Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att genetiskt modifiera primär eller utökad mänskliga naturliga mördarceller (NK) celler använder Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). Med hjälp av detta protokoll, genererade vi mänskliga NK celler bristfällig för omvandla tillväxtfaktor – b receptor 2 (TGFBR2) och hypoxantin phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).
Abstract
CRISPR/Cas9 teknik accelererar genomet engineering i många celltyper, men hittills har gen leverans och stabil genmodifiering har varit utmanande i primära NK-celler. Till exempel resulterade transgenens leverans med hjälp av lentiviral eller retrovirala transduktion i en begränsad avkastning av genetiskt manipulerade NK-celler på grund av betydande förfarande-associerade NK cell apoptos. Vi beskriver här en DNA-fri metod för editering av mänskliga primära och utökade NK celler använder Cas9 ribonukleoprotein komplex (Cas9/RNPs). Denna metod får effektiv knockout TGFBR2 och HPRT1 gener i NK-celler. RT-PCR data visade en signifikant minskning i gen uttryck nivå, och en cytotoxicitet analys av en representativ cellen produkt föreslog att RNP-modifierade NK-celler blev mindre känslig för TGFβ. Genetiskt modifierade celler kan vara utökade post-elektroporation genom stimulering med bestrålat mbIL21-uttryckande feeder celler.
Introduction
Immunterapi mot cancer har varit avancerade under de senaste åren. Genetiskt modifierade chimära antigen receptorn (bil) T-celler är ett utmärkt exempel på modifierade immunceller som distribuerats i cancer immunoterapi. Dessa celler har nyligen godkänts av FDA för behandling mot CD19 + B cell maligniteter, men framgången har hittills begränsats till sjukdomar med några targetable antigener, och inriktning på sådan begränsad antigena repertoarer är benägna att misslyckas immun flykten. Dessutom har CAR T-celler varit inriktad på användningen av autologa T-celler på grund av graft - versus - host sjukdom orsakas av allogena T-celler. I kontrast, NK-celler kan döda tumör mål på ett antigen-oberoende sätt och orsakar inte GvHD, vilket gör dem en bra kandidat för cancer immunoterapi6,7,8,9.
CRISPR/Cas9-teknik har använts nyligen i engineering immunceller, men genetiskt omprogrammering NK-celler med plasmider har alltid varit en utmaning. Detta har varit på grund av svårigheter i transgenens leverans på ett DNA beroende sätt såsom lentiviral och retrovirala transduktion orsakar betydande förfarande-associerade NK cell apoptos och begränsad produktion av genmanipulerade NK celler4 , 9.
Många medfödda immunceller uttrycka höga nivåer av receptorer för patogen-associerade molekylära mönster såsom Retinoic acid-inducerbara gen jag (RIG-jag), som gör det möjligt för förhöjd erkännande av främmande DNA. Dämpning av dessa vägar har aktiverat högre transduktion effektivitet i NK-celler när du använder DNA-baserade metoder för genetisk modifiering10.
Här beskriver vi metoden för att använda en DNA-fria gen editering av primära och utökade mänskliga NK celler utnyttja Cas9 ribonukleoprotein komplex (Cas9/RNPs). Cas9/RNPs består av tre komponenter, rekombinanta Cas9 protein komplex med syntetiska singel-guide RNA består av en komplex crRNA och tracerRNA. Dessa Cas9/RNPs klarar av att klyva genomisk mål med högre effektivitet jämfört med utländska DNA-beroende tillvägagångssätt på grund av deras leverans som funktionella komplex. Snabb clearance av Cas9/RNPs från cellerna kan dessutom minska de off-target effekterna såsom induktion av apoptos. De kan således användas för att generera knock-outs eller knock-ins när de kombineras med DNA för homolog rekombination6,7. Vi visade att elektroporation av Cas9/RNPs är en enkel och relativt effektiv metod som övervinner de tidigare begränsningarna av genetisk modifiering i NK-celler.
TGFβ är en större immunsuppressiva cytokin, som hämmar aktivering och funktioner av NK-celler. Det har föreslagits att inriktning TGFβ vägen kan öka immunceller funktioner. Vi riktade regionen kodning TGBR2 ectodomain som binder TGFβ11. De representativa resultat visar en signifikant minskning i nivån av mRNA-uttryck av denna gen och vidare Visa att de modifierade NK-cellerna bli resistenta mot TGFβ. Dessutom behålla modifierade cellerna livskraft och proliferativ potential, eftersom de kan vara utökade post-elektroporation använder bestrålat feeder celler. Därför följande metod är en lovande strategi att genetiskt manipulera NK-celler för någon ytterligare klinisk eller forskningsändamål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Friska givare buffy rockar erhölls som källmaterial från Central Ohio regionen amerikanska Röda korset. Denna forskning fastställdes vara undantagna forskning av institutionella i styrelsen av rikstäckande barnsjukhuset.
1. mänskliga NK Cell rening och Expansion
- Isolera PBMC från Buffy Coat12.
- Lager 35 mL buffy coat prov på 15 mL Ficoll-Paque.
- Centrifugera 400 x g i 20 minuter utan broms och samla PBMC från gränssnittet.
- Tvätta de återvunna PBMC tre gånger genom att lägga till minst en lika stor volym av PBS, centrifugering vid 400 x g i 5 minuter, och aspirera PBC tvätta. NK-cellen kan isoleras i detta skede av RosettesSep13.
- Expandera NK celler genom att stimulera med bestrålade 10 x 106 mbIL21-uttryckande feeder celler på dag 0, 7 och 14. Ersätta media med färska RPMI innehållande 10% FBS, 1% glutamin, 1% Penicillin Streptomycin och 100 IE/mL av IL-2 för hela mediavolymen varannan dag.
2. gärna Design och urval
- Välj de specifika genetiska loci att rikta, använda online-verktyg, exempelvis NCBI, Ensemble.
Exempel.
Beskrivning: Omvandla tillväxtfaktor beta receptor 2 (TGFBRR2) ectodomain
Visa post: PF08917
Visa InterPro: IPR015013
Befattning: 49-157 aa
Riktade sekvens: Exon 4 TGFBR2 gen (ENSG00000163513) - För att designa gRNAs, använda CRISPR design webbverktyg som http://crispr.mit.edu och 'Benchling.'
- Ange i den DNA-sekvens som valdes i steg 2.1. Välj mänskliga (hg 19) som en mål-genomet. CRISPR guider (20 nukleotider följt av en PAM-sekvens: NGG) kommer att skannas i sekvensen som angavs tidigare. Det visar också off-target matchningarna i hela det valda genomet.
- Välja de bästa tre gRNAs som har högst poäng, baserat på deras på målet och off-target priser. Tabell 1 visar exempelvis designade CRISPR RNASEN att rikta exon 4 TGFBR2 gen föreslagits av CRISPR design webb-verktyg.
- Beställ CRISPR RNASEN som syntetiska sekvens-specifika crRNAs.
- Beställ en bevarade, transactivating RNA (tracrRNA) för att interagera genom partiell homologi med crRNA.
3. design radering Screening grundfärger
- Design primers som spänner över de gärna klyvning platserna för T7E1 mutationsanalys.
- Användning primers minst 100 bp borta från förutsagda klyvning plats för att säkerställa små införande-radering (indels) på webbplatsen sgRNA mål visas på 1,5% agarosgel efter mutationsanalys. Tabell 2 visar primers som används för att förstärka den TGFBR2 ectodomain.
4. transduktion av människans primära och utökade NK-celler
Obs: Transduktion Cas9/RNPs element i NK görs genom elektroporation använda 4D systemet som följer.
-
Cell Beredning
- För primära NK-celler, inkubera nymalen isolerade NK-celler i RPMI medium i närvaro av 100 IU/mL av IL-2 i 4 dagar och utföra elektroporation på dag 5. Ersätta media varannan dag som beskrivs tidigare och dagen innan transduktion.
- För utökad NK-celler, stimulerar cellerna på dag 0 med bestrålade feeder celler i förhållandet 1:1 och utföra elektroporation på dag 5 eller 6 eller 7. Ersätta media varannan dag som beskrivs tidigare och dagen innan transduktion.
- På dagen för elektroporation, förbereda en T25 kolv fylld med 8 mL färsk RPMI innehållande 100 IE/mL IL-2 för celler som genomgår elektroporation och pre incubate kolvar i en fuktad 37 ° C och 5% CO2 inkubator.
Obs: Upptinade celler eller celler som har genomgått 2nd eller 3rd stimulering kan vara electroporated när som helst efter deras återhämtning som beskrivs. - Ta 3-4 × 106 celler per villkora för 26 µL av transduktion mix.
Obs: Mycket hög koncentration av NK-celler i elektroporation lösning ökar andelen transduktion. - Tvätta cellerna 3 gånger med PBS ta bort alla FBS, som vanligen innehåller RNase aktivitet. Snurra dem ner varje gång på 300 x g i 8 minuter.
Obs: Anser 7 elektroporation villkor för Cas/RNPs som enda gärna (gRNA1, gRNA2, gRNA3) och en kombination av två gRNAs (gRNA1 + gRNA2, gRNA1 + gRNA3, gRNA2 + gRNA3) och en kontroll med ingen Cas9/RNPs.
-
Bildar crRNA:tracerRNA / komplexa
- Återsuspendera crRNAs (gRNA1, gRNA2 och gRNA3) och tracerRNA i 1 x TE lösning för slutliga koncentrationer av 200 μM. Blanda 2.2 μL av varje 200 μM gärna med 200 μM tracerRNA som visas i tabell 3.
- Värm proverna vid 95 ° C i 5 min och låt svalna på bänk upp till rumstemperatur (15-25 ° C). Store resuspended RNAs och crRNA: tracerRNA/komplexa vid-20 ° C för senare användning.
-
Bilda komplexet RNP
Obs: för att spara tid, bilda den komplexa under tvätten RNP steg 4.1.5.- För enstaka crRNA:tracrRNA duplex reaktion, späd Cas9 Amiiiiin till 36 μM som framgår av exemplet i tabell 4.
- För kombination transduktion av crRNA:tracrRNA duplex, späd Cas9 Amiiiiin till 36 μM som framgår av exemplet i tabell 5.
- Lägga till Cas9 Amiiiiin till crRNA:tracrRNA duplex långsamt medan virvlande pipettspetsen, över 30 s till 1 minut.
- Inkubera blandningen i rumstemperatur i 15-20 min. Om inte redo att använda blandningen efter inkubation, hålla blandningen på is fram till användning.
-
Elektroporation
- Lägg hela tillägget till elektroporation lösning P3 och förvara det i rumstemperatur.
- Återsuspendera cellpelleten (3-4 × 106 celler från steg 4.1.5) i 20 μL av P3 primära 4 D elektroporation lösning. Undvika luftbubblor vid pipettering.
Obs: cellerna bör inte lämnas för en lång tid i P3 lösning. - Tillsätt omedelbart 5 µL av RNP komplexa (steg 4,3) att cellsuspensionen.
- Lägg till 1 μL av 100 μM Cas9 elektroporation förstärkare till Cas9/RNPs/cell blanda.
- Överföra Cas9/RNPs/cell mix 20 μL elektroporation strimlat.
- Knacka försiktigt remsorna att se till att provet täcker botten av remsorna.
- Starta 4D elektroporation systemet och välja programmet sv-138 .
5. bokföra transduktion
- Låt cellerna vila i 3 minuter i remsor.
- Tillsätt 80 µL före skakad kultur media i kyvetten och försiktigt överför provet till kolvar.
- 48 timmar efter transduktion, extrahera genomiskt DNA från 5 × 105 celler för genen borttagningarna screening.
- Förstärka gen av intresse med hjälp av primers utformad i steg 3,2 med Taq-DNA polymeras byggsatser.
- Bilda PCR-amplikon heteroduplexer för T7EI matsmältningen och inkubera produkten i 30-60 minuter med ett T7EI enzym i 37 ° C.
Obs: Den T7EI analysen är att föredra för screening som den är snabb, enkel och ger ren elektrofores resultat jämfört med surveyor-analys. Dock denna metod inte kan identifiera infogningar och borttagningar av < 2 baser som genereras av icke-homolog slutet att gå (NHEJ) aktivitet i Cas9 RNPs experiment14. - Varje kvart kör smält DNA på 1,5% agarosgel på 110 V för 30-45 minuter, och visualisera gelen.
- Stimulera resten av cellerna med den mbIL21-uttryckande feeder celler i förhållandet 1:1.
- Fem dagar efter stimulering extrahera RNA för gen uttryck nivå med hjälp av qPCR.
- Som tidigare rapporterats12genomföra calcein analyser. Kort, Ladda målceller med calcein AM (i exemplet, 3 µg/mL/1.000.000 DAOY celler användes). Förbereda NK celler cytotoxicitet analyser genom vila över natten i IL2 (100 IE/mL) plus eller minus 10 ng/mL lösliga TGFβ. Genomföra calcein analyser i den samma cytokiner som NK-celler var vilade över natten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Elektroporation effektivitet
För att optimera elektroporation av Cas9/RNPs, testade vi 16 olika program med transduktion GFP icke-targeting siRNA och DNA plasmid i NK celler. Flöde flödescytometri analysen visade att den sv-138 hade den högsta andelen cell livskraft och transduktion effektivitet (35% levande GFP positiva celler) för båda partiklar (figur 1 och figur 2). Intressant, var effektiviteten av att använda detta program för Cas9/RNPs elektroporation högre såg vi 60% minskning TGFBR2 mRNA uttryck nivå (figur 5). Genetiskt modifierade NK-celler kan dessutom vuxit och expanderat för 30 dagar och nedfrysta (inga data anges).
Mutationsanalys
Cas9/RNPs innehållande gRNA2, gRNA1 + gRNA2 och gRNA3 hade framgångsrika TGFBR2 ectodomain gen knockout, men gRNA1 ensam gjorde inte någon T7E1 detekterbara indels (figur 3). Dessutom anger figur 4 framgångsrikt knockout av mänskliga HPRT1 (hypoxantin phosphoribosyltransferase 1) i utökade mänskliga NK celler använder kommersiellt gRNAs. Enligt bandet densitometry, de proportionella ditsatta priser med hjälp av gRNA1 + gRNA2 resulterade i 34% band för TGFBR2 modifierade NK-celler, 25% för gRNA3 och 81% för den HPRT-gen modifierade NK-celler.
Gen uttryck nivå test
Som företrädare för vårt resultat visar figur 5 effekten av Cas9/RNPs (gRNA1 + gRNA2) på mRNA produktionsnivån av TGFBR2 ectodomain, analyseras av RT-PCR. Som kan ses i grafen, mRNA uttryck genen riktade betydligt minskade.
Cytotoxicitet
Som kan ses i figur 6, efter inkubation gRNA1 + gRNA2, gRNA2 och gRNA3 modified Cas9/RNPs celler med TGFβ1, Co odlade med DAOY celler; modifierade cellerna visade inte någon signifikant minskning av deras cytotoxicitet nivå jämfört med kontrollgruppen som hade IL-2 i media över natten. Detta resultat visar att Cas9/RNPs modified cellerna behåller sin cytotoxicitet funktion i närvaro av TGFβ1 och visar att de modifierade cellerna blev TGFβ1 resistenta.
Figur 1. Dessa siffror visar elektroporation effektivitet siRNA och plasmid-DNA uttrycker GFP i NK-celler med hjälp av sv-138-programmet. Som kan ses här, är NK cell livskraft 77,5% och 35% av levande celler var god Jordbrukarsed positiva. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Denna figur visar lönsamhet och effektivitet av en annan av de 16 program (DN-100) testas för elektroporation optimering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Cas9/RNPs-medierad TGFBR2 knockout i förbrukade (a) primär NK celler (b) mätt med T7E1 mutationsanalys. T7E1 enzym erkänner och klyver avvikande DNA. Varje litet band (blå pilar) representerar smält DNA-fragment som bär en ditsatta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Cas9/RNPs - medierad HPRT störningar i utökad NK-celler mätt T7E1 mutationsanalys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. mRNA uttryck nivå av TGFBR2 ectodomain i CRISPR modified NK-celler som infördes genom Cas9/RNPs (gRNA1 + gRNA2) med RT-PCR. GAPDH användes som en endogen kontroll-genen. Minskningen av RNA-nivåer indikerar en störning av TGFBR2 genen (menar ± SEM, P-värdet < 0,0001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. a. Cytotoxicitet analysen med ett representativt urval av Cas9/RNPs modified (gRNA1 + gRNA2, gRNA2 och gRNA3) NK celler visar att natten inkubation av cellerna med TGFβ1 inte sjunker avsevärt deras förmåga att lysera DAOY celler. b. jämfört med icke-modifierade NK-celler, den Cas9/RNP modifierade NK-celler (gRNA2 och gRNA3) är mindre känsliga för TGFβ1 (medelvärde ± SEM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Gärna nr. | Gärna sekvens | Beställas som syntetiska crRNA | |||||
| gRNA1 | 5 CCCCTACCATGACTTTATTC 3 | / AltR1/rArGrUrCrArUrGrGrUrArGrGrGrGrArGrCrUrUrGrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArUrGrCrU/AltR2 / | |||||
| gRNA2 | 5 ATTGCACTCATCAGAGCTAC 3 | / AltR1/rArUrUrGrCrArCrUrCrArUrCrArGrArGrCrUrArCrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArUrGrCrU/AltR2 / | |||||
| gRNA3 | 5 AGTCATGGTAGGGGAGCTTG 3 | / AltR1/rArG rUrCrA rUrGrG rUrArGrGrGrG rArGrC rUrUrG rGrUrUrUrUrA rGrArG rCrUrA rUrGrCrU/AltR2 / | |||||
Tabell 1. Tre utformade gRNAs att rikta exon 4 av TGFBR2 ectodomain som syntetiska crRNA.
| TGFBR 2 ectodomain Primers FWD | 5 GTC TGC TCC AGG TGA TGT TTA T3 |
| TGFBR2 ectodomain Primer REV | 5 GGG CCT GAG AAT CTG KATT TTA 3 |
Tabell 2. Primer som används för att förstärka den TGFBR2 ectodomain gen
| Komponent | Belopp (uL) |
| 200 µM crRNA | 2.2 |
| 200 µM tracer RNA | 2.2 |
| IDTE buffert | 5.6 |
| Slutprodukten | 10 |
Tabell 3. Bildar crRNA:tracerRNA / komplexa med 200 µM RNAs
| Komponent | Belopp (µL) |
| PBS | 1 |
| crRNA:tracrRNA duplex (från steg 4,2) | 2 (200 pmol) |
| Alt-R Cas9 Amiiiiin (61 µM lager) | 2 |
| Totala volymen | 5 ul |
Tabell 4. För enstaka crRNA:tracrRNA duplex reaktion, späd Cas9 Amiiiiin 36 µm.
| Komponent | Belopp (µL) |
| PBS | 1 |
| crRNA:tracrRNA duplex (ex. gRNA1) | 1 (100 pmol) |
| crRNA:tracrRNA duplex (ex. gRNA2) | 1 (100 pmol) |
| Alt-R Cas9 Amiiiiin | 2 |
| Totala volymen | 5 ΜL |
Tabell 5. För kombination späd transduktion av crRNA:tracrRNA duplex Cas9 Amiiiiin 36 µm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNA-beroende modifiering av NK-celler har utmanande4,9. Vi, därför infört direkt ett syntetiskt förformade ribonukleoprotein (RNPs) komplex och Cas9 protein som renat protein in i primära och utökade NK celler8. Denna metod tillät oss att eliminera tak, förföljer, och andra transkriptionell och translationell processer Startat av RNA-polymeras II, vilket kan orsaka NK cell apoptos är associerad med DNA-beroende transduktion metoder.
Dessutom använder metoden rapporterade här renat Cas9 protein komplex som Cas9/RNPs, som är aktiva omedelbart efter elektroporation och har försämrats snabbt, och därmed öka på målet och minska off-target effekter över nuvarande protokoll 5 , 6 , 7 , 16. Dessutom optimera ett nytt elektroporation tillvägagångssätt för att transduce Cas9/RNP med hög verkningsgrad är ett annat viktigt steg införs här, som är tillämpliga på alla andra gener av intresse. Denna metod kan skalas upp för modifiering av ett större antal NK-celler med hjälp av kommersiellt tillgängliga större elektroporation kyvetter (inga data anges).
Sammanfattningsvis kan Cas9/RNPs användas för att genetiskt modifiera mänskliga primära och utökade NK celler för cancer immunoterapi utnyttja den ovan beskrivna metoden. Våra resultat visade också att en framgångsrik knockout av TGFBR2 ectodomain genen leder till dessa modifierade NK celler blir resistenta TGFβ111.
Att kombinera RNP leverans med en källa av DNA (som naturligt recombinogenic adeno-associerade virus (AAV) givare vektorer) kan aktivera platsspecifika gen införande av homolog rekombination3,18,19 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DAL serverar/har tjänstgjort som konsult för Courier Therapeutics, Obsidian Therapeutics, Intellia Therapeutics, Merck Research Laboratories och Miltenyi Biotec och har kapital/ledarskap i CytoSen Therapeutics.
Acknowledgments
Vi erkänner Brian Tullius för hans vänliga hjälp i redigering manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15065 | The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection. |
| Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare - Life Sciences | 17-1440-02 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | Synthetically produced as Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest | |
| Alt-R® Genome Editing Detection Kit | Integrated DNA Technologies | 1075931 | Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls. |
| Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304-011 | |
| 4D-Nucleofector™ System | Lonza | AAF-1002B | |
| Human recombinant IL-2 Protein | Novartis | 65483-0116-07 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit | Lonza | V4XP-3032 | Contains pmaxGFP™ Vector, Nucleofector™ Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette™ Strips |
| Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
| Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9 Nuclease |
| DNeasy® Blood & Tissue Handbook | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | |
| TGFβ | Biolegend | 580706 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human | Integrated DNA Technologies | 1072554 | Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer. |
| IDTE pH 7.5 (1X TE Solution) | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | Cas9 Electroporation Enhancer |
References
- Guven, H., et al. Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction. Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).
- Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. Retroviral gene transfer into primary human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 508, 127-137 (2009).
- Carlsten, M., Childs, R. W. Genetic Manipulation of NK Cells for Cancer Immunotherapy: Techniques and Clinical Implications. Frontiers in Immunology. 6, 266 (2015).
- Mehta, R. S., Rezvani, K. Chimeric Antigen Receptor Expressing Natural Killer Cells for the Immunotherapy of Cancer. Frontiers in Immunology. 283, 9 (2018).
- Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
- Wang, M., et al. Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles. PNAS. 113 (11), 2868-2873 (2016).
- Liang, Z., et al. Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 8, 14261 (2017).
- DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein. Methods. , 9-15 (2017).
- Rezvani, K., Rouce, R., Liu, E., Shpall, E. Engineering Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy. Molecular Therapy. 25 (8), 1769-1781 (2017).
- Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Human Gene Therapy. 23 (10), 1090-1100 (2012).
- Viel, S., et al. TGF-beta inhibits the activation and functions of NK cells by repressing the mTOR pathway. Science Signaling. 9 (415), (2016).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. JoVE. (48), (2011).
- Lee, D. A., Verneris, M. R., Campana, D. Acquisition, preparation, and functional assessment of human NK cells for adoptive immunotherapy. Methods in Molecular Biology. , 61-77 (2010).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), Bethesda. 407-415 (2015).
- Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
- Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Chmielecki, J., et al. Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra. Cancer Research. 77 (2), 509-519 (2017).
- Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors. Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).
