Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لتصوير الخلية الحية TGF-β/Smad3 مما يشير إلى النشاط باستخدام نظام مراسل إتش. هذا النظام تعقب النشاط الترانسكربتي في الوقت الحقيقي، ويمكن تطبيقها على كل واحدة من الخلايا في المختبر وفي الحيوانات الحيةالنماذج.
Abstract
تحويل عامل النمو مما يشير إلى بيتا (TGF-β) ينظم العديد من الوظائف الهامة المطلوبة للتوازن الخلوية ويوجد عادة overexpressed في العديد من الأمراض، بما في ذلك السرطان. TGF-β بشدة تورط في ورم خبيث خلال أواخر مرحلة تطور السرطان، تفعيل مجموعة فرعية خلايا السرطانية الكثيرة الارتحال والغازية. الأساليب الحالية للإشارات تحليل مسار التركيز على نماذج نقطة النهاية، والتي غالباً ما تحاول قياس الإشارات وظيفة مخصصة للحدث البيولوجي ولا تعكس الطابع التدريجي لهذا المرض. هنا، علينا أن نظهر إتش رواية مراسل نظام محدد للمسار TGF-β/Smad3 إرسال الإشارات التي يمكن الكشف عن التنشيط النسخي في الخلايا الحية. استخدام مراسل الإعلانية-كاجا12-Td-توم ، يمكننا أن نحقق معدل إصابة بنسبة 100% من جمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا ضمن 24 ساعة في المختبر. يسمح استخدام مراسل الفلورسنت لتصوير خلايا حية في الوقت الحقيقي مع التعرف المباشر من الخلايا النشطة ترانسكريبتيونالي. تنشيط الخلايا المصابة مع TGF-β يعرض مجموعة فرعية فقط من الخلايا التي يتم ترانسكريبتيونالي النشط والمشاركة في الوظائف البيولوجية المحددة. يسمح هذا النهج بخصوصية عالية وحساسية على مستوى خلية واحدة تعزيز فهم الوظائف البيولوجية المتصلة ب TGF-β الإشارات في المختبر. Smad3 يمكن أيضا أن يكون النشاط الترانسكربتي عنها في فيفو في الوقت الحقيقي من خلال التطبيق الإعلانية-كاجا12-لوك المراسل. الإعلانية-كاجا12-لوك يمكن أن يقاس بنفس الطريقة كخطوط الخلايا لوسيفراس ستابلي transfected التقليدية. يمكن تحليلها من خلال تصوير إيفيس التقليدية Smad3 النسخي نشاط الخلايا مزروع في فيفو ورصدها لايف أثناء تطور الورم، تقديم رؤية فريدة من نوعها في ديناميات مسار الإشارات TGF-β. لدينا بروتوكول وصف نظام تسليم مراسل مفيد السماح للتصوير الفائق السريع للخلايا الحية مما يشير إلى مسارات في المختبر و في فيفوعلى حد سواء. ويمكن توسيع هذا الأسلوب على مجموعة من الصور على أساس فحوصات ويعرض كنهج حساسة واستنساخه للبيولوجيا الأساسية والتنمية العلاجية.
Introduction
تحويل عامل النمو بيتا (TGF-β) هو سيتوكين أساسي المتورطين في التنمية البشرية أن الإشارات عبر هيتيروديميريك معقدة تتألف من النوع الثاني، والنوع الأول من مستقبلات1. ملزم بكتابة مستقبلات الثاني النتائج في التوظيف والفسفره من نوع أنا مستقبلات، الذي بدوره فوسفوريلاتيس المصب Smad2/3 البروتينات2،3. تنشيط هذه Smad2/3 ربط البروتينات Smad4، تشكيل مجمع translocates إلى النواة، وينظم الجينات النسخ4. تحت شروط التماثل الساكن TGF-β/سمد مما يشير إلى أحكام تنظم؛ ومع ذلك، في العديد من الأمراض، مسار الإشارات هو رفع الضوابط التنظيمية و overexpressed غالباً ما تؤدي إلى تطور المرض5،،من67. أظهرت الدراسات الأخيرة أن الاستجابة الخلوية إلى TGF-β ايربان والفئات السكانية الفرعية TGF-β/سمد الخلايا النشطة المسؤولة عن الوظيفة البيولوجية ب طريقة تعتمد على الوقت8،9. تحليل الخلوية المشتركة مما يشير إلى TGF-β/سمد ينطوي على استخدام نقطة نهاية ثابتة فحوصات أن توفر سوى لقطة نشاط الخلوي وغالباً ما قوانتيتاتي TGF-β/سمد تأثير متوسط10. هذه الأساليب، ومع ذلك، قد لا بدقة تمثل تصرفات الجزيئية TGF-β/سمد إشارات في حالة فسيولوجية أثناء تطور المرض. التقاط الصورة القائمة على تحليل الخلايا الحية ديناميات العمليات الخلوية والبيولوجية مع فهم المكانية والزمانية.
أن هدفنا التوصل إلى أسلوب الفائق حساسية لتصوير الخلايا الحية من TGF-β/سمد مما يشير إلى استخدام الكواشف المستندة إلى إتش. هنا، نحن المصابين خط خلية سرطان الثدي البشرية MDA-ميغابايت-231 إتش التعبير عن تسلسل ربط الحافز كاجا Smad3 ولوسيفراس (لوك) أو الجينات مراسل Td-الطماطم (Td-توم). توفر أنظمة مراسل أدينوفيرال طريقة رخيصة وسريعة لإدخال بلازميد التي يمكن أن يسفر عن معدل إصابة بنسبة 100% في خطوط خلايا السرطان. نظم مراسل أدينوفيرال كما طبقت بنجاح إلى خطوط الخلايا التي يصعب على ترانسفيكت مع بلازميد التقليدية11. في هذا البروتوكول ونحن سوف تصف عملية استنساخه وموسع لتحقيق تصوير الخلايا الحية لمسار TGFβ/سمد الإشارات في الجسم الحي وفي المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ووافقت جامعة "ملبورن الحيوان الأخلاقيات اللجنة" جميع التجارب على الحيوانات.
ملاحظة: متجهات البروتوكول التسلسل والبناء وتوليد أدينوفيرال فالإعلان-CMV-Td-توم، فالإعلان-CMV-التجارة والنقل وفالإعلان-كاجا12-لوك/Td-توم تم وصفه سابقا11،12، 13. جميع ناقلات متوفرة تجارياً.
1-فيروس عيار التصميم باستخدام 50% زراعة الأنسجة الجرعة المعدية (تسيد50)
- إعداد 1 × 106 خلايا HEK293A في 10 مل من دميم + 10% FBS وسائل الإعلام.
- البذور 100 ميليلتر من تعليق خلية في كل بئر من صفيحة ثقافة مسطحة 96-جيدا-أسفل الخلية.
- إعداد 1 مل إضعاف مخزون الفيروس في المتوسط الكامل 1: 100. إضافة 11 ميليلتر من الفيروس المخفف لكل بئر من العمود 1.
- إجراء تخفيف إذ المسلسل مباشرة في لوحة جيدا 96 بخلط ميليلتر 11 من الفيروس المخفف مع 100 ميليلتر من تعليق خلية حتى نهائية إضعاف 1 x10 هو التوصل إلى12 . وعلى الرغم من الخلايا غير ملتصقة في هذه المرحلة، لا يزال عدد الخلايا المنقولة بين الآبار المستمر.
- "الماصة؛" ميليلتر 11 من كل تمييع في كل عمود بدءاً بإضعاف أعلى من 104. استبدال نصائح ماصة مع كل تمييع الحد عبر أكثر جسيمات الفيروسية.
- إضافة 11 ميليلتر لوسائل الإعلام كاملة خالية من الفيروسات إلى عمود 12 كعنصر سلبي.
- احتضان لوحة لمدة 7-10 أيام في 37 درجة مئوية مع 10% CO2.
- استخدام مجهر، يسجل العدد الآبار في كل عمود عرض علامات آثار سيتوباثيك أو السامة للخلايا. تنظر إيجابيا جيدا في حالة وجود أي علامة على الإصابة.
- حساب جزء الآبار الإيجابية لتمييع كل استخدام الأسلوب الإحصائي (1938) ريد ومونش14.
- حساب باستخدام المسافة النسبية (PD): (A-50)/(A-B)، حيث A هو استجابة النسبة المئوية المذكورة أعلاه أو يساوي 50% وب رد نسبة أقل من 50%.
- حساب تسيد باستخدام50 : 10X PD، حيث X هو تمييع إعطاء استجابة أكبر من 50%.
- حساب عيار الفيروسية من استخدام ما يلي: 0.69/(0.011 x TCID50) بفو/mL
2. تصميم موي إتش
- بذور 1.0-1.5 × 105 نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا مع 500 ميكروليتر من دميم ثقافة وسائل الإعلام التي تحتوي على 5% FBS في كل بئر 12 لوحة جيدا (كونفلوينسي خلية 35%، 6 آبار في المجموع).
- حساب حجم الأسهم Ad-CMV-Td-توم المطلوبة ل 0، 250، 500، 2500، ووزارة الداخلية 5000 استخدام الصيغة التالية: وزارة الداخلية = (حجم [ميكروليتر] x بفو/ميكروليتر)/عدد الخلايا. الإعلان-CMV-Td-توم مع عيار 1 × 1010 (بفو/mL)، وحدات التخزين من الإصابة بعدوى الفيروس هي أشهر مطلوب 0 و 3.75، 7.5، 37.5 وميكروليتر 75 على التوالي.
- تصيب الخلايا مع أحجام المحسوبة الإعلان-CMV-Td-توم في القسم 2-2 قبل مباشرة بيبيتينج الأسهم الفيروسية في الآبار بخلط دقيق.
- ضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 10% CO2 ح 24.
- قم بإزالة الوسائط من الآبار ومباشرة إصلاح الخلايا مع 500 ميكروليتر من الفورمالين 10% لمدة 5 دقائق.
- نضح الفورمالين من الآبار وغسل الآبار مع 500 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني مرة واحدة.
- وصمة عار نواة الخلية مع 500 ميكروليتر من هويشت الحل لمدة 5 دقائق.
- إزالة الحل هويشت وغسل الآبار مع 500 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني 3 مرات.
- صورة البروتين Td-الطماطم ونواة الخلية الإشارات باستخدام 200 X التكبير في مجهر الأسفار. تثير البروتين Td-الطماطم في 554 نانومتر وصبغة هويشت في 352 نيوتن متر.
- تحليل الصور باستخدام إيماجيج لتحديد العامل في وزارة الداخلية اللازمة للإصابة 100% من الطماطم Td15.
3-توصيل مزدوج-إتش في الخلايا المفردة لايف
- بذور 1.0-1.5 × 105 نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا مع 500 ميكروليتر من دميم ثقافة وسائل الإعلام التي تحتوي على 5% FBS في كل بئر 12 لوحة جيدا (خلية 35% كونفلوينسي، 2 الآبار في المجموع).
- تصيب الخلايا مع ميكروليتر 75 من الإعلان-CMV-التجارة والنقل (عيار = 5 × 109 بفو/mL) و 7.5 ميكروليتر من الإعلان-كاجا12-Td-توم (عيار = 5 × 1010 بفو/mL) للحصول على 2,500 وزارة الداخلية، التي يمكن أن تحقق نسبة 100% الإصابة الإيجابية.
- علاج الخلايا مع أو بدون ميكروليتر 0.25 من TGF-β في البئر (10 ملغ/مل في المخزون، 5 نانوغرام/ميكروليتر كتركيز النهائي) فورا بعد عدوى إتش.
- ضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 10% CO2 ح 24.
- صورة الخلايا الحية بالمجهر الطوري الأسفار. تثير التجارة والنقل في شمال البحر الأبيض المتوسط والبروتين Td-الطماطم في 554 470 شمال البحر الأبيض المتوسط.
- إصلاح الخلايا ووصمة عار نواة الخلية كما هو موضح في الخطوات 1.6-1.9.
- صورة البروتين Td-الطماطم وهويشت وصمة عار باستخدام مجهر الأسفار. تثير صبغ هويشت في 352 نيوتن متر.
- باستخدام إيماجيج، حساب النسبة المئوية للايجابية بروتينات فلورية خضراء والطماطم Td الخلايا15.
4-يعيش وحيد الخلية إشارات في التئام الجروح الإنزيم
- البذور 4-5 × 105 نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا مع 1 مل من وسائط الثقافة دميم التي تحتوي على 5% FBS في كل بئر من 6 كذلك لوحة (خلية 50% كونفلوينسي، 2 الآبار في المجموع).
- تصيب الخلايا مع ميكروليتر 22.5 من الإعلان-كاجا12-Td-توم (عيار = 5 × 1010 مليلتر بفو، موي = 2,500).
- ضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 10% CO2 ح 24.
- خدش اثنين من خطوط متقاطعة على طبقة خلية لكل بئر باستخدام تلميح ماصة P200.
- قم بإزالة الوسائط القديمة من الآبار واستبدالها 2 مل الطازجة 5% FBS وسائل الإعلام مع أو بدون 0.5 ميكروليتر من TGF-β في البئر (10 ملغ/مل في المخزون، 5 نانوغرام/ميكروليتر كالتركيز النهائي).
- ضع اللوحة في الحضانة عند 37 درجة مئوية مع 10% CO2 لمدة 5 دقائق والتقاط صور لمناطق الجرح مختارة باستخدام 100 X التكبير في مجهر تباين المرحلة.
- ضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 10% CO2 ح 24.
- التقاط صور لإغلاق الجرح في نفس المجالات قبل.
- إصلاح الخلايا ووصمة عار نواة الخلية، كما هو موضح في الخطوات 1.6-1.9 وتصور إشارة Td-الطماطم في منطقة الجرح والمنطقة غير الجرح باستخدام 200 X التكبير في مجهر الأسفار.
- تقدير النسبة المئوية للخلايا Td-الطماطم الإيجابية في مجال غير الجرح باستخدام البرمجيات إيماجيج15والجرح.
5. في المختبر بالانزيم لوسيفراس
- إعداد تعليق خلية من 3-5 × 104 نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا في 1 مل دميم الوسائط التي تحتوي على 5% FBS.
- تصيب تعليق خلية مع 2.5 ميكروليتر من الإعلانية-كاجا12-لوك (عيار = 5 × 1010 مليلتر بفو، موي = 2,500).
- بذور الخلايا المصابة إلى 96 لوحة جيدا في 3,000 الخلايا/100 ميليلتر/جيدا.
- ضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 10% CO2 ح 24.
- قم بإزالة الوسائط القديمة من الآبار واستبدال 100 ميليلتر من 5% FBS وسائط جديدة مع أو بدون 0.1 ميكروليتر من TGF-β كل بئر (1 ملغ/مل في المخزون، 1 نانوغرام/ميكروليتر كتركيز النهائي) وفي وجود أو عدم وجود 0.17 ميكروليتر من TGF-β مثبط لكل بئر (7 مغ/مل في الأوراق المالية ، 12 نانوغرام/ميكروليتر كالتركيز النهائي) (TGF-β رواية يجند فخ بروتين، تشن et al.، أعمال غير منشورة).
- ضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 10% CO2 ح 24.
- ذوبان الجليد من الركازة نظام الإنزيم لوسيفراس وتعد الخلية x 1 الثقافة تحلل الكاشف في الماء المقطر مزدوجة (دو).
- قم بإزالة الوسائط من الآبار 96 والآبار مع 50 ميكروليتر 1 x خلية الثقافة تحلل المخزن المؤقت على الجليد باستخدام شاكر مداري مع الانفعالات لطيف لمدة 30 دقيقة.
- نقل 30 ميكروليتر من ليستي من كل بئر في صفيحة لوسيفراس مبهمة وتسمح لوحة الحارة إلى درجة حرارة الغرفة.
- على البرنامج لومينوميتير، قم بإنشاء بروتوكول جديد. حدد 1 حاقن مع القياسات قبل وبعد الحقن. تعيين قياسات قبل الحقن في 1 s التأخير في القياس و الوقت التكامل. لبعد قياس حقن، تعيين حجم الحقن إلى 40 ميكروليتر مع تأخير في قياس 1 s بعد الحقن و 5 ق الوقت التكامل. تأكيد الإعدادات عن طريق اختيار "موافق".
- ضع الأنبوب حاقن في دو، وانقر فوق الزر 1 حاقن تحت إعدادات رئيس الوزراء لتنظيف الأنبوب حاقن قبل الاستخدام. المقبل إزالة أنبوب حاقن من دو ومكان في الهواء متبوعاً بزيادة اثنين يعبي من حاقن 1 لمسح كل حل من الأنبوب. ضع الأنبوب حاقن إلى الركيزة اليراع، ومرة أخرى رئيس الوزراء مرتين لإعداد الركازة.
- وضع لوحة لوسيفراس كامد مع العينات في لومينوميتير وحدد الخيارات في البرنامج. تسليط الضوء على الآبار للفائدة، وانقر فوق تطبيق. اضغط على بدء لقياس الإشارات لوسيفراس.
- بمجرد اكتمال القياسات، إزالة وشطف اللوحة مع الماء. استرداد أي الركازة المتبقية في أنبوب حاقن بوضع الأنبوب في الهواء و رئيس الوزراء حاقن 1 العودة إلى أنبوب الركيزة اليراع. ضع الأنبوب حاقن في دو وأداء اثنين زيادة الإعداد الأولية لتنظيف الأنبوب حاقن من أي الركازة المتبقية.
6-خلية التحضير للعيش مما يشير إلى التصوير في فيفو
- 48 ساعة قبل غرس الورم، البذور 2-3 × 106 MDA-ميغابايت-231 الخلايا إلى 175 سم2 قوارير (10 قوارير في المجموع). الثقافة الخلايا في 20 مل دميم الوسائط التي تحتوي على 5% FBS في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 10%2.
- 24 ساعة في وقت لاحق، إضافة 300 ميكروليتر من الإعلانية-كاجا12-لوك (عيار = 5 × 1010 مليلتر بفو، موي = 2,500) في كل قارورة. إبقاء الخلايا في الثقافة لآخر 24 ساعة.
- في يوم غرس، قم بإزالة الوسائط القديمة وغسل الخلايا المصابة إتش مرة واحدة مع 20 مل من برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4. إضافة 2 مل 0.05% التربسين-يدتا في قارورة وهز قارورة قليلاً للسماح التربسين لتغطية كافة السطح قارورة. ضع قارورة في للحاضنة 37 درجة مئوية، 10% CO2 لمدة 3 دقائق.
- آرو التربسين بإضافة 8 مل وسائط التي تحتوي على FBS دميم في قوارير. نقل كل خلية المعلقات في زجاجة كاشف زجاج.
- حساب عدد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير ونقل 4.8 × 107 الخلايا في أنابيب الطرد المركزي 50 مل اثنين.
- الطرد المركزي الخلايا في 400 غرام x لمدة 5 دقائق في RT إزالة التربسين وريسوسبيند الخلايا في 720 مل الطازجة FBS-دميم الوسائط.
- نقل تعليق خلية في أنبوب عقيم 5 مل وإضافة 160 ميكروليتر ماتريجيل (تعليق ماتريجيل المجموع 10%).
- تبقى الخلايا على الجليد حتى غرس.
7-أورثوتوبيك غرس
- تزن 12 مشمولان الفئران وتخصيص الفئران عشوائياً إلى مجموعات المراقبة والعلاج (6 الفئران في المجموعة).
- تنفيذ غرس في خزانة الحيوية عقيمة للحفاظ على بيئة معقمة. تخدير الماوس باستخدام isoflurane 2.5-4.5% بمعدل 1 لتر/دقيقة مكان الماوس على لوحة حرارة تدفق أكسجين والاستغناء عن قطره التشحيم مرهم العين على كلتا العينين لتجنب حدوث تلف القرنية. إصلاح الماوس للوحة الحرارة في موقف ضعيف في حين الحفاظ على التخدير بوضع الآنف إلى مخروط الآنف متصل إيسوفلوراني.
- تأكيد نجاح التخدير بعدم وجود رد فعل على أخمص القدمين قرصه. تقليل إيسوفلوراني لجرعة صيانة من 1.5-2.5% مع الأكسجين 1 لتر في الدقيقة للتذكير لغرس.
- تنظيف الجلد من الحلمة الرابعة على كلا الجانبين لخط الوسط باستخدام مسحه القطن انخفضت إلى الإيثانول 80%.
- البحث عنال 4 الثديية لوحة الدهون عن طريق الجس والضغط على لوحة الدهون زيادة تعريض الأنسجة.
- مزيج من تعليق خلية جيدا من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً. بلطف نضح 50 ميليلتر من خليط الخلية في محقن الأنسولين ز 27 وحقن في لوحة الدهون الثديية على كلا الجانبين من الماوس.
- تأكيد حقنه ناجحة بالشعور تورم لوحة الدهون. الإفراج عن لوحة الدهون بلطف وضع الماوس مرة أخرى إلى القفص.
- ترك الأقفاص على لوحة الحرارة مدة 30 دقيقة على الأقل للسماح للفئران لاكتساب الوعي ووضع الأقفاص ثم مرة أخرى في الغرفة عقد لمدة 3 أيام.
8-تصوير IVIS
- قم بفتح البرنامج الصورة الحية .
- تهيئة نظام إيفيس بالنقر فوق الزر إيفيس تهيئة النظام في لوحة التحكم. انتظر حتى يتم تشغيل تسجيل درجة الحرارة الخضراء.
- حدد "وضع التصوير" الإنارة في لوحة التحكم.
- قم بتشغيل isoflurane التخدير للدائرة ونظام إيفيس.
- تخدير الفئران باستخدام isoflurane 2.5-4.5% مع الأكسجين 1 لتر في الدقيقة. بمجرد أن فظاعتها، تعيين isoflurane 1.5 2.5% للصيانة. ضخ 150 مغ/كغ من وزن الجسم من د-لوسيفرين في الفئران عن طريق الحقن داخل (القائمة).
- نقل على الفور الفئران في النظام إيفيس، وضعها على منصة التصوير التحكم في درجة الحرارة ومكان أنوفهم في مخروط الآنف.
- انقر فوق الزر إعداد تسلسل في لوحة التحكم وحدد Binning المتوسطة.
- إعداد وقت التعرض التصوير كما يلي: 10 ق، 20 ق، 30 ثانية، 60 s، و 120 س. بدء التصوير حوالي 3 دقيقة بعد حقن لوسيفرين ولا تزال الصورة حتى يبدأ الإشارة إسقاط (عادة هذا سوف يستغرق حوالي 20 دقيقة).
- إزالة الفئران من إيفيس مع الحفاظ على مخدر إيسوفلوراني عن طريق مخروط الآنف وعلاج الفئران مع 50 ميليلتر PBS أو 50 ميليلتر TGF-β إشارات المانع (50 ميكروغرام/ورم) عن طريق الحقن داخل الورم.
- وضعت الفئران في القفص وتترك لهم على لوحة الحرارة لمدة 30 دقيقة على الأقل. ثم ضع القفص مرة أخرى في الغرفة القابضة.
- كرر إيفيس التصوير الداخلي كما هو موضح أعلاه اليوم التالي للعلاج.
9-بيانات التحليل
- فتح الملفات المحفوظة في برنامج الصور الحية .
- العثور على معلومات الصورة باستخدام طريقة العرض | معلومات الصورة.
- قم بتحديد الصور التي التقطت في نقطة وقت مماثلة بنفس الوقت التعرض. تحميل صور كمجموعة.
- قم بإلغاء تحديد مربع الفردية في ضبط الصورة لتطبيع الكثافة.
- حدد وضع فوتون لتحليل الكثافة. قياس كثافة الإشارة عن طريق تحديد الزر المنطقة الفائدة (ROI) في أدوات العائد على الاستثمار.
- اسحب الدائرة عائد الاستثمار للمنطقة التي تحتوي على إشارة طرحه وانقر فوق الزر تدبير الحصول على كثافة إشارة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يعيش خلية مفردة التصوير في المختبر
لإجراء تقييم دقيق لتفعيل TGF-β/سمد الإشارات في الخلايا المفردة باستخدام الكواشف إتش أساس، من المهم أولاً تحديد أمثل تعدد للعدوى (وزارة الداخلية) لكل خط الخلية. يتم تحديد وزارة الداخلية الأمثل عند 100% خلايا إيجابية للإصابة أدينوفيرال مع أي آثار سيتوباثيك أو السامة للخلايا الحالية. لتحديد هذا، استخدمنا مراسل الإعلانية-CMV-Td-توم مؤثرا نشطة التي تصرفت كعلامة للعدوى الإيجابية. تم زيادة النسبة المئوية للخلايا المصابة إتش بطريقة تعتمد وزارة الداخلية من 0 إلى 5,000 موي. في وزارة الداخلية 2,500، لاحظنا التعبير Td-توم 100% في جمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا (الشكل 1A، 1B). كما زادت كثافة بكسل/خلية مع وزارة الداخلية، وتوفير زيادة الحساسية والكشف عن الإنتاج النسخي (الشكل 1). ولذلك، استخدم عامل موي 2500 القيام عدوى مزدوجة حيث الخلايا كانوا مصابين الإعلان-CMV-التجارة والنقل (بمثابة السيطرة الإيجابية لعدوى الخلية) و الإعلان-كاجا12-Td-توم في نفس الوقت. خلايا مفردة قدم مستويات متفاوتة من توم Td تعبير يشير إلى تفعيل النسخ TGF-β/Smad3 ايربان عبر الخلايا في الخلايا الحية والثابتة على حد سواء. (الشكل 2 أ، 2). 100 ٪ من جمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا المقدمة مع تعبير بروتينات فلورية خضراء بينما فقط حوالي 26 في المائة خلايا عرض قابلة للاكتشاف النشاط الترانسكربتي TGF-β/Smad3 ح 24 بعد التحفيز TGF-β، مقارنة بالإيجابية 0% بدون علاج TGF-β (الشكل 2). استخدام الكاشف إتش أساس للتحقيق بالنشاط الترانسكربتي TGF-β/Smad3 خلال العمليات البيولوجية، MDA-ميغابايت-231 الخلايا المصابة الإعلان-كاجا12-Td-توم في وزارة الداخلية 2500 ويتعرض لجرح شفاء المقايسة. عرضت جمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا المصابة سلوك الهجرة العادية والخلايا تعامل مع 5 نانوغرام/مل TGF-β أظهر إغلاق الجرح محسنة مقارنة بخلايا بيتا TGF غير المعالجة (الشكل 3A). جدير بالذكر أن حوالي 62% عرض الخلايا في منطقة الجرح إيجابية النشاط النسخي TGF-β/Smad3، وأعلى بكثير مما لوحظ في المنطقة غير الجرح (32 في المائة) بعد العلاج TGF-β (الشكل3B). على هذا النحو، الكواشف المستندة إلى إتش التحقق من تطبيقها لتصوير المسار TGF-β الإشارات في خلية واحدة حية في المختبر.
يعيش TGF-β، مما يشير إلى التصوير في فيفو
وكان حساسية المراسل الإعلانية-كاجا12-لوك أول اختبار في المختبر في الاستجابة للتحفيز TGF-β، ووجود مثبط TGF-β. عندما كانت تحفز MDA-ميغابايت-231 الخلايا المصابة مع 1 نانوغرام/مليلتر TGF-β، ازداد النشاط مراسل لوسيفراس 1,200-fold بالمقارنة مع مستويات MDA-ميغابايت-231 غير المعالجة القاعدية. تم حظر هذا الرد ملحوظة قبل 12 ميكروغرام/مل من مثبط TGF-β (الشكل 4 أ). الإعلانية-كاجا12-لوك كاشف تم اختبارها في وقت لاحق في الثدي ورم أورثوتوبيك غرس حيوان نموذجا. التحكم ومثبط TGF-β معاملة المجموعات أظهرت لوسيفراس مراسل نشاط مماثل قبل العلاج. ومع ذلك، لمجموعة المراقبة، إشارة لوسيفراس لم تتغير بعد العلاج برنامج تلفزيوني، بينما يعامل الفئران مع مثبط TGF-β أظهرت حوالي 3-fold إشارة الحد (الشكل 4 باء، وجيم 4). مجتمعة، هذه النتائج تثبت إمكانية العيش وفي الوقت الحقيقي رصد TGF-β مما يشير إلى النشاط في فيفو دون الحاجة إلى التضحية بالحيوان.
رقم 1. تحديد وزارة الداخلية كاشف المستندة إلى إتش. MDA-ميغابايت-231 الخلايا المصابة الإعلان-CMV-Td-توم في وزارة الداخلية المختلفة وتبذر في لوحة 12 بئرا. 24 ساعة بعد الإصابة، تم إصلاح الخلايا والملون النووية قبل هويشت. الصور (A) أخذت تصور Td-توم الخلايا إيجابية (أحمر) ونواة (أزرق) والكمية التي إيماجيج. (ب) النسبة المئوية للدفتيريا-توم الخلايا إيجابية. (ج) تطبيع Td-توم بكسل الكثافة/خلية للخلفية. وهذه الأرقام هي الممثل لتجارب مستقلة على الأقل 3. البيانات المعروضة وسائل ± تريبليكاتيس مقياس التنمية المستدامة. بار = 50 ميكرومتر (200 X). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. تصوير خلية مفردة للعدوى المزدوجة. نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا كانت المزدوج مصاب الإعلان-CMV-التجارة والنقل و الإعلان-كاجا12-Td-توم في وزارة الداخلية (2,500) وتبذر في لوحة 12 بئرا. 24 ساعة بعد الإصابة، تعامل الخلايا مع أو بدون 5 نانوغرام/مل TGF-β. (A) 24 ساعة بعد العلاج، خلايا كانت حية تصويرها لتصور إيجابي بروتينات فلورية خضراء (الأخضر) والخلايا Td-توم (أحمر) إيجابية. ثم تم إصلاح الخلايا والملون النووية قبل هويشت للقياس الكمي. (ب) الصور نقلوا إلى تصور بروتينات فلورية خضراء إيجابية (الأخضر) والخلايا Td-توم (أحمر) إيجابية ونواة (أزرق). تم قياس كمية الخلايا إيجابية التجارة والنقل (ج) أو Td-توم من إيماجيج وحسبت النسبة المئوية للخلايا إيجابية. وهذه الأرقام هي الممثل لتجارب مستقلة على الأقل 3. البيانات المعروضة هي وسائل ± تريبليكاتيس يحدده اختبار t للطالب الأهمية الإحصائية التنمية المستدامة. (* * * ≤0.0001 ف ). شريط المقياس = 50 ميكرومتر (200 X). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. مما يشير إلى خلية حية TGF-β ويشجع الهجرة الخلية. MDA-ميغابايت-231 الخلايا المصابة الإعلان-كاجا12-Td-توم في وزارة الداخلية (2,500) والمصنف على صفيحة آبار 6. 24 ساعة بعد الإصابة، خلايا تم خدش استخدام تلميح ماصة P200 لخلق جرحا واستبدال وسائط الإعلام مع أو بدون 5 نانوغرام/مل TGF-β. بعد 24 ساعة أخرى، تم إصلاح الخلايا والملون النووية قبل هويشت لتمثيل مرئي. (أ) المرحلة على النقيض إغلاق الجرح، مقياس بار = 100 ميكرومتر (100 X). (ب) الخلايا Td-توم (أحمر) إيجابية ونواة (أزرق). شريط المقياس = 50 ميكرومتر (200 X) تم قياس كمية الخلايا إيجابية (ج) Td-توم إيماجيج وحسبت النسبة المئوية للخلايا إيجابية. وهذه الأرقام هي الممثل لتجارب مستقلة على الأقل 3. البيانات المعروضة هي وسائل ± تريبليكاتيس يحدده اختبار t للطالب الأهمية الإحصائية التنمية المستدامة. (* * * ≤0.0001 ف ). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. فيفو يعيش تصوير إشارات TGF-β- (أ) كانوا مصابين بنجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا الإعلانية-كاجا12-لوك وثم تبذر في لوحة 96 بئرا ح 24. وبعد ذلك، تم علاج الخلايا مع أو بدون 1 نانوغرام/مل TGF-β في وجود أو غياب من 12 ميكروغرام/مل TGF-β المانع بين عشية وضحاها. تم قياس النشاط لوسيفراس استناداً إلى الخلية كله ليستي. وقدمت الأنشطة لوسيفراس كحظيرة التعريفي تطبيع للا مراقبة العلاج. البيانات المعروضة هي وسائل تريبليكاتيس ± التنمية المستدامة. (ب) نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا كانوا مصابين الإعلانية-كاجا12-لوك 24 ساعة قبل الزرع. تم زرع خلايا في لوحة الدهون الثديية على كلا الجانبين من الفئران إخضاعها. وأجرى 72 ح في وقت لاحق، إيفيس التصوير قبل وبعد العلاج ح 24 (برنامج تلفزيوني لمجموعة المراقبة) و 50 ميكروغرام/الورم TGF-β مثبط لفريق العلاج. فوتون (ج) كان كمياً التمويه ببرامج "الصور الحية". البيانات المعروضة هي الوسيلة لكل مجموعة العلاج (ن = 12) ± الأهمية الإحصائية التنمية المستدامة. يتحدد اختبار t للطالب (* * ≤0.01 ف ، * * * ≤0.0001 ف ). p/s يشير إلى الفوتونات/س. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قمنا بتطوير تقنية للسماح للتصوير في الوقت الحقيقي من إشارات TGF-β/Smad3 في الخلايا الحية المفردة. باستخدام هذا الأسلوب الرواية، سابقا حددنا عدد سكان الفرعية للخلايا مع دينامية النشاط النسخي TGF-β/Smad3 الذي ارتبط بغزو المحسنة والهجرة8. يحسن هذا الأسلوب على الاختبارات التقليدية للإشارات TGF-β، مثل البقع الغربية من الفسفرة Smad3 واستهدفت TGF-β التعبير الجيني، بالاستيلاء على عدم تجانس من TGF-β/Smad3 الإشارات داخل السكان الورم وتسليط الضوء على أهمية البيولوجيا خلية مفردة. بالإضافة إلى ذلك، أساليب بديلة للتصوير وحيد الخلية مثل إزفاء النووية يمكن أن يكون مضيعة للوقت ومكلفة إذا كان أداؤها في العيش الخلايا وقد لا يترجم دائماً إلى الجينات النسخ16،17. في حين أن هذه الأساليب هامة لدراسة مسارات المنبع لتوصيل الإشارة، يوفر نظام مراسل إتش منظورا فريداً في TGF-β/Smad3 الإشارات في الخلايا الفردية فيما يتعلق بالوظيفة البيولوجية.
إلى حد كبير، لدينا أسلوب يوفر طريقة حساسة واستنساخه في فيفو الكشف عن مسار الإشارات TGF-β/Smad3 في الوقت الحقيقي أثناء تطور الورم والعلاج. شبيه لوسيفراس مستقرة التقليدية في فيفو التصوير، الكشف عن الإشارات TGF-β/Smad3 داخل الماوس اعتماداً على عدد الخلايا ومستوى نشاط المروج18. بينما يوفر النسيج تحت الجلد التدخل القليل للتحليل، سوف يقلل زيادة عمق الخلايا حساسية الكشف عن إشارة. من الممكن توسيع نطاق الأسلوب للاستخدام في أجهزة أخرى، مثل الرئة والعظام، وغيرها من أنواع السرطان؛ ومع ذلك، ينصح الإشارات الأمثل أو السابقين فيفو تصوير تحقيقا للحساسية اللازمة لنموذج سرطان للفائدة.
فائدة إضافية لاستخدام نظام مراسل إتش أن تطبيقه من المرجح أن توسيع نطاق تحليل مسارات إشارات متعددة في نفس الوقت في الخلايا الحية. وفي الشكل 2 ألف، أثبتنا أن جمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا يمكن أن تكون ترانسدوسيد مع ناقلات منفصلة إتش 2، CMV-بروتينات فلورية خضراء وتوم كاجا. يمكن توسيع هذا النظام المزدوج-العدوى لتقرير اثنين مسارات إشارات مختلفة عن طريق البروتينات مراسل الأسفار والصحفيين لوسيفراس (باستخدام البروتينات مراسل لوسيفراس اليراع وجواسيا). وقد حققت لدينا مختبر إشارات متزامنة من مسارات الإشارات BMP/Smad1 و TGF-β/Smad3 في عدد من خطوط الخلايا الحية السرطان (البيانات لا تظهر).
نظم مراسل إتش توفر طريقة سهلة ومريحة لتصوير الخلايا الحية لمسار الإشارات TGF-β/سمد على حد سواء في المختبر و في فيفو. هذا النظام مزايا متميزة أكثر من غيرها من نظم مراسل استخداماً. أولاً، ترد ناقلات إتش أن يكون من بين أعلى كفاءة توصيل الفيروسية، يجعلها نظام أمثل لخطوط الخلايا التي يصعب على ترانسدوسي19،20،،من2122. بالإضافة إلى ذلك مع التطورات الحالية في تكنولوجيات الفيروسية، يمكن أن تتولد عن طريق إزالة معظم الجينوم الفيروسي مما يسمح لزيادة قدرة الحمض النووي خارجية23ناقلات إتش 'جبان'. بالمقارنة مع نظم إيصالها غير الفيروسية، تمثل ناقلات إتش أحد تطبيقات فعالة من حيث التكلفة وسريعة وسهلة لتوصيل الخلية التي ينتج عنها أكبر بكثير التسليم كفاءة19،20،21 ،22.
هذا البروتوكول يستخدم نظام تعبير إتش من الجيل الثاني، وغير كفء النسخ المتماثل في خلايا الثدييات التي لا تعبر عن البروتينات E1a و E1b، تقليل مخاطر السلامة البيولوجية24. ومع ذلك، ترانسدوسي هذه تعزيز ميزات السلامة الأحيائية، إتش جزيئات يمكن أن تزال بالرغم من خلايا الإنسان الأولية بكفاءة عالية25،26. ينصح الولايات المتحدة مستوى السلامة الأحيائية 2 والاحتواء من ناقلات أدينوفيرال عند معالجة والتخلص من إتش المعدات الملوثة. يمكن أن يؤدي التضخيم على نطاق واسع من إتش في الخلايا HEK293A جيل نادرة من النسخ المتماثل المختصة "البرية من نوع" إتش27. وينبغي إجراء فحص PCR لتحديد التلوث البرية من نوع27.
إتش غير كفء النسخ المتماثل ناقلات عابرة في التعبير ولا تدمج مع المضيف الحمض الخلوي الصبغي20،21. من المستحسن أن تحدد المجرب الاستقرار في التعبير عن البروتين مراسل عند استخدام نظام مراسل إتش لتأكيد صحة التجارب الطويلة الأجل. وقت التعبير الموجه إتش داخل خلية متناسباً مع الوقت شعبة الخلية والفيروسية موي. لضمان النتائج استنساخه، من الأهمية بمكان أن عيار الفيروسية مصممة بدقة لكل دفعة الفيروسية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن ينتج كميات مفرطة في الارتفاع من إتش الآثار السامة للخلايا أو سيتوباثيك، ومن المهم أن موي أمثل يتحدد تجريبيا لكل خلية في صف المستخدمة لضمان الحصول على أفضل النتائج. علاوة على ذلك، يمكن أن تحدث في فيفو استخدام ناقلات إتش الاستجابات المناعية؛ حيث الاستجابة المناعية غير المراقبة الأولية للتجربة، ينصح الحيوانات الخطر المناعي20،21. مراقبة نوعية إضافية مطلوب عند استخدام ناقلات أدينوفيرال للاستجابات المناعية المستهدفة، على الرغم من أن قد تم التحقق من صحة استخدام إتش adjuvant للقاح العلاجات28،29.
يمكن استخدام نظام مراسل إتش في مجموعة واسعة نطاق من خطوط الخلايا الأولية ومثقف على حد سواء تقسيم وعدم تقسيم الطبيعة20،22. باستخدام نظام مراسل إتش، حققنا معدلات الإصابة بنسبة 100% في عدد من خطوط خلايا السرطان بما في ذلك المخ، والثدي، القولون والمستقيم كخلايا تنتجها الخلايا الليفية الجنينية الماوس الأساسي (MEF) والكلى الكلاب الظهارية (مدك) جيدا. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تعديل ناقلات أدينوفيرال كذلك زيادة التقارب لمستقبلات خلية من نوع محدد، توفير جهاز تحسين الاستهداف وفعالية لتوصيل30،31.
ويمكن توسيع تطبيقات هذا الأسلوب إلى مسارات الإشارات والمضيفين خلية أخرى. وتشمل المزايا الرئيسية للنظام أدينوفيرال مراسل توصيل رخيصة وعالية الفعالية وسريعة الإعداد التجريبية والافتقار إلى التكامل مع المضيف الحمض الخلوي الصبغي21،32. يمكن تطبيق هذا الأسلوب بالعديد من الاختبارات الحالية و في فيفو النماذج، بما في ذلك تقييم العلاجات المستهدفة الجديدة33. ونأمل أن استخدام هذا الأسلوب سوف يعزز فهمنا للعلاقة بين إشارات المسارات والعمليات البيولوجية، مما يؤدي إلى الاكتشافات البيولوجية الجديدة وتطوير علاجات جديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
واضعي التقرير لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل منح مقدمة من "الوطنية للصحة" ومجلس البحوث الطبية (NHMRC) لبعض ح. تمبو مستلم "جائزة أستراليا العليا" من "الحكومة الأسترالية" و "أن هندرسون منحة دراسية" أعلى حتى من "الأسترالية الروتاري الصحة" في شريك مع منظمة الروتاري تيمبليستووي وتناول العشاء لعلاج.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | ThermoFisher | 1881024 | Warm in 37 °C waterbath before use |
| Foetal Bovine Serum | Scientifix Life | FBS500-S | Heat inactivated before use |
| Recombinant Human TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21 | Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL |
| Hoechst-33258 | Tocris Bioscience | 5117 | Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL |
| Luciferase Reporter Assay Kit | Promega | 197897 | Dilute 5x in PBS before use |
| Luminometer | Promega | 9100-002 | |
| Phase contrast fluorescence microscopy | OLYMPUS | IX50 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810 R | |
| VivoGl Luciferin | Promega | P1041 | |
| IVIS Lumina III In Vivo Imaging System | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | ThermoFisher | 15400-054 | Diltue to 0.05% (1x) in PBS |
| Cell Culture Lysis 5x Reagent | Promega | E153A | Dilute to 1x in DDW |
| 10% Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| HEK 293A | ThermoFisher | R70507 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | CRM-HTB-26 | |
| PRKDC-SCID | Animal Resources Centre | SCIDF6 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Isoflurane | Zoetis | 26675-46-7 | |
| Ethanol | Chem-supply | EA043-10L-P | |
| Refresh Night Time | Allergan | 1750D | Lubricating Eye Ointment |
| Solution | Composition | ||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M) | ||
| FBS-DMEM | 5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin |
References
- Massague, J., Like, B. Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines. The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).
- Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J. The nuclear import function of Smad2 is masked by SARA and unmasked by TGFbeta-dependent phosphorylation. Nature Cell Biology. 2, 559-562 (2000).
- Massague, J. TGFbeta signaling in context. Nature reviews. Molecular cell biology. 13, 616-630 (2012).
- Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Development. 19, 2783-2810 (2005).
- Blobe, G. C., Schiemann, W. P., Lodish, H. F. Role of transforming growth factor beta in human disease. The New England journal of medicine. , 1350-1358 (2000).
- Zhu, H. J., Burgess, A. W. Regulation of transforming growth factor-beta signaling. Molecular cell biology research communications : MCBRC. 4, 321-330 (2001).
- Massagué, J. TGFβ in Cancer. Cell. 134, 215-230 (2008).
- Luwor, R. B., et al. Single live cell TGF-beta signaling imaging: breast cancer cell motility and migration is driven by sub-populations of cells with dynamic TGF-beta-Smad3 activity. Molecular cancer. 14, 50 (2015).
- Clarke, D. C., Liu, X. Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling. Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).
- Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).
- Luwor, R. B., et al. New reagents for improved in vitro and in vivo examination of TGF-beta signalling. Growth factors. 29, 211-218 (2011).
- Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17, 3091-3100 (1998).
- Luwor, R. B., et al. Targeting Stat3 and Smad7 to restore TGF-beta cytostatic regulation of tumor cells in vitro and in vivo. Oncogene. 32, 2433-2441 (2013).
- Reed, L. J., Muench, H. A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints. American Journal of Epidemiology. 27, 493-497 (1938).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9, 671-675 (2012).
- Dennler, S., Prunier, C., Ferrand, N., Gauthier, J. M., Atfi, A. c-Jun inhibits transforming growth factor beta-mediated transcription by repressing Smad3 transcriptional activity. The Journal of biological chemistry. 275, 28858-28865 (2000).
- Fink, S. P., Mikkola, D., Willson, J. K., Markowitz, S. TGF-beta-induced nuclear localization of Smad2 and Smad3 in Smad4 null cancer cell lines. Oncogene. 22, 1317-1323 (2003).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR J. 49, 103-115 (2008).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4, 43-63 (2017).
- Wang, I. I., Huang, I. I. Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies. Drug Discovery Today. 5, 10-16 (2000).
- Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 5731-5736 (1996).
- Wang, Q., Finer, M. H.
- Durham, H. D., et al. Toxicity of replication-defective adenoviral recombinants in dissociated cultures of nervous tissue. Experimental Neurology. 140, 14-20 (1996).
- MacKenzie, K. L., Hackett, N. R., Crystal, R. G., Moore, M. A. Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture. Blood. 96, 100-108 (2000).
- Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. A. Detection of wild-type contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR. Biotechniques. 18, 444-447 (1995).
- Choi, Y., Chang, J. Viral vectors for vaccine applications. Clinical and Experimental Vaccine Research. 2, 97-105 (2013).
- de Cassan, S. C., et al. The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus. Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).
- Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. T. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. Journal of Virology. 70, 6839-6846 (1996).
- Wickham, T. J., et al. Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins. Journal of Virology. 71, 8221-8229 (1997).
- Smith, F., Jacoby, D., Breakefield, X. O. Virus vectors for gene delivery to the nervous system. Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).
- Zhou, F., et al. Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling. Nature communications. 5, 3388 (2014).
