Summary
Aquí, presentamos un procedimiento para fluorescencia funcionalizar los disulfuros de Qβ VLP con dibromomaleimide. Describimos Qβ expresión y purificación, la síntesis de moléculas de dibromomaleimide funcionalizados y la reacción de Conjugación entre dibromomaleimide y Qβ. La partícula conjugada fluorescente amarillo resultante puede utilizarse como una sonda de fluorescencia dentro de las células.
Abstract
La reciente subida de partículas similares a virus (VLPs) en biomédica y la investigación de materiales puede ser atribuido a su facilidad de biodegradabilidad, tamaño discreto, programación genética y biosíntesis. Mientras que son altamente susceptibles a reacciones bioconjugation por adición de ligandos sintéticos en su superficie, la gama en metodologías bioconjugation en estos cápsida nacido acuosa es relativamente limitada. Para facilitar la dirección de investigación de biomateriales funcionales, deben considerarse reacciones bioconjugation no tradicionales. La reacción que se describe en este protocolo utiliza dibromomaleimides para introducir nuevas funcionalidades en el solvente a base de disulfuro expuesta de una VLP al bacteriófago Qβ. Además, el producto final es fluorescente, que tiene la ventaja de generar una sonda rastreables en vitro usando un conjunto de filtros comercialmente disponibles.
Introduction
Utilizando nanopartículas de cápsida viral ha surgido como un campo interesante, que pretende ampliar el alcance de las aplicaciones en investigación biomédica1,2,3. Por vía recombinante expresadas virus-como partículas (VLPs) son estructuralmente derivadas de virus, pero tienen el material genético viral original haciendo que no infecciosas proteináceas nanopartículas. Como las características superficiales están genéticamente programadas y cada cápside se expresa idénticamente a los antes y después de él, es posible conocer la ubicación y el número de cadenas laterales reactivas de los aminoácidos con precisión atomística. En muchos casos, las superficies exteriores e interiores poseen muchos tipos de residuos de solvente aminoácidos expuesta, que factible pueden ser funcionalizados a través bioconjugation reacciones - reacciones que forman enlaces covalentes entre una biomolécula y sintéticos molécula de4,5.
Reacciones bioconjugation ayudan biomoléculas de interés tienen funcionalidades más diversas de una manera relativamente sencilla. Moléculas de interés, como drogas terapéuticas6, etiquetas fluorescentes7 y polímeros8,9 pueden ser previamente sintetizadas y caracterizadas antes de que se colocan en la superficie de VLPs. Una VLP particularmente común en biomédica y la investigación de biomateriales ha sido la VLP basado en bacteriófago Qβ, que, como expresa por vía recombinante, es un 28 nm cápside viral icosaédrica10. Los sitios más comunes de la reacción en Qβ son lisinas por un amplio margen, aunque recientemente hemos comunicado verbal exitosa11 de dibromomaleimide compuestos a los disulfuros reducidos que los poros de Qβ vía una reacción Haddleton-Baker. La reacción procede con buen rendimiento y, lo que es igualmente importante, sin perder la estabilidad térmica de las partículas. Al mismo tiempo, esta reacción genera fluorescencia inducida por la verbal, que puede utilizarse para rastrear la captación de estas partículas en las células. En este trabajo demostramos la conjugación de polietilenglicol (PEG) en la superficie de Qβ a través de la reacción Haddleton-Baker, que se traduce en un fluoróforo amarillo brillante. Estas partículas pueden rastrearse como se toman las células. El Protocolo adjunto ayudarán a los investigadores generar pegilado fluorescente nuevas nanopartículas proteínico basadas en Qβ, aunque sus principios son aplicables a uno de los muchos otros VLPs que contienen solvente disulfuros expuestas.
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Protocol
1. preparación
- Hacer agar caldo (LB) de lisogenia y verter placas12.
-
Transformar BL21(DE3) con un plásmido pET28 que contiene la secuencia de la proteína de wtQβ capa.
- Descongelar las células competentes de e. coli BL21(DE3) en un baño de hielo. Depositar 50 μL de las células en un tubo de microcentrífuga.
- Añadir 2 μL del plásmido en un tubo y mueva suavemente el tubo. Luego incubar en hielo durante 30 minutos.
- Choque térmico las células para 45 s en un baño de agua a exactamente a 42 ° C. Coloque el tubo en el baño de hielo inmediatamente después del choque de calor e incubar durante 5 minutos.
- Agregar 950 μL de medio LB que no contiene ningún antibiótico.
- Agitar el cultivo a 200 rpm por 60 min a 37 ° C.
- Placa de 100 μL de la cultura en placas de agar LB (con kanamicina) e incubar la placa durante la noche a 37 ° C. Seleccione colonias blancas cuando sea necesario.
-
Hacer los medios caldo óptimo Super (sollozo).
- Autoclave 2 L había desconcertado matraces Erlenmeyer en un ciclo de superdry.
- En un ambiente aséptico, pesar y añadir 20,0 g de triptona, extracto de 5,0 g de levadura, 2,469 g de sulfato de magnesio anhidro, 0,584 g de cloruro de sodio y 0,186 g de cloruro de potasio a cada matraz.
- Llevar el volumen a 1 L con agua ultrapura en cada frasco y autoclave en el ciclo líquido.
- Una vez que los medios de comunicación SOB ha alcanzado temperatura ambiente después de la esterilización en autoclave, añadir 1 mL de kanamicina (100 mg/mL) a cada litro de medio y guardar a 4 ° C.
-
Hacer el tampón de fosfato de potasio de 0.1 M (pH 7,00).
- Hacer solución monobásico de potasio de 1 M disolviendo 68,045 g de potasio monobásico en 500 mL de agua ultrapura.
- Hacen 1 M potasio dibásico solución disolviendo 87,09 g de potasio dibásico en 500 mL de agua ultrapura.
- Añadir 38,5 mL de solución de potasio monobásico y 61,5 mL de potasio dibásico a una botella de 1 L.
- Ajustar pH a 7.00 si es necesario y llevar a un volumen de 1 L.
-
Hacer 5 – 40% gradientes de sacarosa en tampón de fosfato de potasio de 0.1 M (pH 7,00).
- En tubos de centrífuga de 50 mL, preparar soluciones con sacarosa al 5 – 40% (aumentando en incrementos de 5%) disuelto en tampón de fosfato de potasio de 0.1 M (pH 7,00).
- Depósito de 3,3 mL de solución de sacarosa al 5% en la parte inferior de un tubo de fondo redondo policarbonato 38 mL usando una jeringa de aguja larga y repetir este proceso para los otros cinco tubos.
- Depositar cuidadosamente 3,3 mL de solución de sacarosa del 10% en la parte inferior del tubo y retire con cuidado la aguja para no molestar el gradiente. Repita para los otros cinco tubos.
- Seguir depositar capas de 3,3 mL de soluciones de sacarosa, aumentando de 15% a 40% en cada tubo, teniendo cuidado para no perturbar el gradiente.
- Cuando termine, cubrir la parte superior de los gradientes con papel de aluminio y almacenar a-80 ° C.
2. expresión de Qβ
- Limpie el área del Banco con lejía y etanol de 1:1.
- Hacer dos culturas de arrancador 3 mL en un ambiente aséptico añadiendo solo colonias de e. coli BL21(DE3) en 3 mL de medio de sollozo en un ambiente aséptico.
- Crecen durante la noche en un agitador a 250 rpm en una habitación de 37 ° C y 0% de humedad relativa (HR).
-
Sembrar cultura de arrancador en medio del sollozo:
- Sacar ambas culturas de arrancador 3 mL de la coctelera y, en un ambiente aséptico, vierta cada cultura de arrancador en uno de los dos 2 L desconcertado matraces Erlenmeyer con 1 L de frescas SOB los medios de comunicación en cada uno.
- Colocar el medio inoculado en un agitador a 250 rpm en una habitación de 37 ° C y 0% rH.
- Crecen las bacterias en un agitador a 250 rpm en una habitación de 37 ° C y 0% rH hasta OD600 0.9 – 1.0.
- Añadir 1 mL de 1 M isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) usando una pipeta P1000 para inducir la expresión de la proteína.
- Deja los medios de comunicación en la coctelera a 250 rpm en una habitación de 37 ° C y 0% HR durante la noche.
- Retire los medios de comunicación de la coctelera la mañana siguiente y centrífuga usando botellas de 1000 mL en 20.621 × g durante 1 h a 4 ° C para cosechar las células.
-
Deseche el sobrenadante y recoger el precipitado de células.
- Vierta el sobrenadante en un matraz con aproximadamente 5 mL de blanqueador para matar las bacterias. Se trata de residuos.
- Use una espátula para raspar el precipitado de células de la parte inferior de la botella de centrífuga y poner el sedimento en un tubo de centrífuga de 50 mL.
3. purificación de Qβ
- Resuspender el precipitado de células con ~ 20-30 mL de tampón de fosfato de potasio de 0.1 M (pH 7,00).
- Asegúrese de que la resuspensión no tiene trozos y lyse las células usando un procesador microfluidizer según protocolo del fabricante (véase Tabla de materiales). Lyse las células de al menos dos veces para aumentar el rendimiento de las partículas.
- Centrifugue el lisado en botellas de centrífuga de 250 mL a 20.621 x g durante 1 hora a 4 ° C.
- Descarte el precipitado y medir el volumen del sobrenadante en mL. Multiplicar ese valor por 0.265 y añadir esa cantidad de g de sulfato de amonio en el sobrenadante.
- Revuelva en 4 ° C durante al menos 1 h en una placa de agitación a 200 rpm a precipitar hacia fuera la proteína.
- Centrifugue en botellas de 250 mL a 20.621 x g durante 1 h a 4 ° C.
- Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado con unos 10 mL de tampón de fosfato de potasio de 0.1 M (pH 7,00).
- Añadir volúmenes iguales de cloroformo 1:1 / n-butanol a la muestra cruda y mezclar con un vórtex durante unos segundos.
- Centrifugar en tubos de 38 mL en 20.621 × g durante 30 minutos a 4 ° C.
- Recuperar la capa acuosa superior utilizando una pipeta Pasteur. Tenga cuidado no para tomar el gel como capa que se ha formado entre la capa acuosa y orgánica.
- Descongelar seis 5 – 40% gradientes de sacarosa hecha de antemano y cargar unos 2 mL del extracto en cada uno.
- Ultracentrífuga 99.582 x g durante 16 horas a 4 ° C con la desaceleración libre.
- Brillar una luz de diodo (LED) en cada tubo de emisión de luz y una banda azul debe ser visible. Recuperar estas partículas con una jeringa de aguja larga.
- Ultrapellet las partículas a 370.541 x g durante 2,5 h a 4 ° C.
- Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado transparente de partículas purificadas con tampón de fosfato de potasio de 0.1 M (pH 7,00).
4. cuantificación y confirmación del producto
- Utilice análisis de Bradford para cuantificar el producto13.
- Reducir la marcha y no reducir sodio dodecil sulfato poliacrilamida gel electroforesis (SDS-PAGE) para confirmar el producto14.
Nota: Reducción de SDS-PAGE se utiliza para confirmar el peso molecular de la proteína de la capa; no reducción de SDS-PAGE es confirmar la estructura de orden superior.
5. conjugar los compuestos DB en Qβ
-
Reducir disulfuros en Qβ.
- Disolver 0,0020 g de tris(2-carboxyethyl) fosfina (TCEP) en 1 mL de agua ultrapura para hacer una solución stock de 100 x.
Nota: Preparar TCEP fresco antes de la reducción. - Añadir 200 μL de Qβ (5 mg/mL) en un tubo de microcentrífuga.
- Siga añadiendo 20 μl de solución stock de 100 x TCEP.
- Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
- Disolver 0,0020 g de tris(2-carboxyethyl) fosfina (TCEP) en 1 mL de agua ultrapura para hacer una solución stock de 100 x.
-
Volver a puente disulfuro reducido utilizando polietilenglicol dibromomaleimide (DB-PEG).
- Se disuelven 0,0017 g de dibromomaleimide-polietilenglicol (PEG-DB) en 100 μl de DMF.
- Añadir 680 μl de solución de fosfato de sodio 10 mM (pH 5.00).
- Añadir reducido Qβ en la solución de DB-PEG y observar el proceso de mezcla bajo una lámpara de UV 365 nm. La fluorescencia amarillo brillante puede ser visualizada inmediatamente con 365 nanómetro portátil UV lámpara con mezcla.
- Que la reacción proceda durante la noche a temperatura ambiente (RT) en un asador estilo rotisserie.
- Purificar la mezcla de reacción por filtro centrífugo (COMW = 10 kDa) tres veces utilizando 1 x PBS a 3.283 x g por 20 min a 4 ° C.
- Supervisar la conjugación por no reducción de SDS-PAGE y electroforesis del gel de agarosa al nativo.
Nota: VLPs ejecutan como partículas intactas en gel de agarosa nativa, y son separados en base a su carga, tamaño y forma.
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Representative Results
Los derivados de dibromomaleimide se pueden sintetizar mediante la reacción de condensación entre el anhídrido dibromomaleimide y aminas primarias15. Como alternativa, un método sintético suave16 usando N-Metoxicarbonil activado 3,4-dibromomaleimide fue explotada aquí reaccionando con metoxipolietilen glicol (PEG) al rendimiento DB-PEG (figura 1). NMR fue utilizada para identificar la estructura compuesta (figura 2). Qβ VLP es una 28 nm icosaédrica proteica nanopartícula, que se compone de proteínas idénticas capa 180. Las proteínas de la capa tienden a formar dímeros que se enclavija no covalente a través de sus α-helicoidal dominios con las β-hojas de la capa adyacente proteínas17. VLPs tienden a ser seleccionados para su estabilidad a temperaturas elevadas, pHs extremos y en varias composiciones solvente18. En este caso, Qβ VLP es más estable que otros phages RNA de la familia Leviviridac por 180 disulfuro inter-filamento situado en el cinco y seis veces de ejes de simetría de la cápside19 (figura 3). Estas estructuras hexamérica y pentamérica están vinculadas por disulfuros, que pueden ser visualizados por no reducción de SDS-PAGE19. Diez equivalentes de TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine) (0.70 μmol), en relación con los disulfuros en 1 mg de Qβ (proteína de la cápsida de 0.070 μmol, 0,070 disulfuros μmol), fueron utilizados para reducir todos los disulfuros para generar la cápsida Qβ reducido (rQβ) a temperatura ambiente en una hora y no reducción de SDS-PAGE muestra que todas las estructuras de orden superiores se redujeron a proteínas monoméricas de capa (figura 4 y figura 5A). La reacción a les rebridge fue hecha como una síntesis de una olla, como la adición de crudo rQβ ha sido añadida directamente a 20 equivalentes de una solución de DB-PEG (1,4 μmol) de fosfato de sodio (10 mM, pH 5.00, 10% DMF) después de la reacción de reducción de una hora11. Hubo observable fluorescencia amarillo brillante bajo la lámpara de 365 nm UV (figura 5) inmediatamente después de la adición de la DB-PEG. La mezcla luego se incubó a RT durante la noche en un asador, seguido de purificación con filtro centrífugo (MWCO = 10 kDa) enjuague con el tampón deseado tres veces para quitar cantidades excesivas de moléculas pequeñas. Los conjugados malemide Qβ se resuspendió en solución de fosfato de sodio 10 mM (pH 5.00) para promover la estabilidad lumínica. La conjugación fue confirmada por no reducción de SDS-PAGE bajo UV y coomassie blue tinción (figura 5A). Todas las bandas demostraron fluorescencia (figura 5A) bajo UV que colocalized con el azul de coomassie de tinción, que representa una conjugación exitosa. La integridad de Qβ PEG conjugados fueron confirmados por agarosa nativo gel electroforesis y transmisión de microscopía electrónica (TEM) (figura 5B, C).
La espectroscopia de la fluorescencia demostrada los máximos de excitación y emisión de Qβ-maleimida (Qβ-Μ) y Qβ-PEG 400 nm y 540-550 nm, respectivamente (figura 6). Esto se alinea con el conjunto de filtro de GFP-uv disponible en el mercado, cuya longitud de onda de excitación es 405 nm y emisión de longitud de onda es 500-540 nm. La adaptación conveniente de las propiedades fotofísicas de conjugados con el filtro disponible comercialmente establece permiso utilizando Qβ PEG como una sonda en vitro , que fue hecha y reflejada en la figura 7. Qβ-PEG (200 nM) se incubaron con células de ratón primas-264.7 en medio DMEM libre de suero, seguido del núcleo tinción. Imágenes de colocalización en la figura 7 muestra que las partículas fluorescentes amarillo fueron captados por primas-264.7 células y pueden rastrearse tras cuatro horas de incubación. La unfunctionalized Qβ VLPs presentan fluorescencia insignificante.
Figura 1: esquema sintético de PEG DB. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: caracterización NMR. (A) 1 RMN de H y B 13C del DB-PEG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: estructura cristalográfica de cápside Qβ VLP como procesados en quimera (PDB ID: 1QBE). Dos residuos de cisteína (Cys 74 y 80 de Cys) se muestran en naranja.
Figura 4: esquema de la conjugación de conjugados Qβ-maleimida (Qβ-M). Qβ (0.07 μmol de disulfuros) fue reducido utilizando 10 equivalentes de TCEP (0,7 μmol) a temperatura ambiente durante una hora, seguida por la adición de 20 equivalentes de compuestos dibromomaleimide (DB y DB-PEG) (1,4 μmol). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: caracterización de Qβ, rQβ, Qβ M y PEG Qβ. (A) sin reducción de SDS-PAGE y agarosa nativo (B) gel de Qβ, rQβ, Qβ M y Qβ-PEG bajo UV (arriba) y coomassie blue tinción (abajo). (C) micrografía TEM de Qβ-M (parte superior) y Qβ-PEG (abajo). (D) mezcla de la reacción de la fotografía de Qβ-PEG bajo iluminación nm UV 365. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: espectros de fluorescencia. Excitación (A) y emisión (B) espectros de fluorescencia de Qβ M y Qβ-PEG en 0.1 M tampón fosfato de potasio (pH 7,00). La excitación máxima es alrededor de 400 nm y la emisión máxima es de alrededor de 540-550 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: imágenes de fluorescencia Confocal de Qβ PEG conjugan en células macrófagos 264.7. Azul: NucRed viven 647 ReadyProbes reactivos. Amarillo: Qβ-PEG. Top imágenes: combina los canales azules y amarillos. Fondo de imágenes: imágenes de campo claro. Sistemas de filtro: uv-GFP (λex = 405 nm, λem = 500-540 nm), Cy5. Tiempo de incubación fue de 4 h. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En comparación con purificación de proteínas más pequeñas, un único paso en la purificación de bacteriófago Qβ es la centrifugación del gradiente de sacarosa. Después del paso de extracción de cloroformo/n-butanol, Qβ más se purifica mediante gradientes de sacarosa 5-40%. Durante la centrifugación, las partículas se separan en base a sus tamaños. Las partículas más grandes viajan a la región de densidad más alta, mientras que las partículas más pequeñas permanecen en la región de más baja densidad. Qβ viaja hasta el tercio inferior de la gradiente y permanece allí mientras que pequeñas impurezas de la proteína se encuentran atrapadas en la parte superior del tubo de centrífuga. Muestra de la suspensión coloidal de Qβ Tyndall fuerte difusión en el gradiente de sacarosa, que puede ser visto como una banda azul cuando es brilló una luz LED de debajo. Esta banda es entonces fácil de extraer con una aguja de jeringa larga. Qβ en sacarosa entonces es peleteado por ultracentrifugación, que rinde una claro de la pelotilla. El pellet se resuspendió en el tampón deseado o más purificado por cromatografía líquida de la proteína rápida (FPLC). La pureza de la partícula resultante puede confirmarse por SDS-PAGE.
TCEP no es estable en tampón fosfato, por lo que una solución stock de 100 x TCEP debe ser recién preparado en agua justo antes de la reducción. Además, TCEP contiene tiol libre ni reacciona hacia otros aminoácidos, por lo que no es necesario quitar el exceso de TCEP antes de realizar la reacción de conjugación. Dibromomaleimide compuestos se disuelven en solución de pH 5,00 fosfato de sodio, seguido añadiendo la Qβ reducida. A pH 5,00, cisteína (reducido disulfuro) es protonada, que promueve la reacción de conjugación con dibromomaleimide por prevenir la reoxidación a un disulfuro. 365 bajo iluminación UV de nm, la mezcla de reacción emite fluorescencia amarilla inmediatamente después Qβ reducido fue agregado en compuestos de DB. Forma diferente de fijar previamente sintetizado fluoróforos en Qβ, esta fluorescencia es inducida por la reacción de conjugación. El fluoróforo está formado tan pronto como se crean los nuevos bonos entre el azufre y el anillo de maleimida. Espectros de fluorescencia muestra que la excitación (400 nm) y emisión (550 nm) maxima colocar el filtro uv-GFP en un microscopio confocal (λex = 405 nm, λem = 500−540 nm). Luego se incubó Qβ PEG con macrófagos Raw 264.7 en DMEM libre de suero. Después de cuatro horas de incubación, Qβ-PEG fue captados y punteado amarillo fluorescentes compartimientos pueden visualizarse dentro de las células. Un hecho que necesita ser mencionado es que la fluorescencia puede ser transferida de alguna medida a albúmina de suero bovino (BSA) en suero u otras sustancias ricas en cisteína dentro de los lisosomas o el endosomas finales de las células. Con el tiempo, esto debilitará la fluorescencia dentro de la célula de la célula de seguimiento de aplicaciones; sin embargo, también proporciona una oportunidad para un nuevo diseño para sistemas de suministro de medicamentos.
En conclusión, hemos demostrado conjugando DB-PEG en VLP Qβ a través de química dibromomaleimide-tiol. La reacción de conjugación de all-in-one no sólo functionalizes los disulfuros a lo largo de los poros en VLP con PEG, pero también hace que sea una nanopartícula fluorescente etiquetada proteica.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
J.J.G. reconoce la Fundación de ciencia nacional (DMR-1654405) y cáncer prevención Research Institute of Texas (CPRIT) (RP170752s) por su apoyo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth (Miller) | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Tryptone, Poweder | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| Yeast Extract, Poweder | Research Products International | Y20020-1000.0 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | P212121 | CI-06808-1KG | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System | Fisher Scientific | 4474524 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590B | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor | Fisher Scientific | 096-041053 | |
| Ammonium Sulfate | P212121 | KW-0066-5KG | |
| Chloroform | Alfa Aesar | 32614-M6 | |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum | Beckman Coulter | 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set | |
| Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL, | Beckman Coulter | 337922 | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Fisher Scientific | PI23200 | |
| TRIS Hydrochloride | Research Products International | T60050-1000.0 | |
| Tetramethylethylenediamine | Alfa Aesar | J63734-AC | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706-2G | |
| 2 3-Dibromomaleimide 97% | Sigma Aldrich | 553603-5G | |
| Polythylene Glycol | Alfa Aesar | 41561-22 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | AC424375000 | |
| Acrylamide/bis-Acrylamide | P212121 | RP-A11310-500.0 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771-100G | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Labnet Revolver Adjustable Rotator | Thomas Scientific | 1190P25 | |
| 1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer | Thermo Scientific | 3141-0250 | |
| Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| 2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim | Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P Microfluidizer Materials Processor | Microfluidics | M-110P | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3117-0380PK | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Cylinder, Graduated - Polypropylene 250 mL | PolyLab | 80005 | |
| 533LS-E Series Steam Sterilizers | Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid | LabSource | D36-313-CS | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Microcentifuge Tube: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| VWR Os-500 Orbital Shaker | VWR Scientifc Products | 14005-830 | |
| Tetra Handcast systems | Bio-Rad | 1658000FC | |
| Polypropylene, 250 mL | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Spectrofluorometer NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| Long Needle | Hamilton | 7693 | |
| Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock | Fisher Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| P100 Pipetman | Gilson | F123615 | |
| P20 Pipetman | Gilson | F123600 | |
| P10 Pipetman | Gilson | F144802 | |
| Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance | Intelligent Weighting Technology | IWT_PM100 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl | Bio-Rad | 456-1084 |
References
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