מאתריהם במבחנה באמצעות ערכת מסנן זמינים מסחרית.

Introduction

שימוש בגודל ננו capsids ויראלי התפתחה שדה מרגש, שמטרתה להרחיב את טווח יישומי מחקר ביו1,2,3. חלקיקים דמויי וירוס ביטוי recombinantly (האח מים) נגזרות מבנית וירוסים, אך הם חסרים את החומר הגנטי הנגיפי המקורי שהופך אותם חלקיקים proteinaceous שאינן זיהומיות. תכונות פני השטח הם programed גנטית, כל capsid מתבטא באופן זהה לאלה לפני ואחרי זה, זה אפשרי לדעת את המיקום ואת מספר שרשראות צד תגובתי חומצות אמינו בדייקנות קואורדינטות. במקרים רבים, הן פנים וחוץ המשטחים בעלי סוגים רבים של שאריות ממס חומצת אמינו חשוף, אשר יתכן כבניין יכול להיות functionalized דרך bioconjugation תגובות - תגובות היוצרים קשרים הדדיים בין של biomolecule סינתטיים מולקולה4,5.

תגובות Bioconjugation לעזור מולקולות של עניין יש פונקציות יותר מגוונת בצורה פשוטה יחסית. מולקולות של עניין, כגון תרופות טיפוליות6, תגיות פלורסנט7 ופולימרים8,9 יכול להיות טרום מסונתז והוא מאופיין לפני הן מצורפות על-פני האח מים. . אח נפוץ במיוחד בביו biomaterials המחקר היה האיש החשוב בהתבסס על Bacteriophage Qβ, אשר, כפי recombinantly ביטוי, הוא capsid ויראלי icosahedral 28 nm10. האתרים התגובה הנפוצה ביותר על Qβ הם lysines על ידי מרווח רחב, אבל לנו יש לאחרונה תקשרו את ההטיה מוצלחת11 של תרכובות dibromomaleimide disulfides מופחת המרפדים את הנקבוביות של Qβ באמצעות תגובה Haddleton-בייקר. התגובה ממשיך עם טוב תשואות, לא פחות חשוב, בלי לאבד את יציבות תרמית של החלקיקים. במקביל, התגובה הזו יוצרת ההטיה-induced פלורסצנטיות, בו ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר את ספיגת חלקיקי האלה לתוך התאים. בעבודה זאת, נדגים את ההטיה של פוליאתילן גליקול (PEG) על פני Qβ דרך התגובה Haddleton-בייקר, כשהתוצאה fluorophore צהוב בהיר. לאחר מכן ניתנים למעקב חלקיקים אלה כאשר הם נלקחים ידי תאים. פרוטוקול בזאת יסייע החוקרים ליצור חדש PEGylated פלורסנט חלקיקים proteinaceous בהתבסס על Qβ, על פי עקרונותיה חלים אחד רבים אחרים האח מים המכיל disulfides חשוף הממס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה

  1. להפוך Lysogeny מרק (LB) אגר ויוצקים צלחות12.
  2. בעקבות BL21(DE3) פלסמיד pET28 המכיל את רצף החלבון של המעיל wtQβ.
    1. הפשרת e. coli BL21(DE3) תאים המוסמכת באמבט קרח. במקום 50 μL של תאים צינור microcentrifuge.
    2. להוסיף 2 μL של פלסמיד לתוך שפופרת אחת וחבוט בעדינות את הצינור. ואז תדגור על קרח למשך 30 דקות
    3. מכת החום התאים עבור 45 s באמבט מים זה בדיוק 42 מעלות צלזיוס. מקם את הצינור בחזרה באמבט קרח מיד לאחר חום-מזעזע, ולאחר תקופת דגירה של 5 דקות.
    4. הוסף μL 950 של מדיה LB שאינה מכילה כל אנטיביוטיקה.
    5. לנער את התרבות ב rpm 200 עבור 60 דקות ב 37 º C.
    6. צלחת 100 μL של התרבות על פלטות אגר ליברות (עם Kanamycin), דגירה את הצלחת בן לילה ב 37 º C. בחר מושבות לבן בעת הצורך.
  3. להפוך את המדיה סופר אופטימלית מרק (בכי).
    1. אוטוקלב בשני 2 L התפישה Erlenmeyer המבחנות על מחזור superdry.
    2. בסביבת aseptic, שוקל להוסיף 20.0 גר' טריפטון, 5.0 גר' שמרים לחלץ, g 2.469 של מגנזיום סולפט נטול מים, g 0.584 של נתרן כלורי ו- g 0.186 של אשלגן כלורי את כל הבקבוק.
    3. להביא את אמצעי האחסון 1 ליטר עם מים הנדסה גנטית כל הבקבוק, תא לחץ על מחזור נוזלי.
    4. ברגע שהתקשורת סוחטי דמעות הגיע לטמפרטורת החדר לאחר autoclaving, להוסיף 1 מ ל kanamycin (100 מ"ג/מ"ל) כל ליטר מדיה ולאחסן ב 4 º C.
  4. להפוך 0.1 M אשלגן פוספט מאגר (pH 7.00).
    1. להפוך את פתרון monobasic של אשלגן 1 מ' על ידי המסת g 68.045 של אשלגן monobasic ב 500 מ"ל מים הנדסה גנטית.
    2. להפוך את פתרון dibasic של אשלגן 1 מ' על ידי המסת g 87.09 של אשלגן dibasic ב 500 מ"ל מים הנדסה גנטית.
    3. להוסיף 38.5 מ של פתרון monobasic אשלגן ו- mL 61.5 אשלגן dibasic בקבוק 1 ליטר.
    4. להתאים את ה-pH עד 7.00 במידת הצורך, ולהביא נפח של 1 ל'
  5. להפוך 5-40% סוכרוז מעברי צבע 0.1 M אשלגן פוספט מאגר (pH 7.00).
    1. 50 מ ל צנטריפוגה צינורות, להכין פתרונות עם סוכרוז 5-40% (עולה במרווחים של 5%) מומס 0.1 M אשלגן פוספט מאגר (pH 7.00).
    2. להפקיד 3.3 מ של 5% סוכרוז פתרון בחלק התחתון של צינור עגול-התחתון פוליקרבונט 38 mL באמצעות מזרק מחט ארוכה, חזור על הפעולה עבור חמישה צינורות אחרים.
    3. בזהירות להפקיד 3.3 מיליליטר 10% סוכרוז הפתרון בתחתית הצינורית, הסר בזהירות את המחט כדי לא להפריע במעבר הצבע. חזור על הצינורות חמישה אחרים.
       
  6. להמשיך להפקיד 3.3 mL שכבות של פתרונות סוכרוז, גדל מ- 15% ל 40% בכל שפופרת, בעת היותו זהירים כדי לא להפריע במעבר הצבע.
  7. כשהפעולה תסתיים, לכסות את החלק העליון של מעברי הצבע בנייר כסף ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.

2. הבעת Qβ

  1. נגב ספסל אזור עם אקונומיקה 1:1 / אתנול.
  2. להפוך שתי תרבויות starter מ ל 3 סביבה aseptic על-ידי הוספת מושבות יחיד של e. coli BL21(DE3) לתוך 3 מ"ל של מדיה סוחטי דמעות סביבה אספטי.
  3. גדלים על מטרף-250 סל"ד בחדר לחות יחסית (rH) 37 ° C ו- 0% בין לילה.
  4. לחסן starter תרבות בתקשורת סוחטי דמעות:
    1. תורידי את שתי התרבויות starter מ ל 3 ניעור, בסביבת aseptic, שופכים את כל תרבות starter לתוך אחד של שני 2 ל' התפישה Erlenmeyer מבחנות עם 1 ליטר של מדיה סוחטי דמעות טריים בכל אחד.
    2. למקם את המדיה חוסנו במטרף-250 סל"ד בחדר rH 37 ° C ו- 0%.
  5. מגדלים את החיידקים על מטרף-250 סל"ד בחדר rH 37 ° C ו- 0% עד OD600 מגיע 0.9 – 1.0.
  6. להוסיף 1 מ"ל של 1 מ' איזופרופיל β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) באמצעות פיפטה P1000 לזירוז ביטוי חלבון.
  7. להשאיר את המדיה ניעור ב 250 סל"ד בחדר rH 37 ° C ו- 0% בין לילה.
  8. להסיר מדיה מהמכשיר ניעור את למחרת בבוקר צנטריפוגה אותו באמצעות 1000 mL בקבוקים ב 20,621 × g עבור h 1 ב 4 ° C כדי לקצור את התאים.
  9. למחוק את תגובת שיקוע ולאסוף בגדר התא.
    1. שופכים את תגובת שיקוע לתוך בקבוקון עם בערך 5 מ"ל של אקונומיקה כדי להרוג חיידקים. . זה בזבוז.
    2. השתמש מרית לגרד בגדר תא מתחתית הבקבוק צנטריפוגה ולשים בגדר לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ.

