Summary
यहां, हम आनुवंशिक रूप से संशोधित करने के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान प्राथमिक या विस्तारित मानव प्राकृतिक हत्यारा (NK) कोशिकाओं का उपयोग Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs) । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हम मानव NK वृद्धि कारक-बी रिसेप्टर 2 (TGFBR2) और hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) को बदलने के लिए कमी कोशिकाओं उत्पन्न.
Abstract
CRISPR/Cas9 टेक्नोलॉजी कई सेल प्रकारों में जीनोम इंजीनियरिंग को तेज कर रही है, लेकिन अभी तक, जीन डिलिवरी और स्थिर जीन संशोधन प्राथमिक NK कोशिकाओं में चुनौतीपूर्ण रहा है । उदाहरण के लिए, lentiviral या retroviral transduction का उपयोग करते हुए transgene डिलीवरी पर्याप्त प्रक्रिया-संबद्ध NK सेल NK के कारण आनुवंशिक रूप से इंजीनियर apoptosis कक्षों की एक सीमित उपज में हुई । हम यहां मानव प्राथमिक और विस्तारित NK Cas9 ribonucleoprotein परिसरों (Cas9/RNPs) का उपयोग कर कोशिकाओं के जीनोम संपादन के लिए एक डीएनए मुक्त विधि का वर्णन । इस विधि NK कोशिकाओं में TGFBR2 और HPRT1 जीन के कुशल नॉकआउट की अनुमति दी । RT-पीसीआर डेटा जीन अभिव्यक्ति के स्तर में एक महत्वपूर्ण कमी से पता चला है, और एक प्रतिनिधि सेल उत्पाद की एक cytotoxicity परख का सुझाव दिया है कि RNP संशोधित NK कोशिकाओं TGFβ के लिए कम संवेदनशील बन गया । आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं विकिरणित mbIL21-एक्सप्रेस फीडर कोशिकाओं के साथ उत्तेजना द्वारा पोस्ट-electroporation विस्तार किया जा सकता है ।
Introduction
कैंसर immunotherapy हाल के वर्षों में उन्नत किया गया है । आनुवंशिक रूप से संशोधित chimeric प्रतिजन रिसेप्टर (कार) टी कोशिकाओं को सफलतापूर्वक कैंसर immunotherapy में तैनात इंजीनियर प्रतिरक्षा कोशिकाओं का एक उत्कृष्ट उदाहरण हैं । इन कोशिकाओं को हाल ही में CD19 के खिलाफ उपचार के लिए एफडीए द्वारा अनुमोदित किया गया + बी सेल द्रोह, लेकिन सफलता अभी तक कुछ लक्षित एंटीजन असर रोगों तक ही सीमित किया गया है, और इस तरह के सीमित प्रतिजनी प्रदर्शनों को लक्षित कर रहे है प्रतिरक्षा से बचने की विफलता के लिए प्रवण है । इसके अलावा, कार टी कोशिकाओं क्योंकि भ्रष्टाचार के जोखिम की ऑटोलॉगस टी कोशिकाओं के उपयोग पर ध्यान केंद्रित किया गया है बनाम मेजबान allogeneic टी कोशिकाओं की वजह से रोग । इसके विपरीत, NK कोशिकाओं को एक प्रतिजन-स्वतंत्र तरीके से ट्यूमर लक्ष्यों को मारने में सक्षम है और GvHD कारण नहीं है, जो उंहें कैंसर immunotherapy6,7,8,9के लिए एक अच्छा उंमीदवार बनाता है ।
CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी इंजीनियरिंग प्रतिरक्षा कोशिकाओं में हाल ही में इस्तेमाल किया गया है, लेकिन आनुवंशिक रूप से plasmids के साथ NK कोशिकाओं reprogramming हमेशा चुनौतीपूर्ण रहा है । यह एक डीएनए निर्भर तरीके में transgene प्रसव में कठिनाइयों के कारण किया गया है जैसे lentiviral और retroviral पर्याप्त प्रक्रिया के कारण transduction-संबद्ध NK सेल apoptosis और आनुवंशिक रूप से इंजीनियर NK कोशिकाओं के सीमित उत्पादन4 , 9.
कई जंमजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं रोगज़नक़ के लिए रिसेप्टर्स के उच्च स्तर एक्सप्रेस ऐसे Retinoic एसिड के रूप में आणविक पैटर्न -inducible जीन मैं (रिग-मैं), जो विदेशी डीएनए की बढ़ मांयता सक्षम करें । इन रास्ते के दमन NK कोशिकाओं में उच्च transduction क्षमता सक्षम है जब आनुवंशिक संशोधन10के लिए डीएनए आधारित तरीकों का उपयोग कर ।
हम यहां का वर्णन एक डीएनए मुक्त जीनोम संपादन का उपयोग करने के लिए विधि प्राथमिक और विस्तारित मानव NK Cas9 ribonucleoprotein परिसरों का उपयोग कोशिकाओं (Cas9/RNPs) । Cas9/RNPs तीन घटकों से बना है, रिकॉमबिनेंट Cas9 प्रोटीन एक जटिल crRNA और tracerRNA के शामिल सिंथेटिक एकल गाइड आरएनए के साथ जटिल । ये Cas9/RNPs कार्यात्मक परिसरों के रूप में उनकी सुपुर्दगी के कारण विदेशी डीएनए-निर्भर दृष्टिकोणों की तुलना में उच्च दक्षता के साथ जीनोमिक लक्ष्यों को सट करने में सक्षम हैं । साथ ही, Cas9/RNPs की कोशिकाओं से तीव्र निकासी apoptosis की प्रेरण जैसे बंद लक्ष्य प्रभाव को कम कर सकते हैं । इस प्रकार, वे दस्तक-बहिष्कार उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या दस्तक-ins जब मुताबिक़ पुनर्संयोजन6,7के लिए डीएनए के साथ संयुक्त । हमें पता चला कि Cas9/RNPs के electroporation एक आसान और अपेक्षाकृत कुशल तरीका है कि NK कोशिकाओं में आनुवंशिक संशोधन की पिछले बाधाओं पर काबू पाना है ।
TGFβ एक प्रमुख immunosuppressive cytokine है, जो NK कोशिकाओं के सक्रियण और कार्यों को बाधित करता है । यह सुझाव दिया गया है कि TGFβ मार्ग लक्ष्यीकरण प्रतिरक्षा कोशिका कार्यों को बढ़ा सकते हैं । हम TGBR2 ectodomain जो11TGFβ बांध क्षेत्र एंकोडिंग लक्षित। प्रतिनिधि परिणाम इस जीन के mRNA अभिव्यक्ति के स्तर में एक महत्वपूर्ण कमी दिखाने के लिए और आगे प्रदर्शित करता है कि संशोधित NK कोशिकाओं TGFβ के लिए प्रतिरोधी हो । इसके अतिरिक्त, संशोधित कक्ष व्यवहार्यता और प्रफलन क्षमता बनाए रखते हैं, क्योंकि वे विकिरणित फीडर कोशिकाओं का उपयोग करके पोस्ट-electroporation का विस्तार करने में सक्षम होते हैं। इसलिए, निम्न विधि किसी भी आगे नैदानिक या अनुसंधान प्रयोजनों के लिए NK कोशिकाओं के लिए आनुवंशिक रूप से हेरफेर करने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है ।
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Protocol
स्वस्थ दाता buffy कोट केंद्रीय ओहियो क्षेत्र अमेरिकी रेड क्रॉस से स्रोत सामग्री के रूप में प्राप्त किए गए । इस शोध के लिए तय किया गया कि राष्ट्रव्यापी बच्चों के अस्पताल की संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुसंधान को छूट दी जाए.
1. मानव NK कोशिका शुद्धि और विस्तार
- Buffy कोट12से PBMCs को अलग करना ।
- परत ३५ Ficoll-Paque के 15 मिलीलीटर पर buffy कोट नमूने के एमएल ।
- ४०० एक्स जी पर ब्रेक के बिना 20 मिनट के लिए केंद्रापसारक और अंतरफलक से PBMC इकट्ठा ।
- धो बरामद PBMCs तीन बार से कम एक पंजाब के बराबर मात्रा जोड़कर, 5 मिनट के लिए ४०० x g पर केंद्रापसारक, और PBC धो aspirating । NK सेल13RosettesSep द्वारा इस स्तर पर अलग किया जा सकता है ।
- विकिरणित 10 x 106 mbIL21-एक्सप्रेस फीडर कोशिकाओं पर दिन 0, 7, और 14 के साथ उत्तेजक द्वारा NK कोशिकाओं का विस्तार करें । मीडिया हर दूसरे दिन पूरे मीडिया मात्रा के लिए 10% FBS, 1% Glutamine, 1% पेनिसिलिन Streptomycin, और IL-2 के १०० IU/एमएल युक्त ताजा RPMI के साथ बदलें ।
2. gRNA डिजाइन और चयन
- लक्षित करने के लिए विशिष्ट जीनोमिक loci चुनें, ऑनलाइन टूल का उपयोग करना, उदा., NCBI, पहनावा ।
उदाहरण.
विवरण: बदलने विकास फैक्टर बीटा रिसेप्टर 2 (TGFBRR2) ectodomain
रिकॉर्ड देखें: PF08917
देखें InterPro: IPR015013
स्थिति: ४९-१५७ aa
लक्षित अनुक्रम: TGFBR2 जीन (ENSG00000163513) के एक्सॉन 4 - gRNAs डिज़ाइन करने के लिए, CRISPR डिज़ाइन वेब उपकरण जैसे http://crispr.mit.edu और ' Benchling ' का उपयोग करें ।
- चरण २.१में चुना डीएनए अनुक्रम में दर्ज करें । मानव चुनें (पारा 19) एक लक्ष्य जीनोम के रूप में । CRISPR मार्गदर्शिकाएं (20 न्यूक्लियोटाइड एक पाम अनुक्रम द्वारा पीछा: NGG) पहले दर्ज अनुक्रम से स्कैन किया जाएगा । यह भी संभव से पता चलता है लक्ष्य चयनित जीनोम भर में मैच ।
- सबसे अच्छा तीन gRNAs जो उच्चतम स्कोर है, अपने पर लक्ष्य और बंद लक्ष्य दरों के आधार पर चुनें । उदाहरण के लिए, तालिका 1 से पता चलता है डिजाइन CRISPR RNAs TGFBR2 जीन के एक्सॉन 4 लक्ष्य को CRISPR डिजाइन वेब उपकरण द्वारा सुझाव दिया ।
- आदेश CRISPR RNAs सिंथेटिक अनुक्रम विशिष्ट crRNAs के रूप में ।
- एक संरक्षित आदेश, transactivating आरएनए (tracrRNA) crRNA के साथ आंशिक समरूपता के माध्यम से बातचीत करने के लिए.
3. डिजाइन विलोपन स्क्रीनिंग प्राइमरों
- डिजाइन T7E1 उत्परिवर्तन परख के लिए gRNA दरार साइटों फैले प्राइमर ।
- का प्रयोग करें प्राइमरों से कम १०० बीपी की भविष्यवाणी की दरार साइट से दूर sgRNA लक्ष्य साइट पर छोटे सम्मिलन-विलोपन (indels) सुनिश्चित करने के लिए उत्परिवर्तन परख के बाद १.५% agarose जेल पर दिखाई देगा । 2 तालिका प्राइमरों जो TGFBR2 ectodomain बढ़ाना किया जाता है दिखाता है ।
4. मानव प्राथमिक और विस्तारित NK कोशिकाओं का Transduction
नोट: NK में Cas9/RNPs तत्वों के Transduction के रूप में 4d प्रणाली का उपयोग electroporation द्वारा किया जाता है इस प्रकार है ।
-
सैल तैयारी
- प्राथमिक NK कोशिकाओं के लिए, 4 दिनों के लिए १०० IU/एमएल की उपस्थिति में RPMI माध्यम में हौसले से पृथक NK कोशिकाओं मशीन और 5 दिन में electroporation प्रदर्शन करते हैं । मीडिया हर दूसरे दिन के रूप में पहले और दिन transduction पहले वर्णित के रूप में बदलें ।
- विस्तारित NK कोशिकाओं के लिए, 1:1 के अनुपात में विकिरणित फीडर कोशिकाओं के साथ दिन 0 पर कोशिकाओं को उत्तेजित और दिन में 5 या 6 या 7 electroporation प्रदर्शन करते हैं । मीडिया हर दूसरे दिन के रूप में पहले और दिन transduction पहले वर्णित के रूप में बदलें ।
- electroporation के दिन, एक T25 एक electroporation ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2 मशीन में humidified और पूर्व-गर्मी कुप्पी के दौर से गुजर कोशिकाओं के लिए १०० IU/एमएल से युक्त ताजा RPMI के 8 मिलीलीटर से भरा कुप्पी तैयार करें ।
नोट: गल चुके कोशिकाओं या कोशिकाओं है कि 2एन डी या 3rd उत्तेजना आया है उनके वसूली के रूप में वर्णित के बाद किसी भी समय electroporated जा सकता है । - transduction मिश्रण के 26 µ एल के लिए शर्त के अनुसार 3-4 × 106 कोशिकाओं ले लो ।
नोट: electroporation समाधान में NK कोशिकाओं की बहुत उच्च एकाग्रता transduction दर को बढ़ाता है । - सभी FBS को हटाने के लिए पंजाबियों के साथ 3 बार की कोशिकाओं को धोएं, जिसमें सामान्यतः RNase गतिविधि होती है । हर बार 8 मिनट के लिए ३०० x g पर उंहें स्पिन ।
नोट: कैस/RNPs के लिए 7 electroporation शर्तों पर विचार करें सिंगल gRNA (gRNA1, gRNA2, gRNA3) और दो gRNAs (gRNA1 + gRNA2, gRNA1 + gRNA3, gRNA2 + gRNA3) का संयोजन और कोई Cas9/RNPs के साथ एक नियंत्रण ।
-
प्रपत्र crRNA: tracerRNA/
- reसस्पेंड crRNAs (gRNA1, gRNA2, और gRNA3) और २०० माइक्रोन की अंतिम सांद्रता के लिए 1x ते समाधान में tracerRNA । 3 तालिकामें दिखाए गए अनुसार २०० माइक्रोन tracerRNA के साथ प्रत्येक २०० माइक्रोन gRNA के २.२ μL मिश्रण.
- 5 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर नमूनों गर्मी और कमरे के तापमान (15-25 डिग्री सेल्सियस) के लिए बेंच शीर्ष पर शांत करने के लिए अनुमति देते हैं । स्टोर reसस्पैंड RNAs और crRNA: tracerRNA/परिसर में-20 बाद में उपयोग के लिए डिग्री सेल्सियस ।
-
RNP परिसर में फार्म
नोट: समय बचाने के लिए, वाशिंग स्टेप 4.1.5 के दौरान RNP कॉम्प्लेक्स को फार्म करें ।- एकल crRNA के लिए: tracrRNA द्वैध प्रतिक्रिया, Cas9 endonuclease के लिए ३६ माइक्रोन के रूप में तालिका 4में उदाहरण द्वारा दिखाया पतला ।
- crRNA के संयोजन transduction के लिए: tracrRNA डुप्लेक्स, तालिका 5 में उदाहरण द्वारा दर्शाए अनुसार ३६ माइक्रोन Cas9 endonuclease को पतला करें ।
- जोड़ें Cas9 endonuclease करने के लिए crRNA: tracrRNA डुप्लेक्स धीरे जबकि पिपेट टिप घूमता, 30 से अधिक 1 मिनट के लिए एस ।
- 15-20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण की मशीन । यदि तैयार नहीं के बाद मिश्रण का उपयोग करने के लिए मशीन, बर्फ पर मिश्रण रखने तक का उपयोग करें ।
-
Electroporation
- electroporation समाधान पी पी के लिए पूरे पूरक जोड़ें और यह कमरे के तापमान पर रहते हैं ।
- सेल गोली (3-4 × 10 कदम 4.1.5से6 कोशिकाओं) पी 3 प्राथमिक 4d electroporation समाधान के 20 μL में reसस्पेंड । जबकि pipetting हवा के बुलबुले से बचें ।
नोट: सेल p समाधान में एक लंबे समय के लिए नहीं छोड़ा जाना चाहिए । - तुरंत RNP कॉम्प्लेक्स (Step ४.३) के 5 µ l को सेल सस्पेंशन में जोड़ें ।
- Cas9/RNPs/सेल मिक्स करने के लिए १०० माइक्रोन Cas9 electroporation बढ़ाने के 1 μL जोड़ें ।
- Cas9/RNPs/सेल मिश्रण में 20 μL electroporation स्ट्रिप्स स्थानांतरण ।
- धीरे से सुनिश्चित करें कि नमूना स्ट्रिप्स के नीचे कवर करने के लिए स्ट्रिप्स नल.
- 4d electroporation प्रणाली शुरू और EN-१३८ कार्यक्रम का चयन करें ।
5. पोस्ट Transduction
- कोशिकाओं को स्ट्रिप्स में 3 मिनट के लिए आराम करने दें ।
- जोड़ें ८० µ पूर्व के एल equilibrated संस्कृति मीडिया cuvette करने के लिए और धीरे नमूना बोतल में हस्तांतरण ।
- ४८ घंटे transduction के बाद, निकालने जीनोमिक डीएनए से 5 × 105 कोशिकाओं जीन विलोपन स्क्रीनिंग के लिए ।
- ब्याज की जीन बढ़ाना Taq डीएनए पोलीमरेज़ किट के साथ ३.२ कदम में डिजाइन प्राइमरों का उपयोग कर ।
- फार्म पीसीआर amplicon heteroduplexes T7EI पाचन के लिए और ३७ डिग्री सेल्सियस में एक T7EI एंजाइम के साथ 30-60 मिनट के लिए उत्पाद मशीन ।
नोट: T7EI परख स्क्रीनिंग के लिए पसंद के रूप में यह तेजी से है, सरल और स्वच्छ ट्रो परिणाम प्रदान करता है सर्वेयर परख का उपयोग करने की तुलना में । हालांकि, इस विधि का पता लगाने नहीं कर सकता सम्मिलन और हटाए गए < 2 आधारों के द्वारा जनरेट किया गया गैर-मुताबिक़ अंत joining (NHEJ) गतिविधि Cas9 RNPs के लिए14में । - चलाने के लिए १.५% agarose जेल पर पचा डीएनए 30-45 मिनट के लिए ११० V पर, हर 15 मिनट जेल कल्पना ।
- 1:1 के अनुपात में mbIL21-एक्सप्रेस फीडर कोशिकाओं के साथ बाकी कोशिकाओं को उत्तेजित ।
- पांच दिनों के बाद उत्तेजना जीन अभिव्यक्ति स्तर के लिए आरएनए निकालने qPCR का उपयोग कर ।
- आचरण calcein परख के रूप में पहले12की सूचना दी । संक्षेप में, calcein AM के साथ लक्ष्य कक्षों को लोड करें (दिखाए गए उदाहरण में, 3 µ g/mL/1000000 DAOY कक्षों का उपयोग किया गया था) । IL2 में रात भर आराम से cytotoxicity परख के लिए NK कोशिकाओं को तैयार (१०० IU/एमएल) प्लस या शूंय से 10 एनजी/ आचरण calcein परख एक ही साइटोकिंस में NK कोशिकाओं के रूप में रात भर में विश्राम किया गया ।
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Representative Results
Electroporation दक्षता
Cas9/RNPs के electroporation का अनुकूलन करने के लिए, हम GFP कोशिकाओं में सिरना गैर लक्ष्यीकरण प्लाज्मिड और डीएनए NK के transduction के साथ 16 विभिंन कार्यक्रमों का परीक्षण किया । प्रवाह cytometry परख पता चला है कि एन १३८ सेल व्यवहार्यता और transduction दक्षता (३५% GFP सकारात्मक कोशिकाओं के दोनों कणों (चित्रा 1 और चित्रा 2) के लिए सबसे अधिक प्रतिशत था । दिलचस्प है, Cas9/RNPs electroporation के लिए इस कार्यक्रम का उपयोग करने की दक्षता उच्च था के रूप में हम TGFBR2 mRNA अभिव्यक्ति स्तर (चित्रा 5) में ६०% की कमी देखी गई । इसके अतिरिक्त, आनुवंशिक रूप से संशोधित NK कोशिकाओं को उगाया जा सकता है और 30 दिनों के लिए विस्तारित और cryopreserved (डेटा नहीं दिखाया गया है) ।
उत्परिवर्तन परख
Cas9/RNPs युक्त gRNA2, gRNA1 + gRNA2 और gRNA3 ने सफल TGFBR2 ectodomain जीन नॉकआउट किया था, लेकिन अकेले gRNA1 ने कोई T7E1 डिटेक्टिव indels (figure 3) नहीं बना पाया । साथ ही, चित्रा 4 मानव HPRT1 के सफलतापूर्वक नॉकआउट (hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1) विस्तारित मानव NK कोशिकाओं में व्यावसायिक रूप से प्रदान की gRNAs का उपयोग इंगित करता है । बैंड densitometry के अनुसार, आनुपातिक indel gRNA1 + gRNA2 का उपयोग कर दरों TGFBR2 संशोधित NK कोशिकाओं के लिए ३४% बैंड में परिणाम, gRNA3 के लिए 25% और HPRT जीन संशोधित NK कोशिकाओं के लिए ८१% ।
जीन अभिव्यक्ति स्तर परख
हमारे परिणाम के एक प्रतिनिधि के रूप में, चित्रा 5 mRNA TGFBR2 के ectodomain उत्पादन स्तर पर Cas9/RNPs (gRNA1 + gRNA2) के प्रभाव से पता चलता है, आरटी-पीसीआर द्वारा विश्लेषण किया । ग्राफ में देखा जाए तो लक्षित जीन की mRNA अभिव्यक्ति के स्तर में काफी कमी आई.
Cytotoxicity
के रूप में चित्रा 6में देखा, gRNA1 + gRNA2, gRNA2 और gRNA3 Cas9 RNPs के साथ TGFβ1 संशोधित कोशिकाओं, DAOY कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति, मशीन के बाद; संशोधित कोशिकाओं नियंत्रण समूह है जो रात भर मीडिया में आईएल-2 था की तुलना में अपने cytotoxicity स्तर में कोई उल्लेखनीय कमी नहीं दिखा था । यह परिणाम प्रदर्शित करता है कि Cas9/RNPs संशोधित कोशिकाओं TGFβ1 की उपस्थिति में अपने cytotoxicity समारोह को बनाए रखने और पता चलता है कि संशोधित कोशिकाओं TGFβ1 प्रतिरोधी बन गया ।
चित्र 1. ये आंकड़े EN-१३८ प्रोग्राम का उपयोग कर NK कोशिकाओं में सिरना और प्लाज्मिड डीएनए एक्सप्रेस GFP की electroporation दक्षता दिखाते हैं । के रूप में यहां देखा, NK सेल व्यवहार्यता ७७.५% है, और जीवित कोशिकाओं के ३५% GFP सकारात्मक थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2. यह आंकड़ा व्यवहार्यता और 16 कार्यक्रमों (DN-१००) electroporation अनुकूलन के लिए परीक्षण की एक और एक की दक्षता से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3. Cas9/RNPs-मध्यस्थता TGFBR2 नॉकआउट में दक (क) प्राथमिक NK कोशिकाओं (ख) T7E1 उत्परिवर्तन परख द्वारा मापा । T7E1 एंजाइम पहचानता है और बेमेल डीएनए सट । प्रत्येक छोटे बैंड (नीले तीर) पचा डीएनए जो एक indel ले टुकड़े का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4. Cas9/RNPs-T7E1 उत्परिवर्तन परख द्वारा मापा विस्तारित NK कोशिकाओं में मध्यस्थता HPRT व्यवधान. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5. RT-पीसीआर का उपयोग करके NK/Cas9 (RNPs + gRNA1) द्वारा पेश CRISPR संशोधित gRNA2 कोशिकाओं में TGFBR2 ectodomain की mRNA अभिव्यक्ति स्तर । GAPDH एक अंतर्जात नियंत्रण जीन के रूप में इस्तेमाल किया गया था । आरएनए स्तर में कमी TGFBR2 जीन (± SEM, P मान < 0.0001) के विघटन का संकेत देती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 6. ए. cytotoxicity Cas9 के एक प्रतिनिधि नमूने का उपयोग कर परख/RNPs संशोधित (gRNA1 + gRNA2, gRNA2, और gRNA3) NK कोशिकाओं को पता चलता है कि TGFβ1 के साथ कोशिकाओं की रात की गर्मी काफी अपने लाइसे कोशिकाओं DAOY करने की क्षमता में कमी नहीं है । b. जब गैर-संशोधित NK कोशिकाओं के साथ तुलना में, Cas9/RNP संशोधित NK कोशिकाओं (gRNA2 और gRNA3) TGFβ1 (मतलब ± SEM) के लिए कम संवेदनशील हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| gRNA नं. | gRNA अनुक्रम | सिंथेटिक crRNA के रूप में आदेश दिया | |||||
| gRNA1 | 5 CCCCTACCATGACTTTATTC 3 | /AltR1/rArGrUrCrArUrGrGrUrArGrGrGrGrArGrCrUrUrGrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArUrGrCrU/AltR2/ | |||||
| gRNA2 | 5 ATTGCACTCATCAGAGCTAC 3 | /AltR1/rArUrUrGrCrArCrUrCrArUrCrArGrArGrCrUrArCrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArUrGrCrU/AltR2/ | |||||
| gRNA3 | 5 AGTCATGGTAGGGGAGCTTG 3 | /AltR1/rArG rUrCrA rUrGrG rUrArGrGrGrG rArGrC rUrUrG rGrUrUrUrUrA rGrArG rCrUrA rUrGrCrU/AltR2/ | |||||
तालिका 1. सिंथेटिक crRNA के रूप में TGFBR2 ectodomain के एक्सॉन 4 को टारगेट करने के लिए तीन डिजायन gRNAs ।
| TGFBR 2 ectodomain प्राइमर FWD | 5 गोरखा प्रशिक्षण केंद्र TGC टीसीसी AGG TGA TGT TTA T3 |
| TGFBR2 ectodomain प्राइमरी रेव | 5 GGG CCT ढकोसला AAT CTG बिल्ली TTA 3 |
तालिका 2. प्राइमरों को बढ़ाना था TGFBR2 ectodomain जीन
| घटक | राशि (uL) |
| २०० µ m crRNA | २.२ |
| २०० µ m अनुरेखक आरएनए | २.२ |
| IDTE बफर | ५.६ |
| अंतिम उत्पाद | 10 |
तालिका 3. प्रपत्र crRNA: tracerRNA/परिसर का उपयोग कर २०० µ m RNAs
| घटक | राशि (µ l) |
| Pbs | 1 |
| crRNA: tracrRNA द्वैध (४.२ कदम से) | 2 (२०० pmol) |
| Alt-R Cas9 endonuclease (६१ µ m शेयर) | 2 |
| कुल मात्रा | 5 ul |
तालिका 4. सिंगल crRNA के लिए: tracrRNA डुप्लेक्स रिएक्शन, पतला Cas9 endonuclease को ३६ µ मी.
| घटक | राशि (µ l) |
| Pbs | 1 |
| crRNA: tracrRNA द्वैध (उदा. gRNA1) | 1 (१०० pmol) |
| crRNA: tracrRNA द्वैध (उदा. gRNA2) | 1 (१०० pmol) |
| Alt-R Cas9 endonuclease | 2 |
| कुल मात्रा | 5 µ l |
तालिका 5. crRNA के संयोजन transduction के लिए: tracrRNA डुप्लेक्स पतला Cas9 endonuclease को ३६ µ मी.
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Discussion
NK कोशिकाओं के डीएनए पर निर्भर संशोधन4,9को चुनौती दी गई है । हम, इसलिए, सीधे एक कृत्रिम रूप से पेश ribonucleoprotein (RNPs) जटिल और प्राथमिक और विस्तारित NK कोशिकाओं8में शुद्ध प्रोटीन के रूप में Cas9 प्रोटीन की शुरुआत की । इस विधि हमें कैपिंग, पूंछ को खत्म करने की अनुमति दी, और अंय transcriptional और शोधों की प्रक्रिया आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय द्वारा शुरू कर दिया है, जो NK सेल apoptosis डीएनए के साथ जुड़े कारण हो सकता है-निर्भर transduction तरीकों ।
इसके अलावा, विधि यहां की सूचना दी शुद्ध Cas9 Cas9/RNPs के रूप में जटिल प्रोटीन का उपयोग करता है, जो तुरंत electroporation निंनलिखित सक्रिय है और जल्दी से नीचा कर रहे हैं, जिससे लक्ष्य पर बढ़ती और बंद कम-मौजूदा प्रोटोकॉल पर लक्ष्य प्रभाव 5 , 6 , 7 , 16. इसके अलावा, उच्च दक्षता के साथ transduce Cas9/RNP के लिए एक नया electroporation दृष्टिकोण का अनुकूलन एक और महत्वपूर्ण कदम यहां शुरू की है, जो ब्याज की किसी भी अंय जीन के लिए लागू कर रहे हैं । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बड़ा electroporation cuvettes (डेटा नहीं दिखाया गया है) का उपयोग करके NK कक्षों की बड़ी संख्याओं के संशोधन के लिए इस विधि को स्केल किया जा सकता है ।
संक्षेप में, Cas9/RNPs आनुवंशिक रूप से कैंसर immunotherapy के लिए मानव प्राथमिक और विस्तारित NK कोशिकाओं के ऊपर वर्णित विधि का उपयोग संशोधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हमारे परिणामों को भी प्रदर्शित किया है कि TGFBR2 ectodomain जीन की एक सफल नॉकआउट इन संशोधित NK TGFβ111प्रतिरोधी बनने कोशिकाओं की ओर जाता है ।
(जैसे स्वाभाविक रूप से recombinogenic adeno-जुड़े वायरस (AAV) दाता वैक्टर) के रूप में टेंपलेट डीएनए के एक स्रोत के साथ RNP वितरण का मेल साइट विशिष्ट जीन प्रविष्टि मुताबिक़ पुनर्संयोजन3,18,19 द्वारा सक्षम हो सकता है .
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Disclosures
दाल का कार्य करता है/कूरियर चिकित्सकीय, ओब्सीडियन चिकित्सीय, Intellia चिकित्सीय, मर्क अनुसंधान प्रयोगशालाओं, और Miltenyi Biotec के लिए एक सलाहकार के रूप में सेवा की है, और CytoSen चिकित्सकीय में इक्विटी/
Acknowledgments
हम पांडुलिपि संपादन में अपनी तरह की मदद के लिए ब्रायन Tullius स्वीकार करते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15065 | The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection. |
| Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare - Life Sciences | 17-1440-02 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | Synthetically produced as Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest | |
| Alt-R® Genome Editing Detection Kit | Integrated DNA Technologies | 1075931 | Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls. |
| Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304-011 | |
| 4D-Nucleofector™ System | Lonza | AAF-1002B | |
| Human recombinant IL-2 Protein | Novartis | 65483-0116-07 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit | Lonza | V4XP-3032 | Contains pmaxGFP™ Vector, Nucleofector™ Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette™ Strips |
| Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
| Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9 Nuclease |
| DNeasy® Blood & Tissue Handbook | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | |
| TGFβ | Biolegend | 580706 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human | Integrated DNA Technologies | 1072554 | Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer. |
| IDTE pH 7.5 (1X TE Solution) | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | Cas9 Electroporation Enhancer |
References
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