Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Живой клетки изображений TGF-β/Smad3 сигнализируя Pathway In Vitro и In Vivo с помощью системы репортер аденовирус

Published: July 30, 2018 doi: 10.3791/57926
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Surgery (RMH), University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

Здесь мы представляем протокол для живых клеток изображений сигнальной деятельности TGF-β/Smad3 с помощью системы репортер аденовируса. Эта система отслеживает транскрипционный анализ активности в режиме реального времени и может быть применен как отдельные клетки в пробирке и в живых животныхмодели.

Abstract

Преобразование сигнализации фактор роста β (TGF-β) регулирует многие важные функции, необходимые для клеточного гомеостаза и обычно встречаются оверэкспрессировали во многих заболеваний, включая рак. TGF-β сильно вовлечен в метастазов во время поздней стадии рака прогрессии, активация подмножество мигрирующих и инвазивные опухолевых клеток. Текущие методы для сигнализации путь анализа сосредоточены на конечной модели, которые часто пытаются измерить сигнализации пост hoc биологических события и не отражает прогрессивный характер болезни. Здесь мы демонстрируем конкретного системы Роман аденовирус репортер на сигнальный путь TGF-β/Smad3, который может обнаружить transcriptional активации в живых клетках. Использование Ad-CAGA12-Td-том репортер, мы можем достичь 100% заболеваемости MDA-MB-231 клеток в течение 24 ч в пробирке. Использование флуоресцентных репортер позволяет для изображений живой одиночных камер в режиме реального времени с прямой идентификации транскрипционно активных клеток. Стимуляция зараженных клеток с TGF-β отображается только подмножество ячеек, которые транскрипционно активны и участвовать в конкретных биологических функций. Этот подход позволяет высокая специфичность и чувствительность на уровне одной ячейки для улучшения понимания биологических функций, связанных с TGF-β сигнализации, в пробирке. Smad3, транскрипционный анализ деятельности также может быть сообщено в естественных условиях в режиме реального времени через применение Ad-CAGA12- Люк репортер. Ad-CAGA12- Люк может быть измерена в так же, как традиционные стабильно transfected Люцифераза клеточных линий. Smad3 транскрипционный анализ активности клеток имплантированных в естественных условиях можно проанализированы через обычные ИВИС изображений и контролировать жить во время прогрессии опухоли, предоставляя уникальную возможность заглянуть в динамике TGF-β сигнальный путь. Наш протокол описывает систему доставки выгодно репортер позволяет для быстрой визуализации высок объём живой клетки, сигнальные пути в пробирке и в естественных условиях. Этот метод может быть расширен спектр изображения на основе анализов и представляет как чувствительных и воспроизводимый подход для базовой биологии и терапевтические развития.

Introduction

Трансформирующий фактор роста β (TGF-β) является важным цитокина, замешанных в развитии человеческого потенциала, что сигналы через гетеродимерная комплекс, состоящий из типа II и I типа рецепторов1. Привязка к типу II рецепторов приводит к вербовки и фосфорилирование типа я рецептор, который в свою очередь фосфорилирует вниз по течению Smad2/3 белки2,3. Эти активирован Smad2/3 белки привязку к Smad4, образуя комплекс, который translocates в ядро и регулирует транскрипцию генов4. В условиях гомеостатических TGF-β/Smad сигнализации жестко регулируется; Однако во многих заболеваний, сигнальный путь является дерегулирование и часто оверэкспрессировали ведет к прогрессированию заболевания5,6,7. Недавние исследования показали, что клеточный ответ на TGF-β разнородные и субпопуляций TGF-β/Smad активные клетки отвечают за биологические функции в обнаруживавшие время8,9. Общий анализ клеточных TGF-β/Smad сигнализации включает в себя использование фиксированной конечной точки анализов, которые предоставляют только снимок клеточную активность и часто quantitate средний эффект TGF-β/Smad10. Однако, эти методы не могут точно представлять молекулярных поведения TGF-β/Smad сигнализации в физиологическом состоянии во время болезни. Анализ на основе изображений живых клеток захватить динамику клеточного и биологических процессов с пространственной и временной понимания.

Нашей целью было разработать чувствительный метод высокой пропускной способностью для живых клеток изображений TGF-β/Smad сигнализацию с помощью реагентов на основе аденовирусы. Здесь мы заражены линии клеток рака молочной железы человека MDA-MB-231 аденовирус, выражая Smad3 CAGA мотив привязки последовательности и Люцифераза (Люк) или Td-томатный (Td-Tom) Репортер ген. Аденовирусных репортер системы обеспечивают быстрый и дешевый метод для плазмида введение, которое может привести к инфекции 100% показатель в рак клеточных линий. Аденовирусных репортер системы также были успешно применены к клеточных линий, которые трудно transfect с обычными плазмида11. В этом протоколе мы будем описывать воспроизводимость и неинвазивной процесс для достижения живой клетки изображений TGFβ/Smad сигнальный путь как в естественных условиях , так и в пробирке.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты на животных были утверждены в университете Мельбурна животных по этике.