3. טיהור של Qβ

  1. Resuspend בגדר תא עם ~ 20 – 30 מ של 0.1 M אשלגן פוספט מאגר (pH 7.00).
  2. ודא resuspension יש אין גושים, ואת lyse התאים באמצעות מעבד microfluidizer לפי הפרוטוקול של היצרן (ראה טבלה של חומרים). Lyse התאים לפחות פעמיים כדי להגדיל את התשואה של החלקיקים.
  3. Centrifuge את lysate בבקבוקי צנטריפוגה 250 מ ל- 20,621 x g עבור משאבי אנוש 1-4 מעלות צלזיוס.
  4. למחוק את צניפה, למדוד את עוצמת הקול של תגובת שיקוע ב- mL. הכפל את הערך ב- 0.265 ומוסיפים הכמות כזו של g של אמוניום סולפט תגובת שיקוע.
  5. מערבבים ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה על צלחת stir ב 200 סל ד, כדי לזרז את החלבון.
  6. צנטריפוגה בבקבוקי 250 מ ל- g x 20,621 עבור h 1-4 מעלות צלזיוס.
  7. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר עם 10 מ ל 0.1 M אשלגן פוספט מאגר (pH 7.00).
  8. להוסיף נפחים שווים של 1:1 כלורופורם/n-butanol דגימת גולמי ומיקס על ידי vortexing למשך כמה שניות.
  9. צנטריפוגה צינורות 38 mL ב 20,621 × g במשך 30 דקות ב 4 º C.
  10. לשחזר את השכבה העליונה מימית באמצעות פיפטה של פסטר. להיות זהיר לא לקחת הג'ל כמו שכבת הקימה בין השכבה המימית ואורגניים.
  11. הפשרת 6 5-40% סוכרוז מוכנות מראש מעברי צבע וטען בערך 2 מ ל התמצית על גבי כל אחד.
  12. Ultracentrifuge-99,582 g x עבור h 16 ב 4 ° C עם ההאטה חינם.
  13. אור פליטת אור דיודה (LED) תחת כל שפופרת, להקת כחול צריך להיות גלוי. לשחזר החלקיקים עם מזרק מחט ארוכה.
  14. Ultrapellet החלקיקים ב g x 370,541 עבור h 2.5-4 מעלות צלזיוס.
  15. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר שקוף של חלקיקים מטוהרים עם 0.1 M אשלגן פוספט מאגר (pH 7.00).

4. כמת ואישור של המוצר

  1. השתמש ברדפורד Assay לכמת את המוצר13.
  2. הפחתת לרוץ, ללא הפחתת dodecyl נתרן גופרתי לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד) כדי לאשר את המוצר14.
    הערה: הפחתת מרחביות-דף משמש כדי לאשר את המשקל המולקולרי של המעיל חלבון; אי-הפחתת מרחביות-דף הוא לאשר את מבנה סדר גבוהה יותר.

5. conjugating DB והמתחמים Qβ

  1. להפחית את disulfides על Qβ.
    1. להמיס 0.0020 גר' tris(2-carboxyethyl) פוספין (TCEP) לתוך 1 מ"ל של מים הנדסה גנטית כדי ליצור פתרון 100 x מניות.
      הערה: להכין TCEP טריים לפני צמצום.
    2. להוסיף 200 µL של Qβ (5 מ"ג/מ"ל) לתוך צינור microcentrifuge.
    3. פעל על-ידי הוספת 20 µL של 100 x TCEP פתרון מניות.
    4. דגירה בטמפרטורת החדר מאובטח.
  2. מחדש גשר דיסולפידי מופחתת באמצעות dibromomaleimide פוליאתילן גליקול (DB-PEG).
    1. להמיס 0.0017 גר' dibromomaleimide-פוליאתילן גליקול (DB-PEG) ב- µL 100 של DMF.
    2. הוסף µL 680 בפתרון סודיום פוספט (pH 5.00) של 10 מ מ.
    3. להוסיף מופחת Qβ לתוך הפתרון של DB-יתד ולבחון את תהליך ערבוב תחת מנורת UV nm 365. קרינה פלואורסצנטית צהוב בהיר ניתן לאבחן באופן מיידי עם 365 nm כף יד מנורת UV על ערבוב.
    4. . הנה התגובה המשך ללילה בטמפרטורת החדר (RT) על לירג
  3. לטהר את תערובת התגובה על-ידי מסנן צנטריפוגליות (COMW = 10 kDa) שלוש פעמים באמצעות 1 x PBS ב 3,283 x g עבור 20 דקות ב 4 º C.
  4. לפקח על הבניין על ידי אי-הפחתת מרחביות-דף agarose יליד בג'ל.
    הערה: האח מים לרוץ כמו חלקיקים שלמים ביליד agarose ג'ל, הם מופרדים בהתבסס על תשלום, הגודל והצורה שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

יכול להיות מסונתז נגזרים dibromomaleimide דרך תגובת דחיסה בין אנהידריד dibromomaleimide אמינים ראשי15. לחלופין, שיטה סינתטית מתון16 באמצעות הפעלת N-methoxycarbonyl 3,4-dibromomaleimide נוצל כאן מגיבים methoxypolyethylene גליקול (PEG) כדי התשואה DB-יתד (איור 1). NMR שימש כדי לזהות את המבנה המורכב (איור 2). הוי Qβ הוא 28 nm icosahedral proteinaceous ננו-חלקיק, אשר מורכב של חלבונים זהים המעיל 180. החלבונים המעיל נוטים ליצור הדימרים שלובים noncovalent דרך שלהם תחומים α-לוליינית עם הסדינים-β של חלבונים סמוכים המעיל17. האח מים נוטים לבחור שלהם יציבות בטמפרטורות גבוהות, pHs קיצוני, ואת יצירות בממיסים שונים18. במקרה זה, Qβ הוי יציב יותר phages RNA אחרים במשפחה Leviviridac בשל חוב דיסולפידי סטרנד בין 180 הממוקמת חמש ושש-קיפול צירי הסימטריה ב capsid19 (איור 3). מבנים אלה hexameric ו- pentameric מקושרים באמצעות disulfides, אשר ניתן לאבחן על ידי אי-הפחתת מרחביות-דף19. עשר במקבילות של TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine) (0.70 µmol), ביחס disulfides ב 1 מ ג של Qβ (חלבון המעיל µmol 0.070, 0.070 µmol disulfides), שימשו כדי להפחית את כל disulfides לייצר אחד את capsids Qβ מופחת (rQβ) בטמפרטורת החדר ואת שאינו בהפחתת מרחביות-דף מציג את כל המבנים גבוהים יותר סדר הצטמצם. המעיל monomeric חלבונים (איור 4 , איור 5A). התגובה rebridge אותם נעשה סינטזה סיר אחד, כפי התערובת rQβ גולמי נוספו ישירות 20 במקבילות של פתרון של DB-יתד (1.4 µmol) בסודיום פוספט (10 מ מ, pH 5.00, 10% DMF) בעקבות התגובה הפחתת שעה11. היה הנצפה פלורסצנטיות צהוב בהיר תחת המנורה nm UV 365 (איור 5D) מיד לאחר תוספת של DB-פג. התערובת ואז, נדגרה ב RT בן לילה על לירג, ואחריו טיהור באמצעות צנטריפוגלי מסנן (MWCO = 10 kDa) שטיפה בעזרת המאגר הרצוי שלוש פעמים כדי להסיר כמויות עודפות של מולקולות קטנות. Conjugates Qβ-malemide היו resuspended בתוך תמיסת סודיום פוספט 10 מ מ (pH 5.00) כדי לקדם את פוטוסטביליטי. הבניין אושר על-ידי ללא הפחתת מרחביות-דף תחת UV ו coomassie כחול מכתים (איור 5A). כל הלהקות הראה קרינה פלואורסצנטית (איור 5A) מתחת UV אשר colocalized עם הכחול coomassie מכתים, ייצוג של נטיה מוצלחת. על conjugates Qβ-יתד השלמות שאושרו על-ידי agarose יליד ג'ל אלקטרופורזה ושידור מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) (איור 5B, ג).

ידי קרינה פלואורסצנטית ספקטרוסקופיה הראה את מקסימה עירור, פליטה של Qβ-maleimide (Qβ-Μ), Qβ-יתד להיות כ- 400 nm ו 540 – 550 ננומטר, בהתאמה (איור 6). זה יתיישר עם ערכת מסנן GFP-uv זמינים מסחרית, עירור של מי הוא 405 ננומטר, פליטה הוא 500 – 540 nm. היישור הנוחים של מאפייני photophysical conjugates עם המסנן זמין מסחרית מגדירה היתר שימוש Qβ-יתד במבחנה הגישוש, אשר נעשה עם תמונה איור7. Qβ-יתד (200 ננומטר) היה מתפשט עם העכבר גלם-264.7 תאים ללא סרום DMEM בינוני, ואחריו גרעין מכתים. תמונות colocalization איור 7 מראה חלקיקים פלורסנט צהובות היו uptaken על ידי תאים 264.7 גלם ניתן לעקוב אחרי ארבע שעות של דגירה. האח מים Qβ unfunctionalized מראים פלורסצנטיות זניח.

Figure 1
איור 1: ערכת סינתטי של DB-יתד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: אפיון NMR. (א) 1 H NMR ו- (ב) 13C של DB-יתד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: מבנה לחקר הגבישים של capsid Qβ הוי כמו עיבוד כימרה (PDB מזהה: 1QBE). שני שאריות ציסטאין (Cys 74 ואת Cys 80) מוצגים כתום.

Figure 4
איור 4: ערכת ההטיה של Qβ-maleimide (Qβ-מ') conjugates. Qβ (0.07 µmol של disulfides) הופחת בעזרת מקבילות 10 TCEP (0.7 µmol) ב RT למשך שעה אחת ואחריה תוספת של 20 במקבילות של תרכובות dibromomaleimide (DB ו- DB-יתד) (1.4 µmol). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: אפיון של Qβ, rQβ, Qβ-M ו- Qβ-יתד. (א) להפחתת שאינם מרחביות-דף ו- (B) יליד agarose ג'ל של Qβ, rQβ, Qβ-M וכחול Qβ-יתד תחת UV (למעלה) ו- coomassie מכתימים (למטה). (ג) micrograph TEM של Qβ-M (למעלה), Qβ-יתד (למטה). (ד) צילום של Qβ-יתד תערובת התגובה בתאורה nm UV 365. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: ספקטרום קרינה פלואורסצנטית. קרינה פלואורסצנטית עירור (א) ופליטה (B) ספקטרום של Qβ-M ו- Qβ-יתד ב 0.1 M אשלגן פוספט מאגר (pH 7.00). עירור המרבי הוא כ- 400 nm ו פליטה המרבי הוא סביב 540 – 550 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: זריחה קונאפוקלית תמונות של Qβ-יתד נזווג בתאים macrophage 264.7. כחול: NucRed חיים ריאגנטים ReadyProbes 647. צהוב: Qβ-יתד. טופ תמונות: מיזוג ערוצים כחול וצהוב. למטה תמונות: שדה בהיר תמונות. לסנן ערכות: uv-GFP (λex = 405 ננומטר, λem = 500 – 540 nm), Cy5. תקופת הדגירה היה 4 h אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בהשוואה טיהור חלבון קטן, צעד ייחודי לטיהור bacteriophage Qβ הוא צנטריפוגה הדרגתי סוכרוז. לאחר השלב כלורופורם/n-butanol החילוץ, Qβ עוד יותר מטוהרים באמצעות 5-40% סוכרוז מעברי צבע. במהלך צנטריפוגה, חלקיקים מופרדים בהתאם לגודלן. חלקיקים גדולים יותר לנסוע לאזור צפיפות גבוהה יותר, בעוד חלקיקים קטנים יותר להישאר באזור צפיפות נמוכה יותר. Qβ נוסע השליש התחתון של המילוי ההדרגתי ונשאר שם בזמן זיהומים חלבון קטן לכוד בחלק העליון של הצינור צנטריפוגה. צמיגי של Qβ מראה חזק Tyndall פיזור במעבר הצבע סוכרוז, אשר ניתן לראות בתור להקת כחול כאשר נורית היא האירה מ מתחת. הלהקה הזו קל ואז לחלץ באמצעות מחט מזרק ארוך. Qβ של סוכרוז הוא ואז מגורען מאת ultracentrifugation, מניב גלולה ברורה. בגדר יכול להיות resuspended לתוך המאגר הרצוי או לטהר עוד יותר על ידי חלבון מהיר כרומטוגרפיה נוזלית (FPLC). הטוהר של החלקיק וכתוצאה מכך יכול להיות מאושרות על ידי עמודים מרחביות.

TCEP אינו יציב במאגר פוספט, כך x TCEP 100 מניות פתרון צריך להיות מוכן טרי מים ממש לפני הירידה. בנוסף, TCEP לא מכיל תיול חינם ולא מגיב כלפי חומצות אמינו אחרות, כך שאין צורך להסיר את עודף של TCEP לפני ביצוע התגובה ההטיה. תרכובות Dibromomaleimide הם המומסים בתמיסה 5.00 סודיום פוספט pH, ואחריו הוספת את Qβ מופחת. ב- pH 5.00, ציסטאין (דיסולפידי מופחתת) הוא protonated, אשר מקדם את התגובה ההטיה עם dibromomaleimide על-ידי מניעת re-חמצון לחזור דיסולפידי. תאורה מתחת 365 nm UV, תערובת התגובה פולט קרינה פלואורסצנטית צהוב מיד לאחר Qβ מופחת נוספה לתרכובות DB. באופן שונה מצירוף מסונתז מראש fluorophores על Qβ, זריחה זו הנגרמת על ידי התגובה ההטיה. Fluorophore נוצר ברגע הקשרים חדשים בין גופרית והטבעת maleimide נוצרים. ספקטרום קרינה פלואורסצנטית מראה כי את עירור (400 ננומטר) ואת פליטת (550 ננומטר) maxima להתאים את מסנן uv-GFP להגדיר במיקרוסקופ קונפוקלי (λex = 405 ננומטר, λem = 500−540 ננומטר). Qβ-יתד, נדגרה ואז עם macrophage Raw 264.7 בללא סרום DMEM. אחרי ארבע שעות של דגירה, Qβ-יתד היה uptaken וצהוב punctate תאים פלורסנט, ניתן לאבחן בתוך התאים. עובדה אחת שצריכה להיות מוזכר הוא שידי קרינה פלואורסצנטית עשוי להיות מועבר עבור במידה מסוימת אלבומין שור (BSA) בסרום או חומרים נוספים עשירים ציסטאין פנימה את lysosomes או את endosomes מאוחר של תאים. לאורך זמן, זה יחליש את פלורסצנטיות בתוך התא עבור תא מעקב אחר יישומים; עם זאת, הוא גם מספק הזדמנות עבור עיצוב חדש עבור מערכות.

לסיכום, הראו conjugating DB-יתד על האח מים Qβ באמצעות dibromomaleimide-תיול כימיה. התגובה ההטיה all-in-one לא רק functionalizes את disulfides לאורך הנקבוביות על ם עם פג, אבל גם עושה את זה ננו-חלקיק proteinaceous fluorescently עם תוויות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

J.J.G. מאשר את הקרן הלאומית למדע (DMR-1654405) ואת סרטן מניעה מחקר מכון טקסס (CPRIT) (RP170752s) לתמיכה שלהם.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth (Miller)  EMD Millipore 1.10285.0500
Tryptone, Poweder Research Products International T60060-1000.0
Yeast Extract, Poweder Research Products International Y20020-1000.0
Anhydrous magnesium sulfate P212121 CI-06808-1KG
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) Fisher Scientific S271-10
Potassium Chloride Fisher Scientific BP366-500
Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System Fisher Scientific 4474524
Potassium Phosphate Monobasic Fisher Scientific BP362-1
Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific P288-500
Sucrose Fisher Scientific S25590B
Ethanol Fisher Scientific BP2818500
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma Aldrich I6758-1G
Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor  Fisher Scientific 096-041053
Ammonium Sulfate P212121 KW-0066-5KG
Chloroform Alfa Aesar 32614-M6
1-Butanol Fisher Scientific A399-4
SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum Beckman Coulter 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set
Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL, Beckman Coulter 337922
Coomassie (Bradford) Protein Assay Fisher Scientific PI23200
TRIS Hydrochloride Research Products International T60050-1000.0
Tetramethylethylenediamine Alfa Aesar J63734-AC
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma Aldrich C4706-2G
2 3-Dibromomaleimide 97% Sigma Aldrich 553603-5G
Polythylene Glycol Alfa Aesar 41561-22
Sodium Phosphate Fisher Scientific AC424375000
Acrylamide/bis-Acrylamide P212121 RP-A11310-500.0
Sodium dodecyl sulfate Sigma Aldrich L3771-100G
Ammonium Persulfate Fisher Scientific BP179-100
FV3000 confocal laser scanning microscope Olympus  FV3000 
Labnet Revolver Adjustable Rotator  Thomas Scientific  1190P25 
1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap  Thermo Scientific 010-1459
Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer Thermo Scientific 3141-0250
Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC Thermo Scientific 3117-0380
2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim Pyrex 4980-2L
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units Millipore Sigma UFC801024
M-110P Microfluidizer Materials Processor Microfluidics M-110P
Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes Thermo Scientific 3117-0380PK
Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate Beckman Coulter 41121703
Cylinder, Graduated - Polypropylene 250 mL PolyLab 80005
533LS-E Series Steam Sterilizers Getinge 533LS-E
TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid LabSource D36-313-CS
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube Fisher Scientific 14-959-53A
Microcentifuge Tube: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-129
VWR Os-500 Orbital Shaker VWR Scientifc Products 14005-830
Tetra Handcast systems Bio-Rad 1658000FC
Polypropylene, 250 mL Beckman Coulter 41121703
Spectrofluorometer NanoDrop Thermo Fisher Scientific 3300
Long Needle  Hamilton  7693
Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock Fisher Scientific 14-841-46
P1000 Pipetman Gilson F123602
P200 Pipetman Gilson F123601
P100 Pipetman Gilson F123615
P20 Pipetman Gilson F123600
P10 Pipetman Gilson F144802
Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance Intelligent Weighting Technology IWT_PM100
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube Fisher Scientific 14-432-22
4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl Bio-Rad 456-1084

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
  2. Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids. J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).
  3. Li, S., et al. Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).
  4. Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology. WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).
  5. Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. G. Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology. Chem. - Asian J. 4 (5), 630-640 (2009).
  6. Le, D. H., Lee, K. L., Shukla, S., Commandeur, U., Steinmetz, N. F. Potato Virus X, a Filamentous Plant Viral Nanoparticle for Doxorubicin Delivery in Cancer Therapy. Nanoscale. 9 (6), 2348-2357 (2017).
  7. Chen, L., Wu, Y., Yuan, L., Wang, Q. Virus-templated FRET Platform for the Rational Design of Ratiometric Fluorescent Nanosensors. Chem. Comm. 51 (50), 10190-10193 (2015).
  8. Lee, P., et al. Polymer Structure and Conformation Alter the Antigenicity of Virus-like Particle-Polymer Conjugates. J. Am. Chem. Soc. 139 (9), 3312-3315 (2017).
  9. Zhang, X., et al. Polymer-Protein Core-Shell Nanoparticles for Enhanced Antigen Immunogenicity. ACS Macro Lett. 6 (4), 442-446 (2017).
  10. Brown, S. D., Fielder, J. D., Finn, M. G. Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles. Biochemistry. 48 (47), 11155-11157 (2009).
  11. Chen, Z., et al. Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle. Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).
  12. Addgene. Pouring LB Agar Plates. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ (2016).
  13. Bio-Rad. Bradford Protein Assay. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf (2017).
  14. Bio-Rad. Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf (2017).
  15. Smith, M., et al. Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides. J. Am. Chem. Soc. 132 (6), 1960-1965 (2010).
  16. Castaneda, L., et al. A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones. Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).
  17. Fiedler, J., et al. Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle. Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).
  18. Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).
  19. Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier. Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 135 ננו חלקיקים דמויי וירוס bacteriophage Qβ (Qbeta) functionalizing capsids זריחה תגובה bioconjugation נגזרים dibromomaleimide פוליאתילן גליקול (PEG)
ביצוע הנוצרות על-ידי ההטיה של חלקיקים דמויי וירוס PEGylated פלורסנט מאת כימיה Dibromomaleimide-דיסולפידי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Z., Detvo, S. T., Pham, E.,… More

Chen, Z., Detvo, S. T., Pham, E., Gassensmith, J. J. Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry. J. Vis. Exp. (135), e57712, doi:10.3791/57712 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter