Summary
Burada, fluorescently Qβ VIP üzerinde disulfides dibromomaleimide ile functionalize için bir yordam mevcut. Biz Qβ ifade ve arıtma, molekülleri dibromomaleimide functionalized sentezi ve dibromomaleimide ve Qβ arasında konjugasyon tepki açıklanmaktadır. Elde edilen Sarı floresan konjuge parçacık bir floresan sonda hücrelere olarak kullanılabilir.
Abstract
Virüs gibi parçacıklar (VIP) Biyomedikal son artış ve malzeme araştırma onların kolaylığı biyosentezi, ayrık boyut, genetik programlama ve biodegradability atfedilen. Onlar onların yüzeyine sentetik ligandlar eklemek için bioconjugation reaksiyonlar için son derece uysal, bioconjugation yöntemleri bu sulu d. capsids tarih aralığında göreceli olarak sınırlı iken. Fonksiyonel Biyomalzeme araştırma yönünü kolaylaştırmak için geleneksel olmayan bioconjugation tepkileri dikkate alınmalıdır. Bu protokol için açıklanan tepki dibromomaleimides solvent bazlı bir VIP maruz disülfür bağları bakteriyofaj Qβ yeni işlevsellik tanıtmak için kullanır. Ayrıca, nihai ürün piyasada bulunan filtre seti kullanarak izlenebilir vitro sonda üreten yararı olan flüoresan,.
Introduction
Nano ölçekli viral capsids kullanarak uygulamaları Biyomedikal araştırma1,2,3' te kapsamını genişletmek hedefliyor heyecan verici bir alan olarak ortaya çıkmıştır. Recombinantly ifade virüs benzeri parçacıklar (VIP) yapısal olarak virüslere karşı elde edilen ama orijinal viral genetik materyal bulaşıcı olmayan proteinaceous nano tanecikleri geliştirmelerde eksik. Yüzey özellikleri genetik programlı ve her kapsid aynı şekilde önce ve sonrasında olanlar için ifade gibi reaktif yan zincirli amino asitlerin atomistic hassasiyetle sayısını ve konumunu öğrenmek mümkündür. Birçok durumda, iç ve dış yüzeyleri pek çok feasibly bioconjugation tepkiler - Kovalent bağlar arasında bir biomolecule ve sentetik reaksiyonlar yoluyla functionalized solvent maruz amino asit kalıntıları sahip. molekül4,5.
Bioconjugation reaksiyonlar ilgi daha farklı işlevleri nispeten basit bir moda var biomolecules yardım. Molekülleri tedavi uyuşturucu6, floresan Etiketler7 ve polimerler8,9 gibi ilgi önceden sentezlenmiş ve onlar VIP'ler yüzeyinde eklenmeden önce ile karakterizedir. Özellikle ortak bir VIP içinde biyomedikal ve biyomalzeme araştırma bakteriyofaj Qβ, recombinantly olarak ifade, 28 nm icosahedral viral kapsid10temel VIP oldu. Son zamanlarda Qβ gözenekleri Haddleton-Baker tepki ile satır azaltılmış disulfides için dibromomaleimide bileşiklerin başarılı konjugasyon11 tebliğ var olsa Qβ en yaygın tepki sitelerinde geniş bir farkla lysines vardır. Reaksiyon gelirleri ile iyi verim ve eşit olarak da önemlisi, olmadan parçacıkların termal kararlılık kaybetme. Aynı zamanda, bu parçacıklar alımını hücrelere izlemek için kullanılan fiil kaynaklı floresans bu reaksiyon oluşturur. Bu çalışmada, Qβ yüzeyine bir parlak sarı fluorophore sonuç Haddleton-Baker tepki ile Polietilen glikol (PEG) konjugasyon göstermektedir. Hepsi hücreleri tarafından alınır gibi bu parçacıklar daha sonra izlenebilir. İletişim kuralı burada araştırmacılar kendi ilkeleri bir çözelti maruz disulfides içeren diğer birçok VIP'ler için uygulanabilir olmasına rağmen proteinaceous nano tanecikleri Qβ dayalı yeni floresan pegile oluşturmak yardımcı olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hazırlık
- Lysogeny suyu (LB) agar yapmak ve tabak12dökün.
-
bl21(de3) wtQβ kat protein içeren bir pET28 plazmid ile dönüşümü.
- E. coli BL21(DE3) yetkili hücrelerde bir buz banyosu çözülme. Hücre microcentrifuge tüp içinde yer 50 μL.
- Plazmid 2 μL bir tüpün içine ekleyin ve hafifçe tüpü hafifçe vur. O zaman 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya.
- Isı şok hücreler için 45 s tam olarak 42 ° C'de olduğu bir su banyosunda Sonra hemen Isı-şok buz banyosunda tüpü yerleştirin ve 5 min için kuluçkaya.
- 950 μL herhangi bir antibiyotik içeren LB medya ekleyin.
- 37 ° C'de 60 dk için 200 devirde kültür sallamak
- 100 μL LB agar plakaları kültürünün (sefaloridin) plaka ve plaka gecede 37 ° C'de kuluçkaya Gerektiğinde beyaz kolonileri seçin.
-
Süper en iyi suyu (SOB) medya olun.
- Otoklav iki 2 L Erlenmeyer şişeler superdry bir döngüsü şaşkın.
- Aseptik ortamında, tartmak ve tryptone 20.0 g ekleyin, 5.0 g maya ekstresi, susuz magnezyum sülfat, 2,469 g 0,584 g sodyum klorür ve 0,186 g potasyum klorür her şişesi için.
- Birim için 1 L Ultrasaf Su ile her şişesi ve basınçlı kap sıvı döngüsü getirmek.
- Bir kez SOB medya ısıyla sonra oda sıcaklığında ulaştı, sefaloridin (100 mg/mL) 1 mL medya her litre için ekleyin ve 4 ° C'de depolayın
-
0.1 M potasyum fosfat tampon (pH 7,00) olun.
- 1 M potasyum Yem mono çözüm 68.045 g potasyum 500 mL Ultrasaf Su Yem mono çözülerek olun.
- 1 M potasyum dibasic çözüm 87.09 g potasyum Ultrasaf Su 500 mL dibasic çözülerek olun.
- 38,5 mL potasyum Yem mono çözüm ve potasyum dibasic 61,5 mL 1 L şişe ekleyin.
- PH gerekirse 7,00 için ayarlamak ve 1 L. bir birime getirmek
-
5-%40 0.1 M potasyum fosfat tampon (pH 7,00) sükroz degradeler olun.
- 50 mL santrifüj tüplerde 0.1 M potasyum fosfat tampon (pH 7,00) çözünmüş % 5-40 (% 5'lik artışlarla artan) sükroz ile çözümleri hazırlayın.
- 3.3 mL % 5 sükroz çözeltisi alt kısmındaki uzun iğne kullanarak 38 mL yuvarlak alt Polikarbonat tüp kasası ve beş diğer tüpler için bu işlemi yineleyin.
- Dikkatle 3.3 mL % 10 sükroz çözeltisi tüpün dibinde mevduat ve degrade rahatsız değil gibi iğne dikkatli bir şekilde çıkarın. Diğer beş tüpler için yineleyin.
- 3.3 mL katmanları sükroz çözümleri, rahatsız etmeyin degradenin dikkatli olurken her tüpün içinde % 40'a %15 artan yatırmak devam edin.
- Tamamlandığında, folyo degradelerle üst kısımları kapak ve-80 ° C'de depolayın
2. Qβ ifadesidir
- 1:1 çamaşır suyu/etanol ile tezgah alanı silin.
- İki 3 mL starter kültür aseptik ortamında aseptik bir ortamda E. coli BL21(DE3) tek kolonileri SOB medya 3 mL içine ekleyerek getirin.
- Bir shaker bir 37 ° C ve %0 bağıl nem (rH) odada 250 rpm'de üzerinde bir gecede büyümek.
-
SOB medya Starter kültürü aşılamak:
- Her iki 3 mL starter kültürler shaker alın ve aseptik bir ortamda, her starter kültür iki birinin içine dökün 2 L Erlenmeyer şişeler taze SOB medya her 1 litre ile şaşkın.
- Bir shaker bir 37 ° C ve % 0 rH odada 250 rpm'de inoculated medya yerleştirin.
- OD600 0,9-1.0 ulaşıncaya kadar bir shaker bir 37 ° C ve % 0 rH odada 250 rpm'de bakteri büyümek.
- 1 mL 1 M izopropil β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) protein ifade ikna etmek için P1000 pipet kullanarak ekleyin.
- Medya bir 37 ° C ve % 0 rH odada 250 rpm'de shaker üzerinde gece bırakın.
- Medya shaker ertesi sabah ve santrifüj 1000 ml'lik şişe de 20,621 × g 4 ° C'de 1 h için hücreleri hasat için kullanarak kaldırın.
-
Süpernatant atın ve hücre Pelet toplamak.
- Süpernatant yaklaşık 5 mL bakterileri öldürmek için çamaşır suyu ile bir şişe içine dökün. Bu atık.
- Santrifüj şişe altındaki hücre Pelet scrape ve Pelet 50 mL santrifüj tüpüne koymak için bir spatula kullanın.
3. Qβ arınma
- Hücre Pelet ~ 20-30 ile resuspend mL 0.1 M potasyum fosfat tampon (pH 7,00).
- Resuspension yok parçalar olduğundan emin olun ve bir microfluidizer işlemci üreticisinin protokolüne göre kullanarak hücreleri parçalayıcı ( Tablo malzemelerigörmek). Parçacıklar verimini artırmak için en az iki kez hücreleri parçalayıcı.
- Lysate 20,621 x g de 250 mL santrifüj şişelerde 4 ° C'de 1 saat için santrifüj kapasitesi
- Pelet atın ve süpernatant ml hacmi ölçmek. Bu değeri 0.265 tarafından çarpar ve bu miktarın g amonyum sülfat süpernatant için.
- En az 1 h protein çökelti 200 devirde heyecan tabakta için 4 ° C'de karıştırın.
- 20,621 x g 4 ° C'de 1 h için 250 mL şişe santrifüj kapasitesi
- Süpernatant atın ve Pelet yaklaşık 10 mL 0.1 M potasyum fosfat tampon (pH 7,00) ile resuspend.
- 1:1 kloroform/n-butanol eşit miktarda ham örnek için vortexing tarafından bir kaç saniyeliğine ekleyip karıştırın.
- 4 ° C'de 30 dakika 20,621 × g de 38 mL tüpler santrifüj kapasitesi
- Pasteur pipet kullanarak üst sulu katmanı yeniden elde etmek. Sulu ve organik katmanı arasında kurdu tabaka gibi jel almak değil dikkatli olun.
- Altı % 5-40 önceden yapılmış sükroz degradeler çözülme ve 2 mL her ekstresinin yükleyin.
- Ultracentrifuge 99,582 x g ücretsiz yavaşlama ile 4 ° C'de 16 h için de.
- Bir ışık yayan diyot (LED) ışık her tüpün altında Parlatıcı ve bir mavi bant görünür olmalıdır. Bu parçacıklar uzun iğne şırınga ile yeniden elde etmek.
- Ultrapellet 370,541 x g 4 ° C'de 2,5 h için parçacıklar
- Süpernatant atın ve 0.1 M potasyum fosfat tampon (pH 7,00) ile arıtılmış parçacıkların şeffaf Pelet resuspend.
4. miktar ve ürün onayı
- Bradford tahlil ürün13ölçmek için kullanın.
- Polyacrylamide jel elektroforez (SDS-sayfa) ürün14onaylamak için çalışma azaltılması ve sigara azaltılması Sodyum Lauryl Sülfat.
Not: SDS-sayfa azaltarak kat protein molekül ağırlığı onaylamak için kullanılır; Sigara azaltılması-SDS-sayfa daha yüksek sipariş yapısı emin olmaktır.
5. Qβ DB bileşikler conjugating
-
Disulfides Qβ üzerinde azaltmak.
- 0.0020 gram dissolve tris(2-carboxyethyl) fosfamin (TCEP) 1 mL 100 x hisse senedi çözüm yapmak Ultrasaf Su içine.
Not: azaltma önce taze TCEP hazırlayın. - Qβ (5 mg/mL) 200 µL microcentrifuge tüp içine ekleyin.
- 100 x TCEP hisse senedi çözüm 20 µL ekleyerek izleyin.
- 1s için oda sıcaklığında kuluçkaya.
- 0.0020 gram dissolve tris(2-carboxyethyl) fosfamin (TCEP) 1 mL 100 x hisse senedi çözüm yapmak Ultrasaf Su içine.
-
Azaltılmış disülfür dibromomaleimide Polietilen glikol (DB-PEG) kullanarak yeniden köprü.
- 0.0017 g dibromomaleimide-Polietilen glikol (DB-PEG) DMF 100 µL geçiyoruz.
- 10 mM sodyum fosfat çözüm (pH 5,00) 680 µL ekleyin.
- Qβ DB-PEG çözüm içine azaltılmış ekleyin ve karıştırma işlemi bir 365 nm UV lambası altında gözlemlemek. Parlak sarı floresan lambalı karıştırma üzerine bir 365 nm el UV hemen görüntülenmeyecektir.
- Gecede bir et lokantası (RT) Oda sıcaklığında devam tepki ver.
- Santrifüj filtre tarafından tepki karışımı arındırmak (COMW = 10 kDa) üç kez 1 x PBS de 3,283 x g 4 ° C'de 20 dk için kullanma
- Konjugasyon olmayan-SDS-sayfa ve yerel özel jel elektroforez azaltarak monitör.
Not: Yerel özel jel sağlam parçacıklar olarak VIP çalıştırın ve onların ücret, boyutu ve şekli bağlı ayrılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dibromomaleimide türevleri ile yoğunlaşma tepki dibromomaleimide anhidrit ve Birincil aminler15arasında sentez. Alternatif olarak, N-methoxycarbonyl aktif 3,4-dibromomaleimide kullanarak bir hafif sentetik yöntemi16 burada methoxypolyethylene glikol (PEG) için verim DB-PEG (Şekil 1) ile tepki tarafından istismar edildi. NMR Bileşik yapı (Şekil 2) tanımlamak için kullanıldı. Qβ VIP 180 aynı ceket proteinlerin oluşan bir 28 nm icosahedral proteinaceous nanopartikül, var. Kat protein bitişik kat protein17β çarşaflı α-helisel etki alanları ile kovalent birbirine dimer formu eğilimindedir. VIP'ler için onların istikrar yüksek sıcaklık, aşırı pHs ve çeşitli çözücü besteleri18seçilmesi eğilimindedir. Bu durumda, Qβ VIP daha beş ve altı kat eksenleri simetri kapsid19 (Şekil 3) yer alan 180 arası strand disülfür bağları sayesinde Leviviridac ailesindeki diğer RNA phages daha kararlıdır. Bu hexameric ve pentameric yapılar sigara azaltarak SDS-sayfa19tarafından görüntülenmiştir disulfides bağlıdır. TCEP on karşılıkları (tris(2-carboxyethyl)phosphine) (0.70 µmol), Qβ (0,070 µmol kat protein, 0,070 µmol disulfides), 1 mg disulfides göre kullanılan oda sıcaklığında azalma Qβ capsids (rQβ) bir tane oluşturmak için tüm disulfides azaltmak için Saat ve sigara azaltarak SDS-sayfa gösterir tüm yüksek sipariş yapıları monomeric kat protein (Şekil 4 ve Şekil 5A) düşürüldü. Onları rebridge için tepki one-pot sentezi yapılmadan ham rQβ katkı doğrudan 20 DB-PEG bir çözüm eşdeğerlerine eklendi (1.4 µmol) içinde sodyum fosfat (10 mM, faz 5,00, % 10 DMF) bir saat azaltma tepki11takip. Hemen DB-PEG eklenmesinden sonra gözlemlenebilir parlak sarı floresans 365 nm UV lamba (Şekil 5 d) altında yapıldı. Karışım sonra RT bir gecede santrifüj filtresini kullanarak arıtma tarafından takip et lokantası üzerinde inkübe (MWCO = 10 kDa) istenen önbellekle üç durulama kez küçük moleküller aşırı miktarda kaldırmak için. Qβ-malemide conjugates photostability tanıtmak için 10 mM sodyum fosfat eriyik (pH 5,00) resuspended. Konjugasyon olmayan-SDS-sayfa UV ve coomassie (Şekil 5A) boyama mavi altında azaltarak doğrulandı. Bütün grupları Floresan (Şekil 5A) UV altında hangi boyama, başarılı bir fiil temsil eden coomassie mavi ile colocalized gösterdi. Qβ-PEG conjugates bütünlüğünü yerel özel Jel Elektroforez ve transmisyon elektron mikroskobu tarafından (TEM) (Şekil 5B, C) teyit.
Qβ-maleimide (Qβ-Μ) ve Qβ-PEG yaklaşık 400 nm ve 540-550 nm, sırasıyla olmak uyarma ve emisyon maxima gösterdi floresans spektroskopisi (Şekil 6). Bu kimin uyarma dalga boyu olduğunu 405 piyasada bulunan GFP-uv filtre ayarlı hizalar nm ve emisyon dalga boyu 500 – 540 nm olduğunu. Uygun conjugates piyasada bulunan filtreli photophysical özelliklerini Qβ-PEG yapılır ve Şekil 7' deki görüntüsü bir vitro sonda olarak kullanma izni ayarlar. Qβ-PEG (200 nM) serum-Alerjik DMEM orta fare Raw-264.7 hücreleri ile inkübe, çekirdeği boyama tarafından takip. Şekil 7 colocalization Albümdeki gösterir Sarı floresan parçacıklar Raw-264.7 hücreleri tarafından uptaken edildi ve kuluçka dört saat sonra izlenebilir. Unfunctionalized Qβ VIP ihmal edilebilir floresans göster.
Şekil 1: DB-PEG sentetik düzeninin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: NMR karakterizasyonu. (A) 1 H NMR ve (B) 13C / DB-PEG. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Crystallographic gibi Chimera işlenmiş Qβ VIP kapsid yapısını (PDB ID: 1QBE). İki sistein kalıntıları (Cys 74 ve Cys 80) turuncu renkte gösterilir.
Şekil 4: Qβ-maleimide (Qβ-M) conjugates konjugasyon düzeni. Qβ (disulfides 0,07 µmol) 10 TCEP karşılıkları kullanarak düşürüldü (0.7 µmol) RT bir saat dibromomaleimide bileşikleri (DB ve DB-PEG) 20 karşılıkları eklenmesi tarafından takip, (1.4 µmol). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Qβ, rQβ, karakterizasyonu Qβ-M ve Qβ-PEG. (A) sigara azaltarak SDS-sayfa ve (B) yerel özel jel Qβ, rQβ, Qβ-M ve Qβ-PEG UV (üst) ve coomassie altında mavi boyama (altta). (C) TEM test Qβ-M (üst) ve Qβ-PEG (altta). (D) fotoğraf, Qβ-PEG tepki karışımı 365 nm UV ışık altında. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: floresan spectra. Floresans uyarma (A) ve emisyon (B) spectra Qβ-M ve Qβ-PEG potasyum fosfat tampon (pH 7,00) 0.1 m. 400 nm ve emisyon maksimum uyarma olduğunu maksimum olduğunu etrafında 540-550 nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: Qβ-PEG Confocal floresan görüntülerini makrofaj 264.7 hücrelere eşlenik. Mavi: NucRed 647 ReadyProbes reaktifler yaşıyorum. Sarı: Qβ-PEG. «Ana sayfa» resim: birleştirilmiş mavi ve sarı kanalları. Alt resim: parlak alan görüntüler. Kümeleri filtre: uv-GFP (λex = 405 nm, λem 500 – 540 nm =), Cy5. Kuluçka zamanıydı 4 h Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Daha küçük protein arıtma için karşılaştırıldığında, bakteriyofaj Qβ arındırıcı bir benzersiz sükroz degrade Santrifüjü adımdır. Kloroform/n-butanol ayıklama adım sonra Qβ daha fazla % 5-40 sükroz degradeler kullanarak saf. Santrifüjü sırasında parçacıklar kendi boyutları göre ayrılır. Daha küçük partiküller daha düşük yoğunluklu bölgede kalırken daha büyük partiküller yüksek yoğunluk bölgesine seyahat. Qβ için geçişin üçüncü alt seyahat ve daha küçük protein kirleri santrifüj tüpü üst kısmında tuzak süre orada kalır. Qβ kolloidal süspansiyon güçlü Tyndall gösterir sükroz degradede saçılma, hangi görülebilir mavi bir bant üzerinden bir LED ışık shined zaman altında. Bu grup daha sonra uzun şırınga iğne kullanarak ayıklamak kolaydır. Sükroz Qβ sonra ultrasantrifüj tarafından açık bir Pelet verimli pelleted. Pelet istenen ara belleğe resuspended veya daha fazla hızlı protein sıvı kromatografi (FPLC) tarafından arıtılmış. Elde edilen parçacık saflığı SDS-PAGE tarafından onaylanabilir.
TCEP fosfat arabellekte istikrarlı değil 100 x TCEP hisse senedi çözüm taze su hemen azaltılması önce hazırlanmalıdır. Buna ek olarak, TCEP ücretsiz thiol içerir ne TCEP fazlalığı konjugasyon tepki gerçekleştirmeden önce kaldırmak gerekli değildir diğer amino asitler karşı tepki verir. Dibromomaleimide bileşikleri azaltılmış Qβ ekleyerek takip pH 5,00 sodyum fosfat çözümde çözülür. PH 5,00 sistein (azaltılmış disülfür) bir disülfür için re-oksidasyon engelleyerek dibromomaleimide ile konjugasyon reaksiyon teşvik protonated olduğunu. Azaltılmış Qβ DB bileşikler hemen eklendikten sonra küçük 365 nm UV aydınlatma, reaksiyon karışımı sarı floresans yayar. Farklı Qβ üzerinde önceden sentezlenmiş fluorophores eklemenizi, bu floresan konjugasyon tepki tarafından indüklenen olduğu. En kısa zamanda kükürt ve maleimide halka arasında yeni bağlar oluşturulur fluorophore oluşur. Floresans spectra gösteriyor ki uyarma (400 nm) ve emisyon (550 nm) maxima uygun bir confocal Mikroskobu ayarla uv-GFP filtre (λex = 405 nm, λem 500−540 nm =). Qβ-PEG sonra makrofaj ham 264.7 serum-Alerjik DMEM ile inkübe. Kuluçka dört saat sonra Qβ-PEG uptaken ve floresan bölmeleri hücrelerin içinde görselleştirildiği punctate sarı oldu. Söylenmesi gereken bir serumu veya diğer sistein-zengin maddeler organellerin veya geç endosomes hücre içinde sığır serum albumin (BSA) için bir ölçüde devredilebilir floresans gerçektir. Zaman içinde bu floresans izleme uygulamalarını hücre için hücre içindeki zayıflatmak; Ancak, aynı zamanda uyuşturucu dağıtım sistemleri için yeni bir tasarım için bir fırsat sağlar.
Sonuç olarak, DB-PEG Qβ VIP üzerinde dibromomaleimide-thiol Kimya conjugating göstermiştir. All-In-one konjugasyon tepki sadece gözenekleri VIP PEG ile tarih boyunca disulfides functionalizes ama fluorescently etiketli proteinaceous nanopartikül kolaylaştırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
J.J.G. verdikleri destek için Ulusal Bilim Vakfı (DMR-1654405) ve kanser önleme Araştırma Enstitüsü of Texas (CPRIT) (RP170752s) kabul eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth (Miller) | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Tryptone, Poweder | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| Yeast Extract, Poweder | Research Products International | Y20020-1000.0 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | P212121 | CI-06808-1KG | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System | Fisher Scientific | 4474524 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590B | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor | Fisher Scientific | 096-041053 | |
| Ammonium Sulfate | P212121 | KW-0066-5KG | |
| Chloroform | Alfa Aesar | 32614-M6 | |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum | Beckman Coulter | 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set | |
| Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL, | Beckman Coulter | 337922 | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Fisher Scientific | PI23200 | |
| TRIS Hydrochloride | Research Products International | T60050-1000.0 | |
| Tetramethylethylenediamine | Alfa Aesar | J63734-AC | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706-2G | |
| 2 3-Dibromomaleimide 97% | Sigma Aldrich | 553603-5G | |
| Polythylene Glycol | Alfa Aesar | 41561-22 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | AC424375000 | |
| Acrylamide/bis-Acrylamide | P212121 | RP-A11310-500.0 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771-100G | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Labnet Revolver Adjustable Rotator | Thomas Scientific | 1190P25 | |
| 1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer | Thermo Scientific | 3141-0250 | |
| Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| 2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim | Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P Microfluidizer Materials Processor | Microfluidics | M-110P | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3117-0380PK | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Cylinder, Graduated - Polypropylene 250 mL | PolyLab | 80005 | |
| 533LS-E Series Steam Sterilizers | Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid | LabSource | D36-313-CS | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Microcentifuge Tube: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| VWR Os-500 Orbital Shaker | VWR Scientifc Products | 14005-830 | |
| Tetra Handcast systems | Bio-Rad | 1658000FC | |
| Polypropylene, 250 mL | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Spectrofluorometer NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| Long Needle | Hamilton | 7693 | |
| Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock | Fisher Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| P100 Pipetman | Gilson | F123615 | |
| P20 Pipetman | Gilson | F123600 | |
| P10 Pipetman | Gilson | F144802 | |
| Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance | Intelligent Weighting Technology | IWT_PM100 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl | Bio-Rad | 456-1084 |
References
- Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
- Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids. J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).
- Li, S., et al. Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).
- Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology. WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).
- Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. G. Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology. Chem. - Asian J. 4 (5), 630-640 (2009).
- Le, D. H., Lee, K. L., Shukla, S., Commandeur, U., Steinmetz, N. F. Potato Virus X, a Filamentous Plant Viral Nanoparticle for Doxorubicin Delivery in Cancer Therapy. Nanoscale. 9 (6), 2348-2357 (2017).
- Chen, L., Wu, Y., Yuan, L., Wang, Q. Virus-templated FRET Platform for the Rational Design of Ratiometric Fluorescent Nanosensors. Chem. Comm. 51 (50), 10190-10193 (2015).
- Lee, P., et al. Polymer Structure and Conformation Alter the Antigenicity of Virus-like Particle-Polymer Conjugates. J. Am. Chem. Soc. 139 (9), 3312-3315 (2017).
- Zhang, X., et al. Polymer-Protein Core-Shell Nanoparticles for Enhanced Antigen Immunogenicity. ACS Macro Lett. 6 (4), 442-446 (2017).
- Brown, S. D., Fielder, J. D., Finn, M. G. Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles. Biochemistry. 48 (47), 11155-11157 (2009).
- Chen, Z., et al. Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle. Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).
- Addgene. Pouring LB Agar Plates. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ (2016).
- Bio-Rad. Bradford Protein Assay. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf (2017).
- Bio-Rad. Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf (2017).
- Smith, M., et al. Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides. J. Am. Chem. Soc. 132 (6), 1960-1965 (2010).
- Castaneda, L., et al. A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones. Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).
- Fiedler, J., et al. Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle. Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).
- Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).
- Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier. Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).