Примечание: Последовательность, строительство и поколение протокол для аденовирусных векторы pAd-ЦМВ-Td-том,Ad-ЦМВ-GFP p и pAd-CAGA12- Люк/Td-том были ранее описанных11,12, 13. Все векторы являются коммерчески доступными.

1. вирус определение титра антител с использованием 50% культуры ткани инфекционным дозу (50TCID)

  1. Подготовьте 1 х 106 клеток HEK293A 10 мл DMEM + 10% FBS СМИ.
  2. Семя 100 мкл суспензии клеток в каждой скважине плиты культуры клеток 96-луночных с плоским дном.
  3. Готовим 1 мл разбавления 1: 100 акций вируса в полной средней. 11 мкл разбавленного вируса, для каждой скважины в колонке 1.
  4. Выполнение серийных разведений десятикратного прямо в 96 хорошо пластины, смешивая 11 мкл разбавленного вируса с 100 мкл суспензии клеток до окончательного растворения 1 x10 достигло12 . Хотя клетки не сторонник на данном этапе, количество клеток, передаваемых между скважинами остается неизменным.
  5. Пипетка 11 мкл каждого разведения в каждый столбец, начиная с высоким разбавления 104. Замените наконечники с каждого разведения ограничить кросс за вирусных частиц.
  6. Мкл 11 вирусов полный СМИ к колонке 12 как отрицательный контроль.
  7. Инкубируйте пластины для 7-10 дней при 37 ° C с 10% CO2.
  8. С помощью микроскопа, Оценка количество скважин в каждом столбце показано знаки цитопатического или цитотоксических эффектов. Рассмотрим также положительно, при наличии каких-либо признаков инфекции.
  9. Рассчитайте долю положительных скважин для каждого разведения с помощью язычка и Мюнх (1938) статистический метод14.
  10. Вычисления с использованием пропорционального расстояние (PD): (A-50)/(A-B), где A — это процент ответ выше или равна 50% и B — это процент ответ ниже 50%.
  11. Вычисления с использованием50 TCID: 10X-PD, где X — это разбавление дать ответ более чем на 50%.
  12. Рассчитать вирусный титр с помощью следующего: (0.011 x TCID50) ОРП/мл

2. аденовирус MOI определение

  1. Семя 1,0-1,5 x 105 MDA-MB-231 клетки с 500 мкл DMEM культуры сред, содержащих 5%, которые хорошо плиты ФБС в каждой скважине 12 (35% клеток confluency, 6 скважин в общей сложности).
  2. Рассчитать объемы Ad-ЦМВ-Td-том складе необходимых для 0, 250, 500, 2500 и 5000 MOI, используя следующие формулы: MOI = (объем [мкл] x ОРП/мкл) / количество клеток. Для Ad-ЦМВ-Td-том с титр 1 x 1010 (ОРП/мл), объемы инфекции вируса требуется MOIs являются 0, 3.75, 7.5, 37,5 и 75 мкл.
  3. Заразить клетки с расчетные объемы Ad-ЦМВ-Td-том в разделе 2.2, непосредственно закупорить вирусный складе в скважины с тщательного перемешивания.
  4. Место пластину в инкубаторе при 37 ° C с 10% CO2 на 24 часа.
  5. Удалите средства массовой информации из скважин и немедленно исправить клетки с 500 мкл формалина 10% за 5 мин.
  6. Аспирационная формалином из скважин и промыть скважин с 500 мкл PBS один раз.
  7. Пятно клеточного ядра с 500 мкл Hoechst раствора на 5 мин.
  8. Удаление решения Хехст и Промыть лунки с 500 мкл PBS 3 раза.
  9. Изображение Td-томатный белков и клеточного ядра сигнал с помощью 200 X увеличение на флуоресцентным микроскопом. Возбуждают Td-томатный белка в 554 Нм и Хойста на 352 Нм.
  10. Анализ изображений с помощью ImageJ для определения работы, необходимый для 100% инфекции Td-томатный15MOI.

3. двойной аденовирус трансдукции в живой единичных клеток

  1. Семя 1,0-1,5 x 105 MDA-MB-231 клетки с 500 мкл DMEM культуры сред, содержащих 5%, которые хорошо плиты ФБС в каждой скважине 12 (35% клеток confluency, 2 скважины в общей сложности).
  2. Заразить клетки с 75 мкл Ad-ЦМВ-GFP (титр = 5 х 109 ОРП/мл) и 7,5 мкл Ad-CAGA12-Td-том (титр = 5 x 1010 ОРП/мл) для получения 2500 MOI, которых может достичь 100% инфекции позитивность.
  3. Лечить клетки с или без 0,25 мкл TGF-β за хорошо (10 мг/мл в запасе, 5 нг/мкл как конечная концентрация) сразу же после аденовирусной инфекции.
  4. Место пластину в инкубаторе при 37 ° C с 10% CO2 на 24 часа.
  5. Изображение живых клеток с фазы контраст флуоресцентным микроскопом. Возбуждают GFP в 470 Нм и ТД-томатный белка в 554 Нм.
  6. Исправьте клетки и выведение клеточного ядра, как описано в шагах 1.6 - 1.9.
  7. Изображения Td-томатный белка и Hoechst пятно с помощью микроскопа флуоресценции. Возбуждают Хойста на 352 Нм.
  8. С помощью ImageJ, вычислить процент GFP и ТД-томатный позитивных клеток15.

4. живой одноклеточного сигнализации в заживление ран Assay

  1. Семя 4-5 x 105 MDA-MB-231 клеток в 1 мл DMEM культуры сред, содержащих 5%, которые хорошо плиты ФБС в каждой скважине 6 (50% клеток confluency, 2 скважины в общей сложности).
  2. Заразить клетки с 22,5 мкл Ad-CAGA12-Td-том (титр = 5 x 1010 ОРП/мл, MOI = 2500).
  3. Место пластину в инкубаторе при 37 ° C с 10% CO2 на 24 часа.
  4. Поцарапать две скрещенные линии на слой клетки каждой скважины с помощью кончика пипетки P200.
  5. Удалите старые СМИ из скважин и замените 2 мл свежего 5% FBS СМИ с или без 0.5 мкл TGF-β за хорошо (10 мг/мл в запасе, 5 нг/мкл как конечная концентрация).
  6. Установите пластину в инкубаторе при 37 ° C с 10% CO2 на 5 мин и принимать изображения выбранного рану областей с помощью 100 крат на этап контраста Микроскоп.
  7. Место пластину в инкубаторе при 37 ° C с 10% CO2 на 24 часа.
  8. Принимать образы закрытия раны в тех же областях, как раньше.
  9. Исправьте клетки, пятно клеточного ядра, как описано в шагах 1.6 - 1.9 и визуализировать Td-томатный сигнала в рану и области-раны, используя 200 X увеличение на флуоресцентным микроскопом.
  10. Количественно доля Td-томатный клеток в рану и области-раны с помощью ImageJ программного обеспечения15.

5. в Vitro Assay Люцифераза

  1. Готовят суспензию клеток 3-5 x 10-4 MDA-MB-231 клеток в 1 мл DMEM сред, содержащих 5% FBS.
  2. Заразить суспензию клеток с 2,5 мкл Ad-CAGA12- Люк (титр = 5 x 1010 ОРП/мл, MOI = 2500).
  3. Семя инфицированных клеток в 96 хорошо пластины на 3000 клеток/100 мкл/хорошо.
  4. Место пластину в инкубаторе при 37 ° C с 10% CO2 на 24 часа.
  5. Удалить старые СМИ из скважин и заменить 100 мкл свежие СМИ FBS 5%, с или без 0.1 мкл TGF-β за хорошо (1 мг/мл в запасе, 1 нг/мкл как конечная концентрация) и в присутствии или отсутствии 0.17 мкл ингибитора TGF-β за хорошо (7 мг/мл на складе 12 нг/мкл как конечная концентрация) (Роман TGF-β лигандом ловушку белок, Чэнь et al., неопубликованные работы).
  6. Место пластину в инкубаторе при 37 ° C с 10% CO2 на 24 часа.
  7. Оттаять Люцифераза пробирного системы субстрата и подготовить 1 x клетки культуры лизис реагента в двойной дистиллированной воды (DDW).
  8. Извлеките из 96 скважин и лизируют скважин с 50 мкл 1 x клетки культуры буфера lysis на льду, с использованием орбитальный шейкер с нежным агитации за 30 мин.
  9. Перевести 30 мкл lysate от каждой скважины в непрозрачной Люцифераза пластины и позволяют пластину нагреть до комнатной температуры.
  10. На Люминометр программного обеспечения создайте новый протокол. Выберите для 1 инжектор с измерений до и после инъекции. Значение измерения перед инъекцией в 1 s для задержки измерения и Время интеграции. Для после инъекции измерения, установить Объем впрыска 40 мкл с задержкой в измерения 1 сек после инъекции и 5 s Время интеграции. Подтвердите настройки, выбрав ОК.
  11. Поместите форсунки трубки в DDW и нажмите на кнопку инжектор 1 под параметры премьер чистить Инжекторные трубки перед использованием. Далее удалите форсунки трубки из DDW и место в воздухе, следуют две дальнейшие Primes инжектора 1 очистить все решения из трубки. Поместите форсунки трубки в Светлячок субстрата и снова премьер дважды для подготовки субстрата.
  12. Уложите Люминометр непрозрачные Люцифераза пластины с образцами и выберите Параметры программного обеспечения. Выделите скважин интерес и нажмите кнопку Применить. Нажмите старт для измерения Люцифераза сигнал.
  13. После завершения измерения снимите и промойте пластины с водой. Восстановите любые оставшиеся субстрата в трубу инжектор, поставив трубку в воздух и премьер инжектор 1 обратно в Светлячок субстрата трубки. Поместите форсунки трубки в DDW и выполнить еще два Primes чистить Инжекторные трубки любых оставшихся субстрата.

6. Подготовка клетки для живой сигнализации изображений в естественных условиях

  1. 48 ч до имплантации опухоли, семян 2-3 х 106 MDA-MB-231 клеток в колбах2 175 см (10 флаконов в общей сложности). Культура клетки в 20 мл DMEM сред, содержащих 5% FBS при 37 ° C, 10% CO2.
  2. 24 часа позже, добавьте 300 мкл Ad-CAGA12- Люк (титр = 5 x 1010 ОРП/мл, MOI = 2500) в каждый флакон. Держите клетки в культуре еще 24 часа.
  3. В день имплантации удалите старые средства массовой информации и мыть аденовирус зараженные клетки один раз с 20 мл PBS, рН 7,4. Добавить 2 мл 0,05% трипсина-ЭДТА в колбу и встряхните флакон слегка, чтобы позволить трипсина для покрытия всей поверхности колбы. Место в колбу для инкубатора 37 ° C, 10% CO2 на 3 мин.
  4. Утолите трипсина, добавив 8 мл FBS-содержащих DMEM СМИ в колбах. Передача всех клеточных суспензий в стеклянной бутылке реагента.
  5. Подсчитать ячейки с помощью Горяева и передачи 4.8 x 107 клеток в два 50 мл пробирок.
  6. Центрифуга клетки на 400 g x 5 мин на RT для удаления трипсина и Ресуспензируйте клетки в 720 мл свежего FBS-DMEM средств массовой информации.
  7. Перенесите клеточных суспензий в стерильный 5 мл трубку и добавьте 160 мкл Matrigel (10% всего matrigel подвеска).
  8. Держите клетки на льду до имплантации.

7. ортотопическая имплантации

  1. Вес 12 SCID мышей и случайно выделить мышей в группы контроля и лечения (6 мышей/группа).
  2. Проводить подсадку в стерильных био кабинет для поддержания стерильную среду. Обезболивают мыши, с помощью изофлюрановая 2,5-4,5% с расходом кислорода 1 Л/мин место мыши на площадку тепла и распределить капли смазочных глазную мазь на оба глаза, чтобы избежать повреждения роговицы. Исправьте мыши панель тепла в лежачем положении, в то время как поддержание анестезии, помещая морду в носовой конус подключен к изофлюрановая.
  3. Подтвердите успех анестезии, отсутствие реакции на носок пинча. Уменьшите изофлюрановая до поддерживающей дозы 1,5-2,5% с 1 Л/мин кислорода напоминание имплантации.
  4. Очистите кожу от четвертой соска с обеих сторон от средней линии с помощью ватным тампоном, смоченным в 80% этанола.
  5. Найти 4 молочной железы жировой тканий посредством пальпации и сожмите жировой ткани для дальнейшего предоставления ткани.
  6. Смешайте суспензию клеток хорошо закупорить вверх и вниз. Аккуратно аспирационная 50 мкл клеток смеси в шприц инсулина 27G и вставляют молочной железы жировой ткани на обе стороны мыши.
  7. Подтвердите успешное инъекций, чувство опухоль из жировой ткани. Осторожно отпустите жировой ткани и поместите курсор мыши обратно в клетке.
  8. Оставьте клетки на площадку тепла для по крайней мере 30 минут, чтобы позволить мышей, чтобы получить сознание и затем поместите клетки обратно в зале проведения на 3 дня.

8. ИВИС изображений

  1. Откройте Образ жизни программного обеспечения.
  2. Инициализация системы ИВИС, нажав кнопку Инициализировать ИВИС система на панели управления. Подождите, пока температура знак становится зеленым.
  3. Выберите режим визуализации люминесцентные на панели управления.
  4. Включите изофлюрановая анестезии в палату и ИВИС системы.
  5. Обезболивают мышей с использованием 2,5-4,5% изофлюрановая с кислородом 1 Л/мин. После того, как антибиотикоустойчивую, установите изофлюрановая в 1,5-2,5% на эксплуатационные расходы. Inject 150 мг/кг веса тела D-люциферин в мышей впрыской внутрибрюшинного (и.п.).
  6. Сразу же перевести мышей в системе ИВИС, разместить их на платформу обработки изображений контролируемой температурой и место их носом в носовой конус.
  7. Нажмите на кнопку Последовательности установки на панели управления и выберите Средний биннинга.
  8. Настройка визуализации время экспозиции следующим: 10 s, 20 сек, 30 сек, 60 s и 120 s. начало визуализации примерно 3 мин после инъекции люциферин и продолжать изображения до тех пор, пока сигнал начинает падать (обычно это займет около 20 минут).
  9. Вынуть ИВИС мышей при поддержании анестезии изофлюрановая через носовой конус и лечить мышей с 50 мкл PBS или 50 мкл TGF-β сигнализации ингибитора (50 мкг/опухоль) через внутри опухоль инъекций.
  10. Положите мышей обратно в клетке и оставить их на клавиатуре тепла для по крайней мере 30 минут. Затем поместите клетку обратно в зале проведения.
  11. Повторите ИВИС изображений процедура, как описано выше на следующий день после лечения.

9. анализ данных

  1. Открытие сохраненных файлов в Образ жизни программного обеспечения.
  2. Найти изображение информацию с помощью представления | Информацию об изображении.
  3. Выберите фотографии, снятые в подобный момент времени с тем же временем экспозиции. Загрузить фотографии в качестве группы.
  4. Снимите флажок отдельных в Настройки изображения для нормализации интенсивность.
  5. Выберите режим Фотон анализа интенсивности. Количественную оценку интенсивности сигнала, выбрав кнопку Региона интерес (ROI) в ROI инструменты.
  6. Перетащите кружок ROI в регионе, содержащий биолюминесцентных сигнал и нажмите кнопку измерения для приобретения интенсивности сигнала.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Жить в одну ячейку, изображений в пробирке

Чтобы точно оценить активации TGF-β/Smad сигнализации в одиночных клетках с использованием реагентов аденовирус основе, важно сначала определить оптимальную кратность инфекции (МВД) для каждой ячейки строки. Оптимальное MOI определяется при 100% клеток являются позитивными аденовирусных инфекций без настоящей цитопатического или цитотоксических эффектов. Чтобы определить это, мы использовали конститутивно активных Ad-ЦМВ-Td-том репортер, который выступал в качестве маркера положительных инфекции. Образом MOI зависимых от 0 до 5000 MOI был увеличен процент аденовирус инфицированных клеток. На 2500 MOI мы наблюдали 100% Td-том выражение в клетках MDA-MB-231 (рис. 1A, 1B). Пиксель интенсивности/клетки также увеличилось с МВД, обеспечивая повышенной чувствительностью и обнаружения транскрипционный анализ вывода (рис. 1 c). Таким образом рабочие MOI 2500 использовалась для выполнения двойной инфекции, где клетки были заражены Ad-ЦМВ-GFP (служил в качестве позитивного управления для инфекции клеток) и Ad-CAGA12-Td-том одновременно. Отдельные ячейки представил различные уровни Td-том выражение, показывающее разнородные активация транскрипции TGF-β/Smad3 по ячейкам в живой и стационарных клетках. (Рис. 2A, 2B). 100% клеток MDA-MB-231, представлены с экспрессия гена GFP в то время как лишь около 26% клеток отображается обнаружению TGF-β/Smad3 транскрипционный анализ деятельности 24 ч после стимуляции TGF-β, по сравнению с 0% ым без лечения TGF-β (рис. 2 c). Использовать аденовирус основе реагент для изучения TGF-β/Smad3 транскрипционный анализ активности во время биологических процессов, MDA-MB-231 клетки были заражены Ad-CAGA12-Td-том на 2500 MOI и подвергается ранозаживляющее пробирного. Инфицированные клетки MDA-MB-231 выставлены нормальной миграции поведение и клетках, обработанных с 5 нг/мл TGF-β показал закрытия расширенной РАН, по сравнению с не TGF-β обработанные клетки (Рисунок 3А). В частности около 62% ячейки в области раны представил позитивные TGF-β/Smad3 транскрипционный анализ деятельности, которая значительно выше, чем наблюдается в области-раны (32%), после лечения TGF-β (рис.3B). Таким образом реагентов на основе аденовирус проверяются их применение для визуализации TGF-β сигнальный путь в живой одну ячейку в пробирке.

TGF-β сигнализации изображений в естественных условиях живут

Чувствительность Ad-CAGA12- Люк репортер был первым проверенных в пробирке в ответ на стимуляцию TGF-β и наличие ингибитора TGF-β. Когда инфицированные клетки MDA-MB-231 были стимулировали с 1 нг/мл TGF-β, Люцифераза репортер активность увеличилась 1,200-fold по сравнению с базальной без лечения MDA-MB-231 уровнях. Этот ответ был удивительно заблокирован 12 мкг/мл TGF-β ингибитора (рис. 4A). Ad-CAGA12- Люк реагент впоследствии был испытан в груди опухоль ортотопическая имплантации животной модели. Управления и TGF-β ингибитор лечение групп показали аналогичные Люцифераза репортер активности до лечения. Однако для группы управления, Люцифераза сигнал не изменились после лечения PBS, в то время как мыши лечили ингибитором TGF-β, показали снижение около вывозимому сигнал (рис. 4б, 4 C). В совокупности эти результаты демонстрируют потенциал для живых, так и в реальном времени мониторинг TGF-β сигнальной деятельности в естественных условиях без необходимости для жертвоприношения животных.

Figure 1
Рисунок 1. Определение MOI реагент на основе аденовирус. MDA-MB-231 клетки были заражены Ad-ЦМВ-Td-том в разных MOI и посеяны в тарелку 12 скважин. 24 ч после инфекции, клетки были исправлены и ядерной запятнана Хёхст. (A) изображения были взяты для визуализации Td-том позитивные клетки (красный) и ядра (синий) и количественно ImageJ. (Б) процент Td-том позитивных клеток. (C) Td-том пиксель интенсивности/клеток нормализуется к фону. Эти цифры являются представитель по крайней мере 3 независимых экспериментов. Данные являются средством triplicates ± SD. шкалы бар = 50 мкм (200 X). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2. Одноячеистый изображений для двойной инфекции. MDA-MB-231 клетки были двойной инфицированных Ad-ЦМВ-GFP и Ad-CAGA12-Td-том в MOI (2500) и посеяны в тарелку 12 скважин. 24 часа после инфекции, клетки относились с или без 5 нг/мл TGF-β. (A) 24 ч после лечения, клетки были живые образы для визуализации GFP положительные (зеленый) и ТД-том (красный) клеток. Клетки были затем фиксированной и ядерной запятнана Hoechst для количественной оценки. (B) изображения были взяты для визуализации GFP положительные (зеленый), Td-том позитивные клетки (красный) и ядра (синий). (C) GFP или Td-том позитивные клетки были количественно, ImageJ и рассчитывается процент положительных клеток. Эти цифры являются представитель по крайней мере 3 независимых экспериментов. Данные являются средством triplicates ± SD. Статистическая значимость определяется t критерия Стьюдента (*** p ≤0.0001). Шкалы бар = 50 мкм (200 X). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3. Живые клетки TGF-β сигнализации способствует миграции клеток. MDA-MB-231 клетки были заражены Ad-CAGA12-Td-том в MOI (2500) и посеян на пластину 6 скважин. 24 ч после инфекции, клетки были почесал с помощью кончика пипетки Р200 для создания рану и СМИ заменены или без 5 нг/мл TGF-β. После еще 24 часа клетки были исправлены и ядерной запятнана Hoechst для визуального представления. (A) фаза контраст закрытия РАН, шкалы бар = 100 мкм (100 X). (B) Td-том позитивные клетки (красный) и ядра (синий). Шкалы бар = 50 мкм (200 X) (C) Td-том позитивные клетки были количественно, ImageJ и рассчитывается процент положительных клеток. Эти цифры являются представитель по крайней мере 3 независимых экспериментов. Данные являются средством triplicates ± SD. Статистическая значимость определяется t критерия Стьюдента (*** p ≤0.0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4. В естественных условиях живут сигнализации изображений TGF-β. (A) MDA-MB-231 клетки были заражены Ad-CAGA12- Люк и затем посеяны в 96 скважин пластина для 24 h. После этого клетки относились с или без 1 нг/мл TGF-β в присутствии или отсутствии TGF-β ингибитора 12 мкг/мл на ночь. Люцифераза деятельность была измерена на основе на весь lysate клетки. Люцифераза мероприятия были представлены как раз индукции, нормализуется без лечения управления. Данные являются средством triplicates ± SD. (B) MDA-MB-231 клетки были заражены Ad-CAGA12- Люк 24 ч до имплантации. Клетки были имплантированы в молочной железы жировой ткани с обеих сторон SCID мышей. 72 h позже, ИВИС изображений была выполнена до и после лечения 24 h (PBS для группы элементов управления) и 50 мкг/опухоли TGF-β ингибитора для лечения группы. (C) фотонного потока была количественно оценена, живущих изображений программное обеспечение. Данные являются средством каждой группе лечения (n = 12) ± SD. статистической значимости определялась по t критерия Стьюдента (** p ≤0.01, *** p ≤0.0001). p/s относится к фотоны/s. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы разработали технику для в реальном времени изображений TGF-β/Smad3 сигнализации в одном живых клеток. Используя этот новый метод, мы ранее определили суб популяция клеток с динамичной деятельности transcriptional TGF-β/Smad3, который был связан с расширенной вторжения и миграции8. Этот метод улучшает на традиционные анализы для сигнализации TGF-β, например западных помарках Smad3 фосфорилирования и TGF-β мишенью экспрессии генов, захватив неоднородность от TGF-β/Smad3 сигнализации в рамках населения опухоли и подсветка значение одной ячейки биологии. Кроме того альтернативные методы одну ячейку изображений, такие как ядерные транслокации может быть трудоемким и дорогим если выполнено в живой клетки и не всегда может перевести в транскрипции гена16,17. Хотя эти методы имеют важное значение для изучения вверх по течению пути передачи сигнала, аденовирус репортер система обеспечивает уникальную точку зрения на TGF-β/Smad3 сигнализации в отдельных клетках применительно к биологической функции.

Значительно, наш метод предоставляет метод чувствительных и воспроизводимые в естественных условиях обнаружения сигнальный путь TGF-β/Smad3 в режиме реального времени в ходе опухолевой прогрессии и лечения. Подобно традиционным стабильной Люцифераза в vivo изображений, обнаружение TGF-β/Smad3 сигнализации в рамках мыши зависит количество клеток и уровнем промоутер деятельность18. Хотя подкожной клетчатки содержит мало вмешательства для анализа, увеличение глубины клеток снизит чувствительность обнаружения сигнала. Это можно расширить метод для использования в других органах, таких как лёгких и костей и другие виды рака; Однако для достижения чувствительность, необходимые для рака модель интерес рекомендуется оптимизации сигнала или ex vivo изображений.

Дополнительное преимущество использования системы репортер аденовирус является, что его применение скорее всего расширить анализ нескольких сигнальных путей одновременно в живых клеток. В рисунке 2Aмы показали, что клетки MDA-MB-231 может быть преобразованы с 2 отдельных аденовирус векторов, ЦМВ-GFP и CAGA-том. Эта система двойного инфекции можно расширить представлять два различных сигнальных путей через репортер флуоресценции белков и Люцифераза Репортеры (с помощью белков репортер Люцифераза Firefly и Guassia). Наша лаборатория добился синхронный сигнализации BMP/Smad1 и TGF-β/Smad3 сигнальных путей в ряде живой рак клеточных линий (данные не показаны).

Аденовирусы репортер системы предоставляют простой и удобный метод для живых клеток изображений TGF-β/Smad сигнальный путь как в пробирке и в естественных условиях. Эта система имеет явные преимущества перед другими системами часто используемые репортер. Во-первых аденовирус векторов, как сообщается, среди высоких вирусных трансдукции эффективность, делая их оптимальной системы для клеточных линий, которые трудно передают19,20,21,22. Кроме того с текущих достижений в вирусных технологий, «вялый» аденовирус векторов может создаваться путем удаления часть вирусного генома, позволяя для увеличения экзогенной ДНК потенциала23. По сравнению с не вирусных систем доставки аденовирус векторы представляют экономически, быстрое и простое приложение для трансдукции клеток, что приводит к гораздо более доставки эффективности19,20,21 ,22.

Этот протокол использует систему выражения второго поколения аденовирус, которая репликации некомпетентность в mammalian клетках, которые не выражают Е1А и E1b белки, минимизации риска биобезопасности24. Однако несмотря на эти расширенные функции биобезопасности, аденовирус, частицы могут по-прежнему передают первичных клеток человека с высокой эффективностью25,26. При обработке и утилизации аденовирус загрязненного оборудования рекомендуется 2-го уровня биобезопасности США и сдерживания аденовирусных векторов. Крупномасштабные амплификации аденовирус в HEK293A клетках может привести к редким поколения репликации компетентный «дикий» аденовирус27. Следует выполнять PCR скрининг для выявления загрязнения дикого типа27.

Репликация некомпетентность аденовирус векторы являются временными в выражении и не интегрируются с принимающей ДНК20,21. Рекомендуется, что экспериментатор определить стабильность в выражении их репортер белка при использовании системы аденовирус репортер для подтверждения обоснованности долгосрочных экспериментов. Выражение времени аденовирус вектора в ячейке пропорционально времени разделение клетки и вирусных MOI. Чтобы обеспечить воспроизводимость результатов, важно, что вирусный титр точно определяется для каждого вирусный пакета. Кроме того, чрезмерно высокие объемы аденовирус может привести к цитотоксических или цитопатического воздействия и важно, что оптимальный MOI эмпирически определяется для каждой ячейки выстроились используется для обеспечения наилучших результатов. Кроме того в естественных условиях использования аденовирус векторов может вызвать иммунный ответ; где иммунного ответа является не основным наблюдения, эксперимента, ослабленным иммунитетом животных рекомендуется20,21. Дополнительный контроль качества необходим при использовании аденовирусных векторы для целевого иммунного ответа, хотя использование аденовирус подтверждена как адъювант вакцин терапии28,29.

Аденовирусы репортер система может использоваться на широкий спектр первичных и культивировали клеточных линий деления и не разделяя природы20,22. С помощью системы репортер аденовирус, мы достигли 100% заболеваемости в ряде линий клеток рака, включая мозга, молочной железы, толстой кишки, как хорошо клетки первичной мыши зародышевые фибробластов (MEF) и собак эпителия почек (MDCK). Кроме того можно изменять аденовирусных векторов далее увеличить сродство для специфических рецепторов типа клеток, обеспечивая улучшение орган ориентации и эффективность для трансдукции30,31.

Применение этого метода может быть расширена до других сигнальных путей и узлов клеток. Основные преимущества системы аденовирусных репортер включают трансдукции дешевые, высокая эффективность, быстро экспериментальной установки и отсутствие интеграции с принимающей ДНК21,32. Этот метод может применяться для многих текущих анализов и в естественных условиях моделей, в том числе в оценке новой целенаправленной терапии33. Мы надеемся, что использование этой техники укрепит наше понимание взаимосвязи между сигнальные пути и биологических процессов, ведущих к новых биологических открытиях и разработки новых методов лечения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы сообщают не коллизии интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана субсидии от национального здравоохранения и медицинских исследований Совета (NHMRC) H-JZ. TMBW является получателем Австралии аспирантов награду от правительства Австралии и Энн Хендерсон Top-Up стипендию от здравоохранения Австралии Ротари в партнере с Ротари Templestowe и пообедать на излечение.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM ThermoFisher 1881024 Warm in 37 °C waterbath before use
Foetal Bovine Serum Scientifix Life FBS500-S Heat inactivated before use
Recombinant Human TGF-β1 PEPROTECH 100-21 Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL
Hoechst-33258 Tocris Bioscience 5117 Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL
Luciferase Reporter Assay Kit Promega 197897 Dilute 5x in PBS before use
Luminometer Promega 9100-002
Phase contrast fluorescence microscopy OLYMPUS IX50
Centrifuge eppendorf 5810 R
VivoGl Luciferin Promega P1041
IVIS Lumina III In Vivo Imaging System PerkinElmer CLS136334
0.5% Trypsin-EDTA (10x) ThermoFisher 15400-054 Diltue to 0.05% (1x) in PBS
Cell Culture Lysis 5x Reagent Promega E153A Dilute to 1x in DDW
10% Formalin Sigma-Aldrich F5554-4L
HEK 293A ThermoFisher R70507
MDA-MB-231 ATCC CRM-HTB-26
PRKDC-SCID Animal Resources Centre SCIDF6
Matrigel Corning 354234
Isoflurane Zoetis 26675-46-7
Ethanol Chem-supply EA043-10L-P
Refresh Night Time Allergan 1750D Lubricating Eye Ointment
Solution Composition
Phosphate-Buffered Saline (PBS) NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M)
FBS-DMEM  5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Massague, J., Like, B. Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines. The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).
  2. Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J. The nuclear import function of Smad2 is masked by SARA and unmasked by TGFbeta-dependent phosphorylation. Nature Cell Biology. 2, 559-562 (2000).
  3. Massague, J. TGFbeta signaling in context. Nature reviews. Molecular cell biology. 13, 616-630 (2012).
  4. Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Development. 19, 2783-2810 (2005).
  5. Blobe, G. C., Schiemann, W. P., Lodish, H. F. Role of transforming growth factor beta in human disease. The New England journal of medicine. , 1350-1358 (2000).
  6. Zhu, H. J., Burgess, A. W. Regulation of transforming growth factor-beta signaling. Molecular cell biology research communications : MCBRC. 4, 321-330 (2001).
  7. Massagué, J. TGFβ in Cancer. Cell. 134, 215-230 (2008).
  8. Luwor, R. B., et al. Single live cell TGF-beta signaling imaging: breast cancer cell motility and migration is driven by sub-populations of cells with dynamic TGF-beta-Smad3 activity. Molecular cancer. 14, 50 (2015).
  9. Clarke, D. C., Liu, X. Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling. Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).
  10. Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).
  11. Luwor, R. B., et al. New reagents for improved in vitro and in vivo examination of TGF-beta signalling. Growth factors. 29, 211-218 (2011).
  12. Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17, 3091-3100 (1998).
  13. Luwor, R. B., et al. Targeting Stat3 and Smad7 to restore TGF-beta cytostatic regulation of tumor cells in vitro and in vivo. Oncogene. 32, 2433-2441 (2013).
  14. Reed, L. J., Muench, H. A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints. American Journal of Epidemiology. 27, 493-497 (1938).
  15. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9, 671-675 (2012).
  16. Dennler, S., Prunier, C., Ferrand, N., Gauthier, J. M., Atfi, A. c-Jun inhibits transforming growth factor beta-mediated transcription by repressing Smad3 transcriptional activity. The Journal of biological chemistry. 275, 28858-28865 (2000).
  17. Fink, S. P., Mikkola, D., Willson, J. K., Markowitz, S. TGF-beta-induced nuclear localization of Smad2 and Smad3 in Smad4 null cancer cell lines. Oncogene. 22, 1317-1323 (2003).
  18. Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR J. 49, 103-115 (2008).
  19. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
  20. Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).
  21. Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4, 43-63 (2017).
  22. Wang, I. I., Huang, I. I. Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies. Drug Discovery Today. 5, 10-16 (2000).
  23. Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 5731-5736 (1996).
  24. Wang, Q., Finer, M. H. Second-generation adenovirus vectors. Nature Medicine. 2, 714-716 (1996).
  25. Durham, H. D., et al. Toxicity of replication-defective adenoviral recombinants in dissociated cultures of nervous tissue. Experimental Neurology. 140, 14-20 (1996).
  26. MacKenzie, K. L., Hackett, N. R., Crystal, R. G., Moore, M. A. Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture. Blood. 96, 100-108 (2000).
  27. Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. A. Detection of wild-type contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR. Biotechniques. 18, 444-447 (1995).
  28. Choi, Y., Chang, J. Viral vectors for vaccine applications. Clinical and Experimental Vaccine Research. 2, 97-105 (2013).
  29. de Cassan, S. C., et al. The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus. Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).
  30. Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. T. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. Journal of Virology. 70, 6839-6846 (1996).
  31. Wickham, T. J., et al. Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins. Journal of Virology. 71, 8221-8229 (1997).
  32. Smith, F., Jacoby, D., Breakefield, X. O. Virus vectors for gene delivery to the nervous system. Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).
  33. Zhou, F., et al. Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling. Nature communications. 5, 3388 (2014).

Tags

Исследования рака выпуск 137 TGF-β живут клеток аденовирус сигнализации молочной железы Smad3 transcriptional активации клеток
Живой клетки изображений TGF-β/Smad3 сигнализируя Pathway <em>In Vitro</em> и <em>In Vivo</em> с помощью системы репортер аденовирус
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, H., Ware, T. M. B., Iaria, J., … More

Chen, H., Ware, T. M. B., Iaria, J., Zhu, H. J. Live Cell Imaging of the TGF- β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System. J. Vis. Exp. (137), e57926, doi:10.3791/57926 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter