Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Live celle billeddannelse af den TGF-β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro og In Vivo ved hjælp af en Adenovirus Reporter System

Published: July 30, 2018 doi: 10.3791/57926
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Surgery (RMH), University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for levende celle billeddannelse af TGF-β/Smad3 signaling aktivitet ved hjælp af en adenovirus reporter system. Dette system registrerer transcriptional aktiviteten i realtid og kan anvendes til både enkelt celler in vitro- og i levende dyrmodeller.

Abstract

Omdanne vækst faktor β (TGF-β) signalering regulerer mange vigtige funktioner, der kræves for cellulære homøostase og er almindeligt forekommende overexpressed i mange sygdomme, herunder kræft. TGF-β er stærkt impliceret i metastase i sent stadium kræft progression, aktivere et undersæt af vandrende og invasive tumorceller. Nuværende metoder til signalering pathway analyse fokuserer på slutpunktet modeller, som ofte forsøger at måle signaling post-hoc af hændelsen biologiske og afspejler ikke den progressive karakter af sygdommen. Her viser vi en roman adenovirus reporter system bestemt til TGF-β/Smad3 signalvejen, der kan registrere transcriptional aktivering i levende celler. Udnytte en Ad-CAGA12-Td-Tom reporter, kan vi opnå en 100% infektion sats af MDA-MB-231 celler inden for 24 timer in vitro. Brug af en fluorescerende reporter giver mulighed for billeddannelse af levende enkelt celler i realtid med direkte identifikation af transcriptionally aktive celler. Stimulation af inficerede celler med TGF-β viser kun et undersæt af celler, der transcriptionally aktiv og involveret i specifikke biologiske funktioner. Denne tilgang giver mulighed for høj specificitet og sensitivitet på en enkelt celle plan at øge forståelse af biologiske funktioner relateret til TGF-β signalering i vitro. Smad3 transcriptional aktivitet kan også blive rapporteret i vivo i realtid gennem anvendelse af en Ad-CAGA12- Luc reporter. Ad-CAGA12- Luc kan måles på samme måde som traditionelle stabilt transfekteret luciferase cellelinjer. Smad3 transcriptional aktivitet af celler implanteret i vivo kan analyseres via konventionelle IVIS imaging og overvåges live under tumor progression, giver enestående indsigt i dynamikken i TGF-β signalvejen. Vores protokol beskriver en fordelagtig reporter leveringssystem giver mulighed for hurtig høj overførselshastighed billeddannelse af levende celle signalering veje både in vitro- og in vivo. Denne metode kan udvides til en række billede baseret assays og gaver som en følsom og reproducerbare tilgang til grundlæggende biologi og terapeutisk udvikling.

Introduction

Omdanne vækst faktor β (TGF-β) er en afgørende cytokin impliceret i den menneskelige udvikling, der signalerer gennem en kompleks bestående af type II heterodimerisk og type I-receptorer1. Bindende skrive II receptor resulterer i rekruttering og fosforylering af typen receptor, hvilket igen phosphorylates downstream Smad2/3 proteiner2,3. Disse aktiveret Smad2/3 proteiner binder sig til Smad4, danner et kompleks, der translocates ind i kernen og regulerer gen transskription4. Homeostatiske betingelser TGF-β/Smad er signalering stramt reguleret; men i mange sygdomme, den signalvejen er dereguleret og ofte overexpressed fører til progression af sygdommen5,6,7. Nylige undersøgelser har vist at cellulære reaktion på TGF-β er heterogene og delpopulationer af TGF-β/Smad aktive celler er ansvarlige for biologiske funktion i en tidsafhængig måde8,9. Fælles cellulære analyse af TGF-β/Smad signalering indebærer anvendelse af fast slutpunkt assays, der giver kun et øjebliksbillede af cellulære aktivitet og ofte kvantificere den gennemsnitlige TGF-β/Smad effekt10. Disse metoder, men kan ikke præcist repræsenterer den molekylære opførsel af TGF-β/Smad signalering i de fysiologiske tilstand i løbet af sygdomsprogression. Image-baseret analyse af levende celler fange dynamikken i cellulære og biologiske processer med begge en rumlig og tidsmæssig forståelse.

Vores mål var at udvikle en følsom høj overførselshastighed metode for levende celle billeddannelse af TGF-β/Smad signalering adenovirus-baserede reagenser. Her, inficeret vi menneskers breast cancer cellelinie MDA-MB-231 med en adenovirus udtryk for Smad3 CAGA motiv bindende sekvens og en luciferase (Luc) eller Td-tomat (Td-Tom) reporter gen. Adenoviral reporter systemer giver en hurtig og billig metode til plasmid introduktion, der kan resultere i en 100% infektion sats i kræft cellelinjer. Adenoviral reporter systemer har også været anvendt med succes til cellelinjer, der er svært at transfect med konventionelle plasmid11. I denne protokol vil vi beskrive en reproducerbar og noninvasive proces for at opnå levende celle billeddannelse af TGFβ/Smad signalvejen både i vivo og in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af University of Melbourne dyr etisk komité.

Bemærk: Den rækkefølge, konstruktion og generation protokol for den adenoviral vektorer pAnnonce-CMV-Td-Tom, pAnnonce-CMV-normal god landbrugspraksis og pAd-CAGA12- Luc/Td-Tom har været tidligere beskrevet11,12, 13. Alle vektorer er kommercielt tilgængelige.

1. virus Titer bestemmelse ved hjælp af 50% vævskultur infektiøse dosis (TCID50)

  1. Forberede 1 x 106 HEK293A celler i 10 mL af DMEM + 10% FBS medier.
  2. Seed 100 µL af cellesuspension til hver brønd med en 96-godt flad bund celle kultur plade.
  3. Forberede 1 mL af en 1: 100 af virus bestand i komplet medium. Tilføje 11 µL fortyndet virus til hver brønd i kolonne 1.
  4. Udføre seriel 10-fold fortyndinger direkte i 96 godt pladen ved at blande 11 µL fortyndet virus med 100 µL af cellesuspension indtil en endelige fortynding af 1 x1012 er nået. Selv om celler er ikke-tilhænger i denne fase, antallet af celler, der overføres mellem wells forbliver konstant.
  5. Afpipetteres 11 µL af hver fortynding i hver kolonne, begyndende med den højeste fortynding af 104. Erstatte pipette tips med hver fortynding at begrænse cross-over af viruspartikler.
  6. Tilføj 11 µL af virus-fri komplet media til kolonne 12 som en negativ kontrol.
  7. Inkuber pladen i 7-10 dage ved 37 ° C med 10% CO2.
  8. Ved hjælp af et mikroskop, scor antallet brønde i hver kolonne viser tegn på cytopatisk eller cytotoksiske virkninger. Overvej et godt positivt, hvis nogen tegn på infektion er til stede.
  9. Beregne brøkdel af positive brønde for hver fortynding ved hjælp af Reed og Muench (1938) statistiske metode14.
  10. Beregne proportional afstand (PD) ved hjælp af: (A-50)/(A-B), hvor A er den procentdel svar ovenfor eller lig med 50% og B er det procentvise svar under 50%.
  11. Beregne TCID50 ved hjælp af: 10X-PD, hvor X er fortyndingen, giver et svar, der er større end 50%.
  12. Beregne viral titer fra ved hjælp af følgende: 0,69 / (0.011 x TCID50) PFU/mL

2. adenovirus MOI bestemmelse

  1. Frø 1,0-1,5 x 105 MDA-MB-231 celler med 500 μl af DMEM kultur medier indeholdende 5% FBS i hver brønd med en 12 godt plade (35% celle confluency, 6 wells i alt).
  2. Beregne mængden af Annonce-CMV-Td-Tom lager kræves til 0, 250, 500, 2500 og 5000 MOI benytter næste formel: MOI = (volumen [μL] x PFU/μL) / antallet af celler. For Ad-CMV-Td-Tom med en titer på 1 x 1010 (PFU/mL), mængden af virusinfektion henholdsvis kræves MOIs 0, 3,75, 7,5, 37,5, og 75 μl.
  3. Inficere celler med de beregnede mængder af Annonce-CMV-Td-Tom i afsnit 2.2 direkte når viral lager der afpipetteres i wells med grundig blanding.
  4. Pladen anbringes i varmeskab ved 37 ° C med 10% CO2 i 24 timer.
  5. Fjerne medier fra brøndene og straks lave cellerne med 500 μl af 10% formalin i 5 min.
  6. Opsug formalin fra brønde og vaske brønde med 500 μL af PBS én gang.
  7. Pletten cellekernen med 500 μL af Hoechst løsning i 5 min.
  8. Fjerne Hoechst løsning og brøndene vaskes med 500 μL af PBS 3 gange.
  9. Billede Td-tomat protein og cellekernen signal ved hjælp af 200 X forstørrelse på et fluorescens mikroskop. Excite Td-tomat protein på 554 nm og Hoechst farvning på 352 nm.
  10. Analysere billeder ved hjælp af ImageJ for at bestemme arbejder MOI kræves for 100% infektion af Td-tomat15.

3. dual-adenovirus transduktion i levende enkelt celler

  1. Frø 1,0-1,5 x 105 MDA-MB-231 celler med 500 μl af DMEM kultur medier indeholdende 5% FBS i hver brønd med en 12 godt plade (35% celle confluency, 2 brønde i alt).
  2. Inficere celler med 75 μl af Annonce-CMV-normal god landbrugspraksis (titer = 5 x 109 PFU/mL) og 7,5 μL af Ad-CAGA12-Td-Tom (titer = 5 x 1010 PFU/mL) at opnå en 2.500 MOI, som kan opnå 100% infektion positivitet.
  3. Behandle celler med eller uden 0,25 μL af TGF-β pr. brønd (10 mg/mL på lager, 5 ng/μl som endelige koncentration) umiddelbart efter adenovirus infektion.
  4. Pladen anbringes i varmeskab ved 37 ° C med 10% CO2 i 24 timer.
  5. Billede levende celler med fase kontrast fluorescens mikroskop. Excite normal god landbrugspraksis på 470 nm og Td-tomat protein på 554 nm.
  6. Fix celler og plette cellekernen som beskrevet i trin 1.6 - 1.9.
  7. Billede Td-tomat protein og Hoechst pletten ved hjælp af et fluorescens mikroskop. Excite Hoechst farvning på 352 nm.
  8. Brug ImageJ, beregne procentdelen af normal god landbrugspraksis og Td-tomat positive celler15.

4. live enkelt celle signalering sårheling i Assay

  1. Frø 4-5 x 105 MDA-MB-231 celler med 1 mL af DMEM kultur medier indeholdende 5% FBS i hver brønd med en 6 godt plade (50% celle confluency, 2 brønde i alt).
  2. Inficere celler med 22,5 μL af Ad-CAGA12-Td-Tom (titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500).
  3. Pladen anbringes i varmeskab ved 37 ° C med 10% CO2 i 24 timer.
  4. Ridse to krydsende linjer på cellelag af hver brønd ved hjælp af en P200 pipette tip.
  5. Fjern de gamle medier fra brønde og erstatte med 2 mL frisk 5% FBS medier med eller uden 0,5 μl af TGF-β pr. brønd (10 mg/mL på lager, 5 ng/μl som endelige koncentration).
  6. Pladen anbringes i varmeskab ved 37 ° C med 10% CO2 til 5 min og tage billeder af udvalgte sår områder ved hjælp af 100 X forstørrelse på en fase-kontrast mikroskop.
  7. Pladen anbringes i varmeskab ved 37 ° C med 10% CO2 i 24 timer.
  8. Tage billeder af sår lukning på de samme områder som før.
  9. Fix cellerne, pletten cellekernen som beskrevet i trin 1.6 - 1.9 og visualisere Td-tomat signal i såret område og ikke-sår område ved hjælp af 200 X forstørrelse på et fluorescens mikroskop.
  10. Kvantificere procentdelen af Td-tomat positive celler i såret og ikke-sår område ved hjælp af ImageJ software15.

5. in Vitro Luciferase Assay

  1. Forberede en cellesuspension af 3-5 x 104 MDA-MB-231 celler i 1 mL af DMEM medier indeholdende 5% FBS.
  2. Inficere cellesuspension med 2,5 μL Ad-CAGA12- Luc (titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500).
  3. Frø de inficerede celler ind i en 96 plade godt på 3.000 celler/100 µL/brønd.
  4. Pladen anbringes i varmeskab ved 37 ° C med 10% CO2 i 24 timer.
  5. Fjern gamle medier fra brønde og erstatte med 100 µL af frisk 5% FBS medier med eller uden 0,1 μL af TGF-β pr. brønd (1 mg/mL på lager, 1 ng/μl som endelige koncentration) og i tilstedeværelse eller fravær af 0,17 μL af TGF-β hæmmer pr. brønd (7 mg/mL på lager 12 ng/μl som endelige koncentration) (en roman TGF-β ligand fælde protein, Chen et al., upubliceret arbejde).
  6. Pladen anbringes i varmeskab ved 37 ° C med 10% CO2 i 24 timer.
  7. Tø luciferase assay systemet Bæremateriale og forberede 1 x celle kultur lysis reagens i dobbelt destilleret vand (DDW).
  8. Fjerne medier fra de 96 brønde og lyse brønde med 50 μL 1 x celle kultur lysisbuffer på is ved hjælp af en orbitalryster med blid agitation i 30 min.
  9. 30 μL af lysate overføres fra hver brønd i en uigennemsigtig luciferase plade og tillade plade at varme til stuetemperatur.
  10. Opret en ny protokol på luminometrisk software. Vælg 1 injektor med målinger før og efter indsprøjtning. Sæt målinger før injektion i 1 s for både forsinkelse i måling og Integration tid. For efter injektion måling, indstille Injektionsvolumen til 40 µL med en forsinkelse i måling af 1 s efter injektion og 5 s Integration tid. Bekræft indstillingerne ved at vælge OK.
  11. Injektor røret anbringes i DDW og klik på knappen injektor 1 under Prime -indstillinger til at rense injektor røret før brug. Næste fjerne injektor røret fra DDW og sted i luft efterfulgt af to yderligere primtal af injektor 1 til at skylle alle løsning fra røret. Injektor røret anbringes i Firefly substrat og igen Prime to gange for at forberede substratet.
  12. Placere uigennemsigtig luciferase pladen med prøverne i luminometrisk og vælge Indstillinger på software. Fremhæve wells af interesse og klik på Anvend. Tryk på Start til at måle luciferase signal.
  13. Når målingerne er komplet, fjerne og skyl pladen med vand. Genoprette eventuelle resterende substrat ind i injektoren rør ved at placere tuben i luften og Prime injektor 1 tilbage til firefly substrat tube. Injektor røret anbringes i DDW og udføre to yderligere primtal for at rense injektor rør af enhver resterende substrat.

6. celle forberedelse til Live Signaling Imaging In Vivo

  1. 48 h før tumor implantation, seed 2-3 x 106 MDA-MB-231 celler i 175 cm2 flasker (10 flasker i alt). Kultur celler i 20 mL af DMEM medier indeholdende 5% FBS ved 37 ° C, 10% CO2.
  2. 24 timer senere, tilsættes 300 μl Ad-CAGA12- Luc (titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500) i hver kolbe. Hold celler i kultur til en anden 24 h.
  3. På dagen for implantation, fjerne de gamle medier og adenovirus inficeret cellerne vaskes en gang med 20 mL PBS, pH 7,4. Der tilsættes 2 mL 0,05% trypsin-EDTA i kolben og Kolben rystes lidt for at tillade trypsin til at dække alle kolbe overflade. Kolben anbringes i til rugemaskine 37 ° C, 10% CO2 i 3 min.
  4. Dæmpning af trypsin ved at tilføje 8 mL FBS-holdige DMEM medier i målekolber. Overføre alle celle suspensioner i en glasflaske reagens.
  5. Tælle celle antallet ved hjælp af en hemocytometer og overføre 4,8 x 107 celler i to 50 ml centrifugeglas.
  6. Der centrifugeres celler ved 400 x g i 5 min på RT for at fjerne trypsin og resuspend celler i 720 mL frisk FBS-DMEM medier.
  7. Overføre celle suspensioner i en steril 5 mL tube og tilføje 160 μL Matrigel (10% total matrigel suspension).
  8. Hold celler på is indtil implantation.

7. Orthotopic Implantation

  1. Vejer 12 SCID mus og tilfældigt tildele mus til kontrol og behandling grupper (6 mus/gruppe).
  2. Udføre implantation i en steril bio-kabinet til at opretholde et sterilt miljø. Anaesthetize musen bruger 2,5-4,5% isofluran med en ilt flow 1 L/min. sted musen på en varme-pad og give afkald på en dråbe smøre øjet salve på begge øjne til at undgå hornhinde skader. Fix musen til at varme pad i en liggende stilling, mens bevare anæstesi ved at placere snuden ind en næsen kegle er tilsluttet isofluran.
  3. Bekræft succes af anæstesi ved manglen reaktion på tå knivspids. Reducere isofluran til en vedligeholdelsesdosis på 1,5-2,5% med 1 L/min ilt for påmindelse om implantation.
  4. Ren hud fra fjerde brystvorten på begge sider med midterlinjen ved hjælp af en vatpind dyppet i 80% ethanol.
  5. Find den 4th brystkirtler fedt pad gennem palpering og klem det fedt pad for at yderligere udsætte væv.
  6. Bland cellesuspension godt af pipettering op og ned. Forsigtigt Aspirér 50 µL af celle blanding ind en 27G insulin sprøjten og injiceres i den mammary fedt pad på begge sider af musen.
  7. Bekræfte en vellykket injektion af fornemmelse for hævelse af det fedt pad. Frigive det fedt pad forsigtigt og placere musen tilbage ind i buret.
  8. Forlade bure på varme pad i mindst 30 min at tillade mus at få bevidsthed og derefter placere burene tilbage i bedrift plads til 3 dage.

8. IVIS Imaging

  1. Åbne Lever billedet software.
  2. Initialisere IVIS system ved at klikke på knappen Initialisere IVIS System på kontrolpanelet. Vent, indtil tegnet temperatur bliver grønt.
  3. Vælg den selvlysende tænkelig tilstand på kontrolpanelet.
  4. Tænd for isofluran anæstesi til kammeret og IVIS system.
  5. Anaesthetize mus ved hjælp af 2,5-4,5% isofluran med 1 L/min ilt. Når bedøvet, indstille isofluran på 1,5-2,5% for vedligeholdelse. Injicere 150 mg/kg legemsvægt af D-luciferin ind i musene ved intraperitoneal (i.p.) injektion.
  6. Straks overføre mus til IVIS system, placere dem på den temperatur-kontrolleret imaging platform og placere deres næse i næsen kegle.
  7. Klik på knappen Sekvens opsætning på kontrolpanelet og vælge Medium udsmidningen.
  8. Oprettet den billeddiagnostiske eksponeringstid som følger: 10 s, 20 s, 30 s, 60 s, og 120 s. Start imaging ca. 3 min. efter luciferin injektion og fortsat billede indtil signalet begynder at falde (normalt vil det tage ca 20 min).
  9. Fjerne mus fra IVIS samtidig opretholde isofluran bedøvelse gennem en næsen kegle og behandle musene med 50 µL PBS eller 50 µL TGF-β signaling inhibitor (50 μg/tumor) via intra-tumor injektion.
  10. Sæt mus tilbage i buret og efterlade dem på varme pad i mindst 30 min. Placer derefter buret tilbage i bedriften værelse.
  11. Gentag IVIS imaging procedure som beskrevet ovenfor dagen efter behandling.

9. dataanalyse

  1. Åbne gemte filer i Levende billede software.
  2. Find billedinformation ved hjælp af Vis | Billedinformation.
  3. Vælg fotos taget på en lignende tidspunkt med den samme eksponeringstid. Indlæse billeder som en gruppe.
  4. Enkelte markeringen i Billedet justeres til at normalisere intensiteten.
  5. Vælg Photon mode til at analysere intensiteten. Kvantificere intensitet af signalet ved at vælge knappen Region af interesse (ROI) i ROI værktøjer.
  6. Træk ROI cirkel til den region, der indeholder en bioluminescerende signalet og klik på knappen foranstaltning at erhverve signal intensitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Live enkelt celle imaging in vitro-

Du kan præcist vurdere aktivering af TGF-β/Smad signalering i enkelte celler ved hjælp af adenovirus baseret reagenser, er det vigtigt at først fastslå den optimale multiplicitet infektion (MOI) for hver cellelinje. Den optimale MOI bestemmes, når 100% af cellerne er positive for adenoviral infektion uden nuværende cytopatisk eller cytotoksiske virkninger. For at finde ud af, brugte vi en constitutively aktiv Annonce-CMV-Td-Tom reporter, der fungerede som en markør for positive infektion. Procentdelen af adenovirus inficerede celler blev øget i et MOI afhængige måde fra 0 til 5.000 MOI. På 2.500 MOI konstaterede vi 100% Td-Tom udtryk i MDA-MB-231 celler (figur 1A, 1B). Pixel intensitet/celle også steget med MOI, giver øget følsomhed og påvisning af transcriptional output (figur 1 c). Derfor blev en arbejdsgruppe MOI af 2.500 brugt til at udføre en dobbelt infektion, hvor celler blev smittet med Ad-CMV-normal god landbrugspraksis (serveres som positiv kontrol for celle infektion) og Ad-CAGA12-Td-Tom samtidigt. Enkelt celler præsenteret varierende niveauer af Td-Tom udtryk angiver heterogene aktivering af TGF-β/Smad3 transskription på tværs af celler i både levende og faste celler. (Figur 2A, 2B). 100% af MDA-MB-231 celler præsenteret med normal god landbrugspraksis udtryk, mens kun omkring 26% af celler vises påviselige TGF-β/Smad3 transcriptional aktivitet 24 h efter TGF-β stimulation, sammenlignet med 0% positivitet uden TGF-β behandling (figur 2 c). Hvis du vil bruge adenovirus baseret reagens for at undersøge TGF-β/Smad3 transcriptional aktivitet under biologiske processer, var MDA-MB-231 celler inficeret med Ad-CAGA12-Td-Tom på 2500 MOI og underkastes en sårheling assay. Inficerede MDA-MB-231 celler udstillet normale migration adfærd og celler behandles med 5 ng/mL TGF-β viste øget sår lukning i forhold til ikke-TGF-β behandlede celler (figur 3A). Især omkring 62% celler i området såret præsenteret positiv TGF-β/Smad3 transcriptional aktivitet, hvilket er betydeligt højere end observeret i ikke-sår område (32%) efter TGF-β behandling (figur3B). Som sådan, godkendt adenovirus-baserede reagenserne deres ansøgning om billeddannelse af TGF-β signalvejen i levende enkelt celle i vitro.

Live TGF-β signalering billedbehandling i vivo

Følsomheden af Ad-CAGA12- Luc reporter var første testet in vitro- svar til TGF-β stimulation og tilstedeværelsen af en TGF-β-hæmmer. Når inficerede MDA-MB-231 celler blev stimuleret med 1 ng/mL TGF-β, luciferase reporter aktivitet øget 1,200-fold i forhold til basal ubehandlet MDA-MB-231 niveauer. Dette svar var bemærkelsesværdigt blokeret af 12 µg/mL af TGF-β inhibitoren (figur 4A). Den Ad-CAGA12- Luc reagens blev efterfølgende afprøvet i en bryst tumor orthotopic implantation dyr model. Både kontrol- og TGF-β-hæmmer behandlede grupper viste lignende luciferase reporter aktivitet før behandling. Men for kontrolgruppen, luciferase signalet ændrede ikke efter PBS behandling, hvorimod mus behandlet med TGF-β hæmmer viste omkring 3-fold signal reduktion (figur 4B, 4 C). Kollektivt, viser disse resultater potentiale for levende og real-time overvågning af TGF-β signaling aktivitet i vivo uden brug af animalsk ofre.

Figure 1
Figur 1. Bestemmelse af MOI adenovirus-baserede reagens. MDA-MB-231 celler blev smittet med Ad-CMV-Td-Tom på forskellige MOI og seedet til en 12 brønde plade. 24 timer efter infektion, celler var faste og nukleare plettet af Hoechst. (A) billederne var taget til at visualisere Td-Tom positive celler (rød) og kerne (blå) og kvantificeres ved ImageJ. (B) procent af Td-Tom positive celler. (C) Td-Tom pixel intensitet/celle normaliseret til baggrunden. Disse tal er repræsentative for mindst 3 uafhængige forsøg. Data, der vises er middel til tre ± SD. skala bar = 50 µm (200 X). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Enkelt celle tænkelig nemlig dobbelt infektion. MDA-MB-231 celler var dobbelt inficeret med Ad-CMV-normal god landbrugspraksis og Ad-CAGA12-Td-Tom på MOI (2.500) og seedet til en 12 brønde plade. 24 timer efter infektion, celler blev behandlet med eller uden 5 ng/mL TGF-β. (A) 24 timer efter behandling, celler var levende afbildet for at visualisere normal god landbrugspraksis positive (grøn) og Td-Tom positive (rød) celler. Celler blev derefter fast og nukleare plettet af Hoechst for kvantificering. (B) billederne var taget til at visualisere normal god landbrugspraksis positive (grøn), Td-Tom positive (rød) celler og kerne (blå). (C) den normal god landbrugspraksis eller Td-Tom positive celler blev kvantificeres ved ImageJ og procentdelen af positive celler blev beregnet. Disse tal er repræsentative for mindst 3 uafhængige forsøg. Data, der vises er middel til tre ± SD. statistiske betydning var bestemt af Student's t-test (*** p ≤0.0001). Skalalinjen = 50 µm (200 X). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Levende celle TGF-β signalering fremmer celle migration. MDA-MB-231 celler blev smittet med Ad-CAGA12-Td-Tom på MOI (2.500) og seedet på en 6 wells tallerken. 24 timer efter infektion, celler blev ridset med en P200 pipette tip til at oprette et sår og medier erstattet med eller uden 5 ng/mL TGF-β. Efter en anden 24 h, celler var faste og nukleare plettet af Hoechst for visuel repræsentation. (A) fase kontrast sår lukkemekanisme omfang bar = 100 µm (100 X). (B) Td-Tom positive (rød) celler og kerne (blå). Skalalinjen = 50 µm (200 X) (C) Td-Tom positive celler blev kvantificeres ved ImageJ og procentdelen af positive celler blev beregnet. Disse tal er repræsentative for mindst 3 uafhængige forsøg. Data, der vises er middel til tre ± SD. statistiske betydning var bestemt af Student's t-test (*** p ≤0.0001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. In vivo live TGF-β signaling imaging. (A) MDA-MB-231 celler var inficeret med Ad-CAGA12- Luc og derefter seedet til 96 brønde plade i 24 timer. Derefter blev celler behandlet med eller uden 1 ng/mL TGF-β i tilstedeværelse eller fravær af 12 µg/mL TGF-β hæmmer natten over. Luciferase aktiviteten blev målt baseret på hele cellen lysate. Luciferase aktiviteter blev præsenteret som fold af induktion normaliseret til ingen behandling kontrol. Data, der vises er middel til tre ± SD. (B) MDA-MB-231 celler var inficeret med Ad-CAGA12- Luc 24 h før implantation. Celler blev implanteret i Brystkirtlerne fedt pad på begge sider af SCID mus. 72 h senere, IVIS imaging blev udført før og efter 24 timer behandling (PBS for kontrolgruppen) og 50 µg/tumor TGF-β hæmmer til behandling gruppe. (C) Photon flux var kvantificeres ved levende billede software. Data, der vises er middel til hver behandling gruppen (n = 12) ± SD. statistiske betydning var bestemt af Student's t-test (** p ≤0.01, *** p ≤0.0001). p/s: henviser til fotoner/s. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har udviklet en teknik til at give mulighed for real-time imaging af TGF-β/Smad3 signalering i enkelt levende celler. Brug af denne nye metode, har vi tidligere konstateret en delpopulation af celler med dynamisk TGF-β/Smad3 transcriptional aktivitet, der var forbundet med forøget invasion og migration8. Denne metode forbedrer på traditionelle assays til TGF-β signalering, såsom western blotting af Smad3 fosforylering og TGF-β målrettet genekspression, ved at indfange heterogeniteten af TGF-β/Smad3 signalering i befolkningens tumor og fremhæve det betydningen af enkelt cellebiologi. Derudover alternative metoder af enkelt celle imaging som nukleare translokation kan være tidskrævende og dyrt hvis udførte i levende celler og kan ikke altid oversættes til gen transskription16,17. Mens disse metoder er vigtigt at undersøge de opstrøms veje af signaltransduktion, giver adenovirus reporter system et unikt perspektiv på TGF-β/Smad3 signalering i individuelle celler i forbindelse med biologiske funktion.

Betydeligt, vores metode giver en følsom og reproducerbar metode til i vivo påvisning af TGF-β/Smad3 signalvejen i realtid under tumor progression og behandling. Svarende til traditionelle stabil luciferase i vivo billeddannelse, påvisning af TGF-β/Smad3 signalering i musen er afhængig af antallet af celler og niveau af promotor aktivitet18. Mens subkutane væv giver lidt indblanding for analyse, vil øget dybde af celler reducere følsomheden af signal detektion. Det er muligt at udvide metoden til brug i andre organer, såsom lungerne og knogle og andre kræftformer; signal optimering eller ex vivo billeddannelse anbefales dog at opnå følsomhed kræves for kræft model af interesse.

En yderligere fordel ved at anvende adenovirus reporter system er, at dens anvendelse er tilbøjelige til at udvide til analyse af flere signaling veje samtidig i levende celler. I figur 2Aviste vi, at MDA-MB-231 celler kunne være transduced med 2 separate adenovirus vektorer, CMV-normal god landbrugspraksis og CAGA-TOM. Denne dual-infektion system kan udvides yderligere for at rapportere to forskellige signaling veje via både fluorescens reporter proteiner og luciferase journalister (ved hjælp af Firefly og Guassia luciferase reporter proteiner). Vores lab har opnået samtidige signalering af BMP/Smad1 og TGF-β/Smad3 signaling veje i et antal levende kræft cellelinjer (data ikke vist).

Adenovirus reporter systemer giver en nem og bekvem metode for levende celle billeddannelse af TGF-β/Smad signalvejen både in vitro- og i vivo. Dette system har klare fordele frem for andre almindeligt anvendte reporter systemer. For det første, adenovirus vektorer er rapporteret at have blandt de højeste viral transduktion effektivitet, hvilket gør dem en optimal systempræstation til cellelinjer, der er vanskelige at transduce19,20,21,22. Desuden med aktuelle fremskridt i viral teknologier, kan 'gutless' adenovirus vektorer genereres ved at fjerne de fleste af det virale genom giver mulighed for større eksogene DNA kapacitet23. I forhold til ikke-virale leveringssystemer repræsenterer adenovirus vektorer en omkostningseffektiv, hurtig og nem ansøgning om celle transduktion, der resulterer i langt større levering effektivitet19,20,21 ,22.

Denne protokol bruger en anden generation adenovirus udtryk system, som er replikering-inkompetente i pattedyrceller, der ikke udtrykke E1a og E1b proteinerne, minimere biosikkerhed risiko24. Men trods disse forbedrede biosikkerhed funktioner, adenovirus partikler kan stadig transduce primære menneskelige celler med høj effektivitet25,26. Amerikanske biosikkerhed niveau 2 og indeslutning af adenoviral vektorer anbefales når håndtering og bortskaffelse af adenovirus forurenet udstyr. Storstilet forstærkning af adenovirus i HEK293A celler kan resultere i en sjælden generation af replikationskompetente "vildtype" adenovirus27. PCR screening bør udføres for at identificere wild-type forurening27.

Replikering-inkompetente adenovirus vektorer er forbigående i udtryk og integrerer ikke med værten DNA20,21. Det anbefales, at eksperimentatoren at identificere stabilitet i udtryk for deres reporter protein når adenovirus reporter system til at bekræfte gyldigheden af langsigtet eksperimenter. Udtrykket tid af adenovirus vektor i en celle er proportional med division tidspunktet for celle og viral MOI. For at sikre reproducerbare resultater, er det kritisk at viral titer bestemmes nøjagtigt for hver viral batch. Derudover alt for store mængder af adenovirus kan resultere i cytotoksiske eller cytopatisk effekt og det er vigtigt, at en optimal MOI empirisk fastsættes for hver celle foret bruges til at sikre bedste resultater. Yderligere, i vivo brug af adenovirus vektorer kan inducere immunrespons; hvor immunrespons er ikke den primære observation af eksperimentet, anbefales immun-kompromitteret dyr20,21. Ekstra kvalitetskontrol er påkrævet, når du bruger de adenoviral vektorer til target immunrespons, selvom brugen af adenovirus er blevet valideret som en adjuvans til vaccinen terapier28,29.

Adenovirus reporter system kan bruges på en bred vifte af primære og kulturperler cellelinjer både dividere og ikke-dividere natur20,22. Ved hjælp af adenovirus reporter system, vi har opnået 100% smittede i en række kræft cellelinjer herunder hjernen, bryst, kolorektal som godt primære mus embryologiske Fibroblast (MEF) og Canine nyre epitel (MDCK) celler. Derudover kan adenoviral vektorer ændres yderligere for at øge affinitet for celletype specifikke receptorer, leverer forbedret orgel målretning og effektivitet for transduktion30,31.

Anvendelser af denne metode kan udvides til andre signaling veje og celle værter. De vigtigste fordele ved adenoviral reporter system omfatter den billige, høj transduktion effektivitet, hurtig eksperimentel opsætning og manglende integration med host DNA21,32. Denne metode kan anvendes til mange aktuelle assays og i vivo modeller, herunder i vurderingen af nye målrettede therapeutics33. Vi håber, at denne teknik vil øge vores forståelse af forholdet mellem signalering veje og biologiske processer, der fører til nye biologiske opdagelser og udvikling af nye behandlingsformer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne rapport ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National sundhed og Medical Research Rådet (NHMRC) til H-JZ. TMBW er en modtager af en Australien Postgraduate Award fra den australske regering og Ann Henderson Top-Up stipendium fra australske Rotary sundhed i partner med Rotary i Virum og Spis efter en kur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM ThermoFisher 1881024 Warm in 37 °C waterbath before use
Foetal Bovine Serum Scientifix Life FBS500-S Heat inactivated before use
Recombinant Human TGF-β1 PEPROTECH 100-21 Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL
Hoechst-33258 Tocris Bioscience 5117 Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL
Luciferase Reporter Assay Kit Promega 197897 Dilute 5x in PBS before use
Luminometer Promega 9100-002
Phase contrast fluorescence microscopy OLYMPUS IX50
Centrifuge eppendorf 5810 R
VivoGl Luciferin Promega P1041
IVIS Lumina III In Vivo Imaging System PerkinElmer CLS136334
0.5% Trypsin-EDTA (10x) ThermoFisher 15400-054 Diltue to 0.05% (1x) in PBS
Cell Culture Lysis 5x Reagent Promega E153A Dilute to 1x in DDW
10% Formalin Sigma-Aldrich F5554-4L
HEK 293A ThermoFisher R70507
MDA-MB-231 ATCC CRM-HTB-26
PRKDC-SCID Animal Resources Centre SCIDF6
Matrigel Corning 354234
Isoflurane Zoetis 26675-46-7
Ethanol Chem-supply EA043-10L-P
Refresh Night Time Allergan 1750D Lubricating Eye Ointment
Solution Composition
Phosphate-Buffered Saline (PBS) NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M)
FBS-DMEM  5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Massague, J., Like, B. Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines. The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).
  2. Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J. The nuclear import function of Smad2 is masked by SARA and unmasked by TGFbeta-dependent phosphorylation. Nature Cell Biology. 2, 559-562 (2000).
  3. Massague, J. TGFbeta signaling in context. Nature reviews. Molecular cell biology. 13, 616-630 (2012).
  4. Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Development. 19, 2783-2810 (2005).
  5. Blobe, G. C., Schiemann, W. P., Lodish, H. F. Role of transforming growth factor beta in human disease. The New England journal of medicine. , 1350-1358 (2000).
  6. Zhu, H. J., Burgess, A. W. Regulation of transforming growth factor-beta signaling. Molecular cell biology research communications : MCBRC. 4, 321-330 (2001).
  7. Massagué, J. TGFβ in Cancer. Cell. 134, 215-230 (2008).
  8. Luwor, R. B., et al. Single live cell TGF-beta signaling imaging: breast cancer cell motility and migration is driven by sub-populations of cells with dynamic TGF-beta-Smad3 activity. Molecular cancer. 14, 50 (2015).
  9. Clarke, D. C., Liu, X. Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling. Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).
  10. Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).
  11. Luwor, R. B., et al. New reagents for improved in vitro and in vivo examination of TGF-beta signalling. Growth factors. 29, 211-218 (2011).
  12. Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17, 3091-3100 (1998).
  13. Luwor, R. B., et al. Targeting Stat3 and Smad7 to restore TGF-beta cytostatic regulation of tumor cells in vitro and in vivo. Oncogene. 32, 2433-2441 (2013).
  14. Reed, L. J., Muench, H. A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints. American Journal of Epidemiology. 27, 493-497 (1938).
  15. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9, 671-675 (2012).
  16. Dennler, S., Prunier, C., Ferrand, N., Gauthier, J. M., Atfi, A. c-Jun inhibits transforming growth factor beta-mediated transcription by repressing Smad3 transcriptional activity. The Journal of biological chemistry. 275, 28858-28865 (2000).
  17. Fink, S. P., Mikkola, D., Willson, J. K., Markowitz, S. TGF-beta-induced nuclear localization of Smad2 and Smad3 in Smad4 null cancer cell lines. Oncogene. 22, 1317-1323 (2003).
  18. Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR J. 49, 103-115 (2008).
  19. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
  20. Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).
  21. Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4, 43-63 (2017).
  22. Wang, I. I., Huang, I. I. Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies. Drug Discovery Today. 5, 10-16 (2000).
  23. Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 5731-5736 (1996).
  24. Wang, Q., Finer, M. H. Second-generation adenovirus vectors. Nature Medicine. 2, 714-716 (1996).
  25. Durham, H. D., et al. Toxicity of replication-defective adenoviral recombinants in dissociated cultures of nervous tissue. Experimental Neurology. 140, 14-20 (1996).
  26. MacKenzie, K. L., Hackett, N. R., Crystal, R. G., Moore, M. A. Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture. Blood. 96, 100-108 (2000).
  27. Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. A. Detection of wild-type contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR. Biotechniques. 18, 444-447 (1995).
  28. Choi, Y., Chang, J. Viral vectors for vaccine applications. Clinical and Experimental Vaccine Research. 2, 97-105 (2013).
  29. de Cassan, S. C., et al. The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus. Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).
  30. Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. T. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. Journal of Virology. 70, 6839-6846 (1996).
  31. Wickham, T. J., et al. Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins. Journal of Virology. 71, 8221-8229 (1997).
  32. Smith, F., Jacoby, D., Breakefield, X. O. Virus vectors for gene delivery to the nervous system. Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).
  33. Zhou, F., et al. Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling. Nature communications. 5, 3388 (2014).

Tags

Kræftforskning sag 137 TGF-β levende celle imaging adenovirus celle signalering breast cancer Smad3 transcriptional aktivering
Live celle billeddannelse af den TGF-β/Smad3 Signaling Pathway <em>In Vitro</em> og <em>In Vivo</em> ved hjælp af en Adenovirus Reporter System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, H., Ware, T. M. B., Iaria, J., … More

Chen, H., Ware, T. M. B., Iaria, J., Zhu, H. J. Live Cell Imaging of the TGF- β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System. J. Vis. Exp. (137), e57926, doi:10.3791/57926 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter