Summary
여기, 우리는 아 데 노비 루스 기자 시스템을 사용 하 여 하는 TGF-β/Smad3 신호 활동의 라이브 셀 이미징에 대 한 프로토콜을 제시. 이 시스템 실시간 transcriptional 활동을 추적 하 고 두 단일 세포에 생체 외에서 그리고 살아있는 동물에 적용 될 수 있다모델.
Abstract
성장 인자 (TGF-β) β 신호 변환 세포 항상성에 필요한 많은 중요 한 기능을 조절 하 고 암 등 많은 질병에 overexpressed 일반적으로 있다. TGF-β는 강하게 연루 전이에 늦게 단계 암 진행 동안 철새 및 침략 적인 종양 세포의 하위 집합을 활성화. 신호 경로 분석에 대 한 현재 메서드 끝점 모델, 종종 생물 학적 이벤트의 신호 포스트-임시 측정을 시도 하 고 질병의 진보적인 성격을 반영 하지 않습니다에 초점. 여기, 라이브 셀에 transcriptional 활성화를 검색할 수 있는 TGF-β/Smad3 신호 전달 경로 대 한 소설 아 데 노비 루스 기자 시스템 특정을 설명 합니다. 광고 CAGA12-Td-톰 기자를 활용 하 여, 우리 24 시간 시험관내의 MDA-MB-231 셀의 100% 감염 속도 얻을 수 있습니다. 형광 기자의 사용에 살아있는 단일 세포의 영상에 대 한 수 있습니다 transcriptionally 활성 셀의 직접 식별과 실시간. TGF-β와 감염 된 세포의 자극 transcriptionally 활성화 하 고 특정 한 생물학 기능에 관련 된 셀의 하위 집합만 표시 됩니다. 이 이렇게 높은 특이성 및 단일 세포 수준에서 감도 TGF-β 신호 vitro에관련 생물 학적 기능의 이해 향상을 수 있습니다. Smad3 transcriptional 활동 수도 있습니다 보고 vivo에서 에서 응용 프로그램을 통해 실시간으로 광고 CAGA12-루크 기자. 광고-CAGA12-루크 전통적인 안정적 transfected luciferase 셀 라인으로 동일한 방식으로 측정 될 수 있다. Vivo에서 이식 세포의 Smad3 transcriptional 활동 통해 기존의 IVIS 이미징 분석 하 고 종양 진행, TGF-β 신호 통로의 역학에 대 한 독특한 통찰력을 제공 하는 동안 라이브 모니터 수 있습니다. 우리의 프로토콜 설명 라이브 세포 신호 통로의 빠른 높은 처리량 이미징에 대 한 허용 하는 유리 기자 전달 시스템 모두 생체 외에서 그리고 vivo에서. 이 메서드는 이미지를 기반으로 분석 및 기본 생물학 및 치료 개발에 대 한 과민 하 고 재현 가능한 방식으로 선물의 범위를 확장할 수 있습니다.
Introduction
변형 시키는 성장 인자 (TGF-β) β는 heterodimeric 유형 II의 구성 된 복잡 한을 통해 인간 발달에 연루는 필수적인 cytokine 이며 유형 I 수용 체1. 유형 II 수용 체에 바인딩 결과 신규 모집과 인 산화의 유형 내가 차례로 다운스트림 Smad2/3 단백질2,3phosphorylates 수용 체. 이 핵에 translocates 유전자 전사4규제 하는 복잡 한 형성 하 Smad4에 Smad2/3 단백질 바인딩 활성화. 항상성 조건 TGF-β/Smad 신호는 단단히 통제; 그러나, 많은 질병, 신호 통로 폐지 되 고 종종 overexpressed 질병5,,67의 진행 하는 최고의. 최근 연구는 TGF-β 세포 응답은 이기종 및 TGF-β/Smad 활성 세포의 부분 모집단은 시간에 따른 방식으로8,9생물 학적 기능에 대 한 책임을 증명 하고있다. 종종 평균 TGF-β/Smad 효과10을 quantitate만 세포 활동의 스냅샷을 제공 하는 고정된 끝점 분석 실험의 사용을 포함 하는 TGF-β/Smad 신호의 일반적인 세포 분석. 그러나이 방법,, 수 있습니다 정확 하 게 대표 하지 질병의 진행 하는 동안 생리 적인 상태에서 TGF-β/Smad 신호 분자 행동. 이미지 기반 라이브 셀 캡처 공간 및 시간 이해 세포 및 생물 학적 과정의 역동성의 분석.
우리의 목표는 TGF-β/Smad 아 데 노비 루스 기반 시 약을 사용 하 여 신호의 라이브 셀 이미징에 대 한 중요 한 높은 처리 방법을 개발 했다. 여기, 우리 Smad3 CAGA 모티브 바인딩 시퀀스와 luciferase (루크) 또는 Td-토마토 (Td-톰) 리포터 유전자를 표현 하는 아 데 노비 루스 인간 유 방 암 세포 선 MDA-MB-231 감염. Adenoviral 기자 시스템 암 세포 라인에 100% 감염 속도에서 발생할 수 있는 플라스 미드 소개에 대 한 신속 하 고 저렴 한 방법을 제공 합니다. Adenoviral 기자 시스템은 또한 성공적으로 적용 되었습니다 기존의 플라스 미드11transfect 하기 어려운 셀 라인에. 이 프로토콜에서 TGFβ/Smad 신호 통로의 라이브 셀 이미징 달성을 재현할 수 및 비 침범 성 과정 설명 합니다 및 모두 에서 vivo에서 체 외.
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Protocol
모든 동물 실험 동물 윤리 위원회는 멜버른의 대학에 의해 승인 되었다.
참고: 있는 adenoviral에 대 한 순서, 건설 및 세대 프로토콜 벡터 p광고-CMV-Td-톰, p광고-CMV-GFP 와 p광고 CAGA12-뤽/Td-톰 이전 설명된11,12, 13. 모든 벡터를 상업적으로 사용할 수 있습니다.
1. 바이러스 Titer 결정 50% 조직 문화 감염 복용량 (TCID50)를 사용 하 여
- 1 x 106 DMEM + 10 %FBS 미디어 10 ml에서 HEK293A 셀을 준비 합니다.
- 바닥이-96-잘 빠진 셀 문화 접시의 각 음에 세포 현 탁 액의 100 µ L 씨.
- 완전 한 매체에서 바이러스의 1: 100 희석의 1 mL를 준비 합니다. 열 1의 각 음에 희석된 바이러스의 11 µ L를 추가 합니다.
- 1의 최종 희석까지 세포 현 탁 액의 100 µ L와 희석된 바이러스의 11 µ L를 혼합 하 여 96 잘 접시에 직접 직렬 10 희석 수행 x1012 에 도달. 세포는 비 점착이이 단계에서 웰 스 간에 전송 되는 셀의 수 일정 하 게 유지.
- 11 µ L 10의 높은 희석으로 시작 하는 각 열에 각 희석의 플라스틱4. 피 펫 팁을 바이러스 성 입자의 크로스 오버를 제한 하려면 각 희석 바꿉니다.
- 부정적인 통제로 열 12 완전 한 바이러스 무료 미디어의 11 µ L를 추가 합니다.
- 10% CO2와 37 ° C에서 7-10 일 동안 접시를 품 어.
- 현미경을 사용 하 여, cytopathic 또는 세포 독성 효과의 징후를 표시 하는 각 열에는 우물의 수 점수. 감염의 어떤 표시 든 지 있으면 잘 긍정을 고려 하십시오.
- 리드와 Muench (1938) 통계 방법14를 사용 하 여 각 희석에 대 한 긍정적인 우물의 분수를 계산 합니다.
- 비례 거리 (PD)를 사용 하 여 계산: (A-50)/(A-B), A는 위의 또는 50% 비율 응답 및 B는 50% 미만 비율 응답
- TCID50 를 사용 하 여 계산: 10X-PD, 여기서 X는 희석 50% 보다 큰 응답을 주는.
- 다음을 사용 하 여 바이러스 titer 계산: 0.69 / (0.011 x TCID50) PFU/mL
2. 아 데 노비 루스 나 결정
- 씨 1.0-1.5 x 500 μ와 105 MDA-MB-231 셀 DMEM 문화 포함 된 미디어 5% FBS 12의 각 음에 잘 접시 (35% 셀 confluency, 총에서 6 우물).
- 광고-CMV-Td-톰 주식 0, 250, 500, 2500에 필요한 및 다음 수식을 사용 하 여 5000 나의 볼륨 계산: 나 = (볼륨 [μ] PFU/μ x) / 셀 수. 1 x 1010 (PFU/mL), 바이러스 감염의 볼륨의 titer와 광고-CMV-Td-톰 에 대 한 필요한 MOIs 있으며 0, 3.75, 7.5, 37.5, 75 μ 각각.
- 직접 철저 한 혼합과 우물에 바이러스 성 재고를 pipetting 여 섹션 2.2에 광고-CMV-Td-톰 의 계산 볼륨 세포를 감염.
- 24 h에 대 한 10% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
- 우물에서 미디어를 제거 하 고 즉시 5 분 동안 10% 포 르 말린의 500 μ와 셀을 수정.
- 우물에서 포 르 말린을 발음 하 고 PBS의 500 μ와 웰 스를 한 번 씻어.
- 5 분 동안 Hoechst 솔루션의 500 μ와 세포 핵 얼룩.
- Hoechst 솔루션을 제거 하 고 세척 PBS 3 번 500 μ와 우물.
- 이미지 Td 토마토 단백질 및 세포 핵에 형광 현미경 200 배 확대를 사용 하 여 신호. 554에서 Td 토마토 단백질을 자극 및 352에서 Hoechst 염료 nm.
- ImageJ 나 Td 토마토15의 100% 감염에 필요한 작업을 사용 하 여 이미지를 분석 합니다.
3. 듀얼-아 데 노 바이러스 전달 라이브 단일 셀에
- 씨 1.0-1.5 x 500 μ와 105 MDA-MB-231 셀 DMEM 문화 포함 된 미디어 5% FBS 12의 각 음에 잘 접시 (35% 셀 confluency, 총에서 2 웰 스).
- 광고-CMV-GFP 의 75 μ를 가진 세포를 감염 (titer = 5 x 109 PFU/mL) 및 광고 CAGA12-Td-톰 의 7.5 μ (titer = 5 x 1010 PFU/mL)를 100% 감염 양성을 달성할 수 있는 2500만.
- 아 데 노비 루스 감염 직후 또는 TGF-β의 우물 (10 mg/mL 재고 있음, 최종 농도 5 ng/μ) 당 0.25 μ 없이 셀을 취급 합니다.
- 24 h에 대 한 10% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
- 단계 대조 형광 현미경 이미지 라이브 셀입니다. 470 nm와 554에서 Td 토마토 단백질 GFP를 자극 nm.
- 세포를 해결 하 고 얼룩 세포 핵 단계 1.6-1.9에에서 설명 된 대로.
- Td-토마토 단백질 영상과 Hoechst 형광 현미경을 사용 하 여 얼룩. 352에 Hoechst 염료 자극 nm.
- ImageJ를 사용 하 여, GFP와 Td-토마토의 비율15셀을 계산 합니다.
4. 살아있는 단일 세포 신호에 상처 분석 결과 치유
- 씨 4-5 105 MDA-MB-231 셀 1ml x DMEM 문화 포함 된 미디어 FBS는 6의 각 음에 잘 접시 5% (50% 셀 confluency, 총에서 2 웰 스).
- 광고 CAGA12-Td-톰 의 22.5 μ를 가진 세포를 감염 (titer 5 x 1010 PFU/mL, 나 = = 2500).
- 24 h에 대 한 10% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
- 두 개의 교차 라인 P200 피 펫 팁을 사용 하 여 각의 셀 계층에 스크래치.
- 우물에서 오래 된 미디어를 제거 하 고 FBS 미디어 또는 잘 (10mg/mL 재고 있음, 최종 농도 5 ng/μ) 당 TGF-β의 0.5 μ 없이 신선한 5%의 2 개 mL를 바꿉니다.
- 5 분 동안 10% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓고 단계 대조 현미경에 100 배 확대를 사용 하 여 선택한 상처 영역에의 이미지.
- 24 h에 대 한 10% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
- 전에 같은 분야에서 상처 폐쇄의 이미지를 가져가 라.
- 세포를 해결 하 고 단계 1.6-1.9에에서 설명 된 대로 세포 핵 얼룩 상처 영역에 비 상처 영역에 형광 현미경 200 배 확대를 사용 하 여 Td 토마토 신호를 시각화.
- 상처에 ImageJ 소프트웨어15를 사용 하 여 비 상처 영역 Td-토마토 긍정적인 세포의 비율 계량.
5. 생체 외에서 Luciferase 분석 결과
- 3-5 x 5% 포함 된 DMEM 미디어의 1 mL에 104 MDA-MB-231 셀의 셀 서 스 펜 션 준비 FBS.
- 세포 현 탁 액의 2.5 μ와 감염 광고 CAGA12-루크 (titer 5 x 1010 PFU/mL, 나 = = 2500).
- 씨는 96로 감염 된 세포에 3000 셀/100 µ L/잘 잘 플레이트.
- 24 h에 대 한 10% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
- 우물에서 오래 된 미디어를 제거 하 고 신선한 5 %FBS 미디어와 함께 또는 없이 잘 (재고 1 mg/mL, 최종 농도 1 ng/μ) 당 TGF-β의 0.1 μ의 100 µ L를 바꿉니다 및 TGF-β 억제제 잘 (재고 7 mg/mL 당 0.17 μ의 유무에 최종 농도 12 ng/μ) (소설 TGF-β ligand 트랩 단백질, 첸 그 외 여러분, 게시 되지 않은 작업).
- 24 h에 대 한 10% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
- Thaw luciferase 분석 결과 시스템 기판 밖으로 하 고 1 x 셀 문화 세포 시 약 두 배 증류수 (DDW)에서 준비.
- 96 웰 스에서 미디어를 제거 하 고 30 분에 대 한 부드러운 동요와 궤도 셰이 커를 사용 하 여 얼음에 1 x 셀 문화 세포의 용 해 버퍼의 50 μ와 웰 스를 lyse.
- 불투명 luciferase 접시에 각 우물에서 30 μ lysate의 전송 및 실내 온도를 따뜻하게 접시 허용.
- 루미 노 소프트웨어에서 새 프로토콜을 만듭니다. 주입 전후 측정 1 인젝터를 선택 합니다. 1 주입 하기 전에 측정을 설정 지연 측정 및 통합 시간에 대 한 s. 주입 측정 후 설정 주입 볼륨 1의 지연 측정에 40 µ L를 주입 후 5 s s 통합 시간. 확인을 선택 하 여 설정을 확인 합니다.
- DDW로 인젝터 튜브를 놓고 사용 하기 전에 인젝터 튜브 청소 프라임 설정에서 인젝터 1 단추를 클릭 합니다. 다음 DDW와 공기 튜브에서 모든 솔루션을 플러시 인젝터 1의 두 개의 추가 소수 다음 장소에서 인젝터 튜브를 제거 합니다. 인젝터 튜브를 반딧불 기판 및 프라임 기판 준비를 두 번 다시 넣으십시오.
- 루미 노에 예제와 함께 불투명 luciferase 접시를 놓고 소프트웨어에 옵션 을 선택 합니다. 관심의 웰 스를 선택 하 고 적용을 클릭 합니다. Luciferase 신호 측정을 시작 을 누릅니다.
- 측정 완료 되 면 제거 하 고 접시 물으로 린스. 인젝터 관으로 공기와 반딧불 기판 관으로 다시 프라임 인젝터 1로 튜브를 배치 하 여 모든 나머지 기판을 복구 합니다. DDW로 인젝터 튜브를 놓고 두 개의 추가 소수 모든 나머지 기판의 인젝터 튜브 청소를 수행 합니다.
6. 셀 라이브 신호 이미징에 비보에 대 한 준비
- 종양 이식 전에 h 48 175 cm2 플라스 크 (총에서 10 플라스 크)에 2-3 106 MDA-MB-231 셀 배 씨. 셀에 20 mL의 5%를 포함 된 DMEM 미디어 문화 FBS 37 ° c, 10% CO2.
- 24 시간 후, 추가 300 μ의 광고 CAGA12-루크 (titer 5 x 1010 PFU/mL, 나 = = 2500) 각 플라스 크에. 또 다른 24 h에 대 한 문화에 셀을 계속.
- 이식의 날, 오래 된 미디어를 제거 하 고 한 번 20 mL PBS, pH 7.4의와 아 데 노 바이러스 감염 세포를 씻어. 플라스 크에 0.05% 트립 신-EDTA의 2 개 mL를 추가 하 고 모든 플라스 크의 표면에 트립 신 수 있도록 약간 플라스 크를 흔들어. 37 ° C, 3 분 동안 10% CO2 배양 기에 있는 플라스 크를 놓습니다.
- FBS-포함 된 DMEM 미디어의 8 mL 플라스 크에 추가 하 여는 트립 신을 끄다. 유리 시 약 병에 모든 셀 정지를 전송 합니다.
- hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 계산 하 고 두 50 ml 원심 분리기 튜브 107 셀 x 4.8 전송.
- 트립 신을 제거 하 여 720 ml 신선한 FBS DMEM 미디어의 셀 resuspend RT 5 분에 대 한 400 x g에서 셀 원심
- 살 균 5 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 160 μ 추가 Matrigel (10% 총 matrigel 중지).
- 얼음에 세포 이식까지 유지.
7. Orthotopic 주입
- 그리고 무게 12 SCID 마우스 제어 및 치료 그룹 (6 쥐/그룹)으로 마우스를 무작위로 할당.
- 무 균 환경을 유지 하기 위하여 살 균 바이오-캐비닛에 주입을 수행 합니다. Anaesthetize 1 L/분 장소 열 패드 마우스의 산소 흐름 속도 2.5-4.5 %isoflurane 사용 하 여 마우스와 눈 연 고 각 막의 손상을 방지 하려면 양쪽 눈에 윤 활의 한 방울을 분배. isoflurane에 연결 코 콘으로 주 둥이 배치 하 여 마 취를 유지 하는 동안 부정사 위치에 열 패드를 마우스를 수정.
- 핀치를 발 끝에 대 한 반응의 부족에 의해 마 취의 성공을 확인 합니다. 1 L/min 산소 주입의 신호에 대 한 1.5-2.5%의 유지 보수 복용량 isoflurane를 줄입니다.
- 80% 에탄올으로 담근 면봉을 사용 하 여 중간 선 양쪽에 제 4 젖꼭지에서 피부를 청소.
- 촉진을 통해 4번째 유 방 지방 패드를 찾아서 더 조직을 노출 하는 지방 패드를 짠 다.
- 잘 아래로 pipetting으로 세포 현 탁 액을 혼합. 부드럽게 27 G 인슐린 주사기로 세포 혼합물의 50 µ L를 발음 하 고 유 방 지방 패드는 마우스의 양쪽에 주입.
- 뚱뚱한 패드의 붓기에 대 한 느낌으로 성공적인 주입을 확인 합니다. 부드럽게 지방 패드를 분리 하 고 감 금 소에 다시 마우스를 놓습니다.
- 새 장을 얻기 위해 의식 그리고 다음 3 일 동안 지주 방에 다시 감 금 소를 배치 마우스 수 있도록 적어도 30 분 동안 히트 패드에 둡니다.
8. IVIS 이미징
- 생활 이미지 소프트웨어를 엽니다.
- IVIS 시스템 제어판에서 IVIS 시스템 초기화 버튼을 클릭 하 여 초기화 합니다. 온도 기호를 녹색 밝혀 졌 때까지 기다립니다.
- 컨트롤 패널에서 Luminescent 이미징 모드를 선택 합니다.
- Isoflurane 마 취 약 실 및 IVIS 시스템을 켭니다.
- 1 L/min 산소 2.5-4.5 %isoflurane 사용 하 여 쥐를 anaesthetize. Anaesthetized, 유지 보수에 대 한 1.5-2.5%에서 isoflurane 설정. 복 (i.p.) 주입에 의해 쥐로 D-소의 150 밀리 그램/kg 체중을 주사.
- IVIS 시스템으로 마우스를 즉시 전송, 온도 제어 이미징 플랫폼에 그들을 배치 하 고 원뿔에 그들의 코를 장소.
- 컨트롤 패널에서 시퀀스 설정 버튼 클릭 하 고 중간 Binning선택.
- 다음과 같이 이미지 노출 시간 설정: 10 s, 20 s, 30 s, 60 s, 그리고 120 s. 시작 소 주사 후 약 3 분 영상 신호를 시작 될 때까지 이미지를 계속 (일반적으로 약 20 분 걸릴 것 이다).
- 코 통해 isoflurane 마 취를 유지 하면서 IVIS에서 쥐를 제거 하 고 50 µ L PBS 또는 50 µ L TGF-β 신호 전달 억제제 (50 μ g/종양) 종양 내 주입을 통해 마우스를 치료.
- 장에 다시 쥐를 넣고 30 분 이상 열 패드에 그들을 두고. 다음 지주 방에 케이지를 놓습니다.
- IVIS 치료 다음 날 위에서 설명한 절차를 이미지를 반복 합니다.
9. 데이터 분석
- 오픈 생활 이미지 소프트웨어에 파일을 저장.
- 보기 를 사용 하 여 이미지 정보를 찾기 | 이미지 정보입니다.
- 같은 노출 시간과 비슷한 시간 포인트에서 촬영 한 사진을 선택 합니다. 그룹으로 사진을 로드 합니다.
- 강도 정상화 이미지 조정 에서 개별 상자 선택을 취소 합니다.
- 강도 분석을 광자 모드를 선택 합니다. 투자 수익 도구에 관심 영역 (ROI) 버튼을 선택 하 여 신호 강도 수량화 합니다.
- 발광 신호를 포함 하는 지역에 투자 수익 원을 드래그 하 고 신호 강도 얻으려고 측정 버튼을 클릭.
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Representative Results
단일 세포 생체 외에서 이미징 라이브
정확 하 게 평가 아 데 노비 루스 기반 시 약을 사용 하 여 단일 세포에서 TGF-β/Smad 신호의 활성화, 그것은 먼저는 최적의 다양성의 감염 (MOI) 각 셀 라인을 결정 하는 것이 중요. 최적의 나 셀의 100%는 아니 현재 cytopathic 또는 세포 독성 효과 adenoviral 감염에 대 한 긍정적인 결정 됩니다. 이 결정, 우리는 긍정적인 감염의 감 적으로 constitutively 활성 광고-CMV-Td-톰 기자를 사용 합니다. 아 데 노 바이러스 감염 세포의 비율이 나 의존 하는 방식으로 0에서 5000 나에 증가 되었다. 2500만에서 MDA-MB-231 셀 (그림 1A, 1B)에 100 %Td-톰 식을 관찰합니다. 픽셀 강도/셀도 나, 향상 된 감도 및 검출 transcriptional 출력 (그림 1C)의 제공으로 증가 했다. 따라서, 일 2, 500의 나 어디 셀에 동시에 광고-CMV-GFP (세포 감염에 대 한 긍정적인 제어 역임)와 광고 CAGA12-Td-톰 감염 했다 이중 감염을 수행 하기 위해 사용 되었다. 단일 셀 Td-톰 식 라이브와 고정 셀에 셀에 걸쳐 TGF-β/Smad3 전사의 이기종 활성화를 나타내는 다양 한 수준의 제공. (그림 2A, 2B). MDA-MB-231 셀 셀의 26 %TGF-β의 자극, TGF-β 치료 (그림 2C) 없이 0% 양성에 비해 후 감지 TGF-β/Smad3 transcriptional 활동 24 시간을 표시 하는 약만 GFP 식이 제시의 100%. 사용 하 여 아 데 노비 루스 기반 시 약 생물학 과정 동안 TGF-β/Smad3 transcriptional 활동을 조사, MDA-MB-231 셀 광고 CAGA12-Td-톰 2500 나 감염 되었고 분석 결과 치유 하는 상처를 받게. 감염 된 MDA-MB-231 세포 전시 일반 마이그레이션 동작 및 셀 5 ng/mL TGF-β 비-TGF-β 치료 세포 (그림 3A)에 비해 향상 된 상처 폐쇄 했다 치료. 특히, 약 62% 상처 지역에 있는 세포는 TGF-β 치료 (그림3B) 후 비 상처 영역 (32%)에서 관찰 보다 상당히 더 높은 양의 TGF-β/Smad3 transcriptional 활동 제시. 따라서, 아 데 노 바이러스 기반 시 약 체 외에서살아있는 단일 세포에서 TGF-β 신호 통로의 이미징에 대 한 그들의 응용 프로그램 확인.
TGF-β 신호 이미징 vivo에서 라이브
광고 CAGA12-뤽 기자의 감도 첫 번째 테스트 했다 생체 외에서 TGF-β의 자극 및 TGF-β 억제제의 존재에 대 한 응답. 감염 된 MDA-MB-231 셀 1 ng/mL TGF-β와 자극 되었다, luciferase 기자 활동을 1,200-fold 기초 치료 MDA-MB-231 수준에 비해 증가. 이 응답은 눈에 띄게 TGF-β 억제제 (그림 4A)의 12 µ g/mL에 의해 차단 됩니다. 광고 CAGA12-루크 시 약 이후에 유 방 종양 orthotopic 이식 동물 모델에서 테스트를 했다. 제어 및 TGF-β 억제제 그룹 시연된 비슷한 luciferase 기자 활동 치료 전에 치료. 그러나, 컨트롤 그룹에 대 한 luciferase 신호 변화 하지 않았다 PBS 치료 후, 마우스 약 3 신호 감소 (그림 4B, 4c)를 보여주었다 TGF-β 억제제로 치료 하는 반면. 이러한 결과의 TGF-β 신호 활동에서 vivo에서 동물 희생을 위한 필요 없이 라이브 실시간 모니터링에 대 한 가능성을 보여 줍니다.
그림 1입니다. 아 데 노비 루스 기반 시 약의 나의 결정. MDA-MB-231 셀 광고-CMV-Td-톰 다른 나에 감염 되었고 12 우물 격판덮개로 시드. 감염 후 24 h, 셀 고정 하 고 핵 Hoechst에 의해 스테인드. (A) 이미지 Td-톰 긍정적인 세포 (빨간색)와 핵 (파란색)을 시각화 하 게 되었고 ImageJ로 계량. (B) 비율의 Td-톰 긍정적인 세포. (C) Td-톰 픽셀 강도/셀 배경으로 정규화. 이러한 수치는 최소 3 독립적인 실험의 대표. 표시 된 데이터는 triplicates ± sd. 규모의 바 = 50 µ m (200 X). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 듀얼에 대 한 단일 셀 이미징. 광고-CMV-GFP 와 나 (2500)에서 광고 CAGA12-Td-톰 감염 그리고 12 우물 격판덮개로 시드 MDA-MB-231 셀 듀얼 했다. 24 시간 후 감염, 세포 치료 5 ng/mL TGF-β의 유무에 관계 없이. (A) 치료 후 h 24, GFP 긍정적인 (녹색) 및 Td-톰 긍정적인 (빨간) 세포를 시각화 하는 이미지가 포함 된 셀 라이브 했다. 셀 다음 고정 하 고 정량화에 대 한 Hoechst 여 핵 스테인드. (B) 이미지 시각화 GFP 긍정적인 (녹색), Td-톰 긍정적인 (빨간) 세포와 핵 (파란색)을 찍은 사진. (C)는 GFP 또는 Td-톰 긍정적인 세포 ImageJ로 계량 했다 고 긍정적인 세포의 비율을 계산 했다. 이러한 수치는 최소 3 독립적인 실험의 대표. 표시 된 데이터는 triplicates ± sd. 통계 의미 스튜던트 t-검정에 의해 결정 되었다 (* * * p ≤0.0001). 눈금 막대 50 µ m (200 X)를 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 세포 이동 촉진 라이브 셀 TGF-β 신호. MDA-MB-231 셀 광고 CAGA12-Td-톰 나 (2500)에서 감염 되었고 6 웰 플레이트에 시드. 감염 후 24 h, 세포를 상처를 만드는 P200 피 펫 팁을 사용 하 여 긁힌 했다 및 미디어 교체 없이 5 ng/mL TGF-β. 또 다른 24 h 후 셀 고정 하 고 시각적 표현을 위한 Hoechst 여 핵 스테인드. (A) 상처 폐쇄, 규모의 명암 단계 바 = 100 µ m (X 100). (B) Td-톰 긍정적인 (빨간) 세포와 핵 (파란색). 눈금 막대 50 µ m (200 X) = (C) Td-톰 긍정적인 세포 ImageJ로 계량 했다 고 긍정적인 세포의 비율 계산 했습니다. 이러한 수치는 최소 3 독립적인 실험의 대표. 표시 된 데이터는 triplicates ± sd. 통계 의미 스튜던트 t-검정에 의해 결정 되었다 (* * * p ≤0.0001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. Vivo에서 TGF-β 신호 영상 라이브. (A) MDA-MB-231 세포 감염 되었다 광고 CAGA12-루크 고 다음 24 h에 대 한 96 웰 플레이트에 시드. 그 후, 세포 치료 없이 1 ng/mL TGF-β는 존재 또는 부재에 12 µ g/mL TGF-β 억제제의 하룻밤. 전체 세포 lysate luciferase 활동을 기반으로 측정 했다. Luciferase 활동 유도 치료 제어 표준화의 배도 제시 했다. 표시 된 데이터는 triplicates ± sd (B). MDA-MB-231 세포 감염 되었다 광고 CAGA12-루크 이식 하기 전에 24 시간. 셀은 SCID 마우스의 양쪽에서 유 방 지방 패드에 이식 했다. 72 h 후, 이미징 IVIS (PBS 제어 그룹) 및 50 µ g/종양 TGF-β 억제제 치료 그룹에 대 한 24 시간 처리 전후에 수행 되었다. (C) 광자 플럭스 생활 이미지 소프트웨어 계량 했다. 표시 된 데이터는 각 치료 그룹 (n = 12) ± sd. 통계 의미 스튜던트 t-검정에 의해 결정 되었다 (* * p ≤0.01 * * * p ≤0.0001). p/s 참조 광자/미 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
TGF-β/Smad3 단일 라이브 셀에 신호의 실시간 이미징에 대 한 수 있도록 기술을 개발 했습니다. 이 새로운 방법을 사용 하 여, 우리는 이전 확인 셀의 하위 인구 동적 TGF-β/Smad3 transcriptional 활동 향상 된 내 습 및 마이그레이션8에 연결. 이 방법은 Smad3 인 산화의 서쪽 오 점 등 TGF-β 신호에 대 한 전통적인 분석 실험에 개선 및 TGF-β는이 포착 하 여 유전자 발현을 대상 TGF-β/Smad3 종양 인구 내의 신호 및 강조의 단일 세포 생물학의 중요성입니다. 또한, 시간이 소모 및 비싼 핵 전 좌 수와 같은 단일 셀 이미징의 대체 방법에서 수행 하는 경우 라이브 세포와 유전자 전사16,17에 항상 번역 하지 않을 수 있습니다. 이러한 메서드는 신호 변환의 업스트림 경로 검사 하는 것이 중요, 아 데 노비 루스 기자 시스템 생물학 기능에 관하여 개별 셀에서 TGF-β/Smad3 신호에 독특한 관점을 제공 합니다.
크게, 우리의 방법에서 TGF-β/Smad3 신호 통로의 비보에 탐지에 대 한 과민 하 고 재현할 수 메서드를 제공 합니다 실시간 종양 진행 및 치료 하는 동안. 마찬가지로 전통적인 안정 luciferase vivo에서 화상 진 찰, 마우스 내 TGF-β/Smad3 신호 탐지 세포의 수와 발기인 활동18의 수준에 따라 달라 집니다. 피하 조직 분석에 대 한 작은 간섭 제공, 세포의 증가 깊이 신호 검출의 감도 줄일 것입니다. 그것은 다른 기관, 폐와 뼈, 등 다른 암;에 사용 하기 위해 메서드를 확장 수 그러나, 신호 최적화 또는 비보 전 영상 관심의 암 모델에 필요한 감도 달성 하기 위해 좋습니다.
아 데 노비 루스 기자 시스템을 사용 하 여 추가 혜택의 응용 프로그램 라이브 셀에 동시에 여러 신호 통로의 분석을 확장 하는 것입니다. 그림 2A, 우리 MDA-MB-231 셀 2 별도 아 데 노 바이러스 벡터, CMV GFP와 CAGA 톰으로 불리고 될 수 있는 시연 했다. 이 듀얼 감염 시스템 보고 형광 기자 단백질 및 luciferase 기자 (반딧불과 Guassia luciferase 기자 단백질을 사용 하 여)를 통해 두 개의 서로 다른 신호 통로를 더 확장할 수 있습니다. 우리의 실험실 (데이터 표시 되지 않음) 라이브 암 세포 선의 수에 BMP/Smad1 및 TGF-β/Smad3 신호 통로의 동시 신호를 달성 했다.
아 데 노비 루스 기자 시스템 TGF-β/Smad 신호 통로의 라이브 셀 이미징에 대 한 쉽고 편리한 방법을 모두 제공 생체 외에서 그리고 vivo에서. 이 시스템에는 다른 일반적으로 사용 되 기자 시스템에 비해 뚜렷한 장점이 있습니다. 첫째, 아 데 노 바이러스 벡터는 그들에 게19,20,,2122transduce 하기 어려운 세포 라인에 대 한 최적의 시스템을 만들기 최고의 바이러스 성 변환 효능 들을 보고 됩니다. 또한 바이러스 성 기술에 있는 현재 전진으로 증가 외 인 DNA 용량23에 대 한 허용 하는 바이러스 성 게놈의 대부분을 제거 하 여 'gutless' 아 데 노 바이러스 벡터를 생성할 수 있습니다. 비 바이러스 성 전달 시스템에 비해 아 데 노 바이러스 벡터 훨씬 더 큰 배송 효율19,20,21 셀 변환에 대 한 비용, 신속 하 고 쉽게 응용 프로그램을 나타내는 ,22.
이 프로토콜 사용 하 여 복제 무능 2 세대 아 데 노비 루스 식 시스템 E1a와 E1b 단백질을 표현 하지 않는 포유류 세포, 최소화 biosafety 위험24. 그러나, 이러한 향상 된 biosafety 기능, 아 데 노 바이러스 입자 수에 높은 효능25,26기본 인간 세포 transduce. 미국 Biosafety 수준 2와 견제 adenoviral 벡터의 처리 및 아 데 노 바이러스의 폐기 장비를 오염 할 때 좋습니다. HEK293A 세포에 아 데 노비 루스의 대규모 확대 복제 유능한 "야생-타입" 아 데 노비 루스27의 드문 발생 될 수 있습니다. PCR 검사는 야생-타입 오염27를 식별 하기 위해 수행 되어야 한다.
복제 무능 아 데 노 바이러스 벡터 식에서 과도 하 고 호스트 DNA20,21와 통합 하지 않습니다. 아 데 노비 루스 기자 시스템을 사용 하 여 장기 실험의 유효성을 확인 하는 실험 식 그들의 기자 단백질의 안정성을 식별 하는 것이 좋습니다. 셀 내에서 아 데 노 바이러스 벡터의 식 시간 세포와 바이러스 방어의 분할 시간에 비례 이다. 재현 가능한 결과 보장 하기 위해, 그것은 중요 바이러스 titer 바이러스 성 각 일괄 처리에 대 한 정확 하 게 결정 됩니다. 또한, 지나치게 높은 볼륨은 아 데 노 바이러스의 세포 독성 또는 cytopathic 효과 귀 착될 수 있다 그리고 그것은 중요 한 최상의 결과 보장 하기 위해 사용 되는 최적의 나 줄지어 각 셀에 대 한 경험적으로 결정 됩니다. 또한, vivo에서 아 데 노 바이러스 벡터의 사용 면역 반응;을 일으킬 수 있다 어디 면역 반응 실험의 기본 관측 되지 않습니다 면역-손상 된 동물20,21권장 됩니다. 추가 품질 관리는 백신 치료28,29에 보조로는 아 데 노 바이러스를 사용 하 여 검증 되었습니다 비록 adenoviral 벡터 대상 면역 반응를 사용 하는 경우 필요 합니다.
아 데 노비 루스 기자 시스템 모두를 분할 하 고 분할 비의 기본 및 교양 셀 라인의 광범위 한 범위에 사용할 수 있습니다 자연20,22. 아 데 노비 루스 기자 시스템을 사용 하 여, 우리는 뇌를 포함 한 암 세포 선의 수에 100% 감염 속도 달성, 유 방, 잘 기본 마우스 Embryological 섬유 아 세포 (MEF) 및 개 신장 상피 (MDCK) 세포로 대 장. 또한, adenoviral 벡터 제공 향상 된 기관 대상으로 효능 변환30,31셀 형 특정 수용 체에 대 한 선호도 증가를 더 수정할 수 있습니다.
이 방법의 응용 프로그램은 다른 신호 통로 셀 호스트를 확장할 수 있습니다. Adenoviral 기자 시스템의 주요 이점에는 싸구려, 높은 변환 효율, 빠른 실험 설치 및 호스트 DNA21,32와 통합의 부족 포함 됩니다. 이 방법은 많은 현재 분석 실험을 vivo에서 , 포함 한 모델의 새로운 타겟된 치료제33평가에 적용할 수 있습니다. 우리는이 기술 사용 하 여 신호 통로 및 새로운 생물학적 발견과 새로운 치료법의 개발을 선도 하는 생물 학적 과정 사이 관계의 우리의 이해를 향상 시킬 것입니다 바랍니다.
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Disclosures
저자는 충돌의 관심을 보고.
Acknowledgments
이 작품은 H JZ를 국가 건강 및 의료 연구 위원회 (NHMRC)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. TMBW는 Templestowe 로타리와 치료에 대 한 식사 파트너에 호주 정부에서 오스트레일리아 대학원 포상 및 호주 로타리 건강에서 앤 헨 더 슨 최고 최대 장학금 받는 사람입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | ThermoFisher | 1881024 | Warm in 37 °C waterbath before use |
| Foetal Bovine Serum | Scientifix Life | FBS500-S | Heat inactivated before use |
| Recombinant Human TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21 | Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL |
| Hoechst-33258 | Tocris Bioscience | 5117 | Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL |
| Luciferase Reporter Assay Kit | Promega | 197897 | Dilute 5x in PBS before use |
| Luminometer | Promega | 9100-002 | |
| Phase contrast fluorescence microscopy | OLYMPUS | IX50 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810 R | |
| VivoGl Luciferin | Promega | P1041 | |
| IVIS Lumina III In Vivo Imaging System | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | ThermoFisher | 15400-054 | Diltue to 0.05% (1x) in PBS |
| Cell Culture Lysis 5x Reagent | Promega | E153A | Dilute to 1x in DDW |
| 10% Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| HEK 293A | ThermoFisher | R70507 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | CRM-HTB-26 | |
| PRKDC-SCID | Animal Resources Centre | SCIDF6 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Isoflurane | Zoetis | 26675-46-7 | |
| Ethanol | Chem-supply | EA043-10L-P | |
| Refresh Night Time | Allergan | 1750D | Lubricating Eye Ointment |
| Solution | Composition | ||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M) | ||
| FBS-DMEM | 5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin |
References
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