Summary
여기, 선물이 유전자 Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs)를 사용 하 여 기본 또는 확장 된 인간의 자연 킬러 (NK) 세포를 수정 하는 프로토콜. 이 프로토콜을 사용 하 여 인간 NK 세포 성장 인자-b 수용 체 2를 변형 (TGFBR2) 및 hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1)에 대 한 결핍을 생성 했습니다.
Abstract
CRISPR/Cas9 기술 많은 세포 유형, 하지만 지금까지 유전자 배달에 게놈 엔지니어링 가속 되 고 안정적인 유전자 수정 기본 NK 세포에 도전 되었습니다. 예를 들어 transgene 배달 lentiviral 또는 retroviral 변환을 사용 하 여 실질적인 절차 관련 된 NK 세포 apoptosis 때문 NK 세포 유전자 조작의 제한 된 수율 결과. 여기 Cas9 ribonucleoprotein 복합물 (Cas9/RNPs)를 사용 하 여 인간의 기본 및 확장 된 NK 세포의 게놈 편집용 DNA 무료 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 TGFBR2 와 의 효율적인 녹아웃 NK 세포에 HPRT1 유전자 허용. RT-PCR 데이터 유전자 식 수준에 중요 한 감소 그리고 대표적인 셀 제품의 세포 독성 분석 실험 제안 RNP 수정 NK 세포 TGFβ에 덜 민감한 되었다. 유전자 변형된 세포 조사 mbIL21 표현 된 자극에 의해 확장 된 게시물 electroporation 수 지류 세포.
Introduction
암 immunotherapy 최근 몇 년 동안에서 고급 되었습니다. 유전자 변형 공상 항 원 수용 체 (자동차) T 세포는 암 immunotherapy에 성공적으로 배포 하는 설계 된 면역 세포의 훌륭한 예입니다. 이 셀 최근에 대 한 처리를 위한 FDA에 의해 승인 되었다 CD19 + B 세포 악성 종양, 하지만 성공 지금까지 몇 대상 항, 베어링 질병에 국한 되었으며 같은 제한 된 항 원 레파토리를 대상으로 하는 것은 면역 탈출 하 여 실패 하는 경향이. 또한, 자동차 T 세포 이식-비교-호스트 질병 수용자 T 세포에 의해 발생의 헌 T 세포의 사용에 집중 되었습니다 했다. 반면, NK 세포는 종양 표적 항 원 독립적인 방식으로 죽 일 수 있으며 GvHD, 그들에 게 암 immunotherapy6,7,,89에 대 한 좋은 후보를 발생 하지 않습니다.
CRISPR/Cas9 기술 최근 엔지니어링 면역 세포에서 사용 되었습니다 하지만 NK 세포는 플라스 미드 유전자 재프로그래밍 항상 도전 하고있다. 이것은 lentiviral 및 retroviral 변환 상당한 절차 관련 된 NK 세포 apoptosis와 유전자 조작된 NK 세포4 의 제한 된 생산 유발 등 DNA 의존 방식에서 transgene 배달에 어려움으로 인해 되었습니다. , 9.
많은 타고 난 면역 세포 표현 병원 체 관련 된 분자 패턴에 대 한 수용 체의 상부와 같은 Retinoic 산을 유도할 수 있는 유전자 나 (장비-난), 어떤 외국 DNA의 과장 된 인식의 사용. 유전 수정10DNA 기반 방법을 사용 하 여 때 이러한 통로의 억제 NK 세포에 더 높은 변환 효율을 수 있게 되었습니다.
여기는 DNA 무료 게놈의 편집 기본 및 확장 된 인간 NK 세포 Cas9 ribonucleoprotein 복합물 (Cas9/RNPs)를 활용 하 여 사용 하기 위한 방법을 설명 합니다. Cas9/RNPs는 세 가지 구성 요소, 재조합 Cas9 단백질에 complexed 합성 단일 가이드 RNA complexed crRNA와 tracerRNA의 구성으로 이루어져 있습니다. 이러한 Cas9/RNPs 기능 복합물으로 그들의 배달으로 인해 외국 DNA 종속 접근 높은 효율으로 게놈 목표를 고착 할 수 있다. 또한, Cas9/RNPs 세포에서의 신속한 통관 apoptosis 유도 등 대상 오프 효과 줄일 수 있습니다. 따라서, 그들은 노크-아웃, 또는 동종 재결합6,7에 대 한 DNA와 결합 될 때 노크 기능 생성을 사용할 수 있습니다. 우리는 Cas9/RNPs의 그 electroporation 보였다 NK 세포에서 유전자 조작의 이전 제약을 극복 하는 간단 하 고 비교적 효율적인 방법입니다.
TGFβ는 활성화 및 NK 세포의 기능을 억제 하는 주요 면역 억제 사이토카인 이다. 그것은 TGFβ 통로 대상으로 면역 세포 기능을 높일 수 있습니다 제안 되었습니다. 우리 TGBR2 ectodomain TGFβ11. 을 바인딩하는 인코딩 지역 대상 대표 결과이 유전자의 mRNA 발현의 수준에 상당한 감소를 표시 하 고 추가 수정 된 NK 세포가 TGFβ에 저항력이 될 입증. 또한, 수정 된 셀 유지 생존 및 증식 잠재력, 그들은 확장 된 게시물 electroporation에 비친된 피더 세포. 을 사용 하 여 될 수 있다 따라서, 다음 메서드는 유전자에 대 한 NK 세포를 조작 하는 유망한 접근 방식을 추가 임상 또는 연구 목적.
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Protocol
건강 한 기증자 버 피 코트에서 중앙 오하이오 지역 미국 적십자 소스 자료로 얻은 했다. 이 연구는 제도적 검토 보드의 전국 어린이 병원으로 면제 연구 될 결정 했다.
1. 인간 NK 세포 정화 및 확장
- 버 피 코트12에서 PBMCs를 격리 합니다.
- 35 mL Ficoll-Paque의 15 mL에 버 피 코트 샘플의 레이어.
- 브레이크 없이 20 분에 대 한 400 x g에서 centrifuge 고 인터페이스에서에서 PBMC를 수집 합니다.
- PBS의 적어도 동등한 볼륨을 추가 하 여 복구 된 PBMCs 세 번 씻고, 400 x g에서 5 분간 centrifuging와 PBC 발음 세척. NK 세포 RosettesSep13이 단계에서 격리 된 수 있습니다.
- 비친 10 x 106 mbIL21-표현으로 자극 하 여 NK 세포를 확장 급지대 셀 0, 7, 14 일에. 10%를 포함 하는 신선한 RPMI 미디어 바꿉니다 FBS, 1% 글루타민, 1% 페니실린 스, 그리고 100 IU/mL의 일리노이-2 전체 미디어 볼륨 매일.
2. gRNA 디자인 및 선택
- 대상, 온라인 도구, 예를 들면, NCBI, 앙상블을 사용 하 여 특정 게놈 loci를 선택 하십시오.
예를 들어.
설명: 변형 시키는 성장 인자 beta 수용 체 2 (TGFBRR2) ectodomain
기록 보기: PF08917
InterPro 보기: IPR015013
위치: 49-157 aa
대상된 시퀀스: 엑손 TGFBR2 유전자 (ENSG00000163513)의 4 - 디자인은 gRNAs, http://crispr.mit.edu 등 'Benchling' CRISPR 디자인 웹 도구 사용 하 여
- 2.1 단계에서 선택 하는 DNA 순서에 입력 합니다. 대상 게놈으로 인간 (hg 19)를 선택 합니다. CRISPR 가이드 (20 뉴클레오티드 팸 시퀀스 다음: NGG) 앞에서 입력 한 시퀀스에서 검색 됩니다. 그것은 또한 선택 된 게놈을 통해 가능한 오프 대상 일치를 표시합니다.
- 최고의 3 gRNAs는 그들의 표적에 및 오프 대상 요금에 따라 가장 높은 점수를 선택 하십시오. 예를 들어 표 1 exon TGFBR2 유전자의 4 CRISPR 디자인 웹 도구에 의해 제안 된 대상으로 설계 된 CRISPR RNAs를 보여준다.
- 합성 순서 특정 crRNAs로 CRISPR RNAs를 주문.
- 보존, 주문 transactivating RNA (tracrRNA)는 crRNA와 부분 homology를 통해 상호 작용.
3. 디자인 삭제 뇌관을 심사
- T7E1 돌연변이 분석 결과 대 한 gRNA 분열 사이트를 확장 하는 뇌관 디자인.
- SgRNA 대상 사이트에서 작은 삽입-삭제 (indels) 되도록 예측된 분열 사이트에서 사용 뇌관 최소한 100 bp 돌연변이 분석 결과 따라 1.5 %agarose 젤에 표시 됩니다. 표 2 에서는 TGFBR2 ectodomain를 증폭 하는 데 사용 되는 뇌관을 보여 줍니다.
4. 인간의 기본 및 확장 된 NK 세포의 변환
참고: NK에 Cas9/RNPs 요소의 변환 electroporation 4d 시스템을 사용 하 여 다음과 같이 하면 됩니다.
-
셀 준비
- 기본 NK 세포에 대 한, 갓 고립 된 NK 세포 RPMI 매체 100 IU/mL 일리노이-2의 앞에 4 일 동안 품 어 하 고 하루 5 electroporation를 수행 합니다. 앞서 고 하루 변환 전에 설명한 대로 매일 미디어를 교체 합니다.
- 확장 된 NK 세포에 대 한, 하루 0 1: 1의 비율로 조사 피더 세포에서 세포를 자극 하 고 하루 5 또는 6 또는 7에서 electroporation를 수행 합니다. 앞서 고 하루 변환 전에 설명한 대로 매일 미디어를 교체 합니다.
- Electroporation 당일 100 IU/mL electroporation 및 습도 37 ° C, 5% CO2 인큐베이터에서 미리 incubate 플라스 크 셀 일리노이-2 포함 하는 신선한 RPMI의 8 mL 가득 T25 플라스 크를 준비 합니다.
참고: 해 동된 셀 이나 2차 또는 3rd 자극 받은 셀 수 있다 electroporated 설명 된 대로 복구 후 언제 든 지. - 변환 믹스의 26 µ L에 대 한 조건 당 3-4 × 106 셀을 가져가 라.
참고: Electroporation 솔루션에서 NK 세포의 매우 높은 농도 변환 속도를 향상 시킵니다. - 3 번 RNase 활동을 일반적으로 포함 된 모든 FBS를 제거 하려면 PBS 가진 세포를 씻어. 8 분 동안 300 x g에서 매번 그들을 회전 합니다.
참고: 7 electroporation Cas/RNPs에 대 한 단일 gRNA (gRNA1, gRNA2, gRNA3)로 및 2 개의 gRNAs (gRNA1 gRNA2, gRNA1 gRNA3, gRNA2 + + gRNA3)의 조합 및 아무 Cas9/RNPs 한 컨트롤을 고려 하십시오.
-
crRNA:tracerRNA을 형성 / 복잡 한
- 200 μ M의 최종 농도에 테 솔루션 x 1에서 crRNAs (gRNA1, gRNA2, 및 gRNA3) 및 tracerRNA resuspend. 표 3에서 같이 200 μ M tracerRNA와 함께 각 200 μ M gRNA의 혼합 2.2 μ.
- 샘플 5 분 동안 95 ° C에가 열 하 고 상 온 (15-25 ° C)를 벤치 위에 시원한 수 있습니다. 스토어 resuspended RNAs 및 crRNA: 나중 사용을 위해-20 ° C에서 tracerRNA/복잡 한.
-
RNP 복잡 한 형성
참고: 시간을 절약 하는 세척 동안 복잡 한 RNP 형성 단계 4.1.5.- 단일 crRNA:tracrRNA 이중 반응, 표 4에 있는 예제에서와 같이 36 μ M에 Cas9 endonuclease 희석.
- CrRNA:tracrRNA duplexes의 조합 변환, 희석 36 μ M에 Cas9 endonuclease에 예제에서와 같이 표 5.
- 피 펫 팁, 30 이상 소용돌이 동안 천천히 Cas9 endonuclease crRNA:tracrRNA 쌍 신 회로 추가 1 분에 s.
- 15-20 분 동안 실내 온도에 혼합물을 품 어. 경우 부 화 후 혼합물을 사용 하 여 준비 하지, 사용까지 얼음에 혼합물을 유지.
-
Electroporation
- P3 electroporation 솔루션 전체 보충을 추가 하 고 실내 온도에서 보관.
- P3 기본 4 D electroporation 솔루션의 20 μ에 셀 펠 릿 (3-4 × 106 세포 단계 4.1.5)를 resuspend. Pipetting 동안 공기 방울을 피하십시오.
참고: 셀 P3 솔루션에 오랜 시간 동안 하지 맡겨야 한다. - 즉시 세포 현 탁 액에 RNP 복잡 한 (단계 4.3)의 5 µ L를 추가 합니다.
- Cas9/RNPs/셀 100 μ M Cas9 electroporation 증강의 1 μ 믹스를 추가 합니다.
- Cas9/RNPs/셀 믹스 20 μ electroporation 스트립으로 전송 합니다.
- 부드럽게 샘플 스트립의 하단 커버 되도록 스트립을 누릅니다.
- 4 D electroporation 시스템을 시작 하 고 EN-138 프로그램을 선택 합니다.
5. 게시 변환
- 셀 스트립에서 3 분간 휴식 하자.
- 에 베트를 미리 equilibrated 문화 미디어의 80 µ L을 추가 하 고 부드럽게 플라스 크에 샘플을 전송.
- 변환, 후 48 시간 차단 유전자 삭제에 대 한 5 × 105 셀에서 게놈 DNA를 추출 합니다.
- Taq DNA 중 합 효소 키트와 함께 3.2 단계에서 설계 된 프라이 머를 사용 하 여 관심사의 유전자를 증폭.
- T7EI 소화에 대 한 PCR amplicon heteroduplexes를 형성 하 고 37 ° C에 T7EI 효소와 함께 30-60 분에 대 한 제품을 품 어
참고: 분석 결과 그것은 빠르고, 단순 하 고 제공으로 심사에 대 한 선호 T7EI 측량 분석 결과 사용 하 여에 비해 전기 영동 결과 청소 합니다. 그러나,이 방법은 삽입 및 삭제를 검색할 수 없습니다 < 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 활동 Cas9 RNPs 실험14에 의해 생성 되는 2 기지. - 1.5%에 소화 DNA를 실행 agarose 젤 110 V 30 ~ 45 분, 15 분 마다 시각화 젤.
- MbIL21 표현으로 셀의 나머지 부분을 자극 1: 1의 비율로 피더 세포.
- 자극 후 5 일 정량 Pcr를 사용 하 여 유전자 식 수준에 대 한 RNA를 추출 합니다.
- 이전에 보고 된12calcein 분석 실험을 실시 합니다. 간단히, calcein 오전 (예, 3 µ g/mL/1000000 DAOY 셀 사용)에서 대상 셀을 로드 합니다. IL2에 밤새 껏 휴식 하 여 NK 세포 세포 독성 분석 실험에 대 한 준비 (100 IU/mL) 10 ng/mL 전후로 용 해 TGFβ. NK 세포는 하룻밤에 휴식 했다로 동일한 cytokines에 calcein 분석 실험을 실시 합니다.
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Representative Results
Electroporation 효율
Cas9/RNPs의 electroporation 최적화, GFP 비 대상으로 siRNA와 DNA 플라스 미드의 NK 세포로 변환 된 16 가지 프로그램 테스트. 교류 cytometry 분석 결과 엉-138 셀 생존 및 변환 효율 (35% 라이브 GFP 긍정적인 세포) (그림 1 및 그림 2) 두 입자의 높은 비율을 했다 보여주었다. 흥미롭게도,이 프로그램을 사용 하 여 Cas9/RNPs electroporation에 대 한 효율성 높은 우리가 본 TGFBR2 mRNA 식 수준 (그림 5)에서 60% 감소 했다. 또한, 유전자 변형된 NK 세포 성장 하 고 확장에 대 한 일 cryopreserved (데이터 표시 되지 않음) 될 수 있습니다.
변이 분석 결과
Cas9/RNPs gRNA3 + gRNA2, gRNA1, gRNA2를 포함 하는 성공적인 TGFBR2 ectodomain 유전자 녹아웃, 했지만 gRNA1 혼자 어떤 T7E1 감지 indels (그림 3)을 하지 않았다. 또한, 그림 4 상업적으로 사용 하 여 확장 된 인간 NK 세포에 인간 HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1) 의 녹아웃 제공 gRNAs 성공적으로 나타냅니다. 밴드 densitometry 따라 비례 indel 요금 gRNA1 + gRNA2를 사용 하 여 결과 34% 밴드 TGFBR2 수정 NK 세포에 대 한, gRNA3에 대 한 25%와 81 %HPRT 유전자에 대 한 수정 NK 세포.
진 식 수준 분석 결과
우리의 결과의 대표로, 그림 5 는 TGFBR2 ectodomain, RT-PCR에 의해 분석의 mRNA 생산 수준에 Cas9/RNPs (gRNA1 + gRNA2)의 효과 보여줍니다. 그래프에서 보듯이 타겟된 유전자의 mRNA 식 수준이 크게 감소.
세포 독성
Cas9/RNPs TGFβ1, DAOY 세포; 공동 교양 있는 셀 수정 gRNA1 + gRNA2, gRNA2 및 gRNA3 잠복기 후 그림 6에서 보듯이 수정 된 셀 일리노이-2 미디어에서 하룻밤 했다 컨트롤 그룹에 비해 그들의 세포 독성 수준에 어떤 중요 한 감소를 보여주지 않았다. 이 결과 Cas9/RNPs 수정 셀 TGFβ1와 수정된 셀 TGFβ1 저항 된 쇼의 그들의 세포 독성 기능을 유지 하는 방법을 보여 줍니다.
그림 1. 이러한 수치 표시 siRNA와 플라스 미드 DNA의 electroporation 효율 엉-138 프로그램을 사용 하 여 NK 세포에 GFP를 표현. 여기 본, NK 세포 생존 능력은 77.5%, 및 35% 라이브 셀의 GFP를 긍정 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2. 이 그림에 생존 능력의 그리고 효율성 16 프로그램 (DN-100) electroporation 최적화에 대 한 테스트의 하나입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3. Cas9/RNPs-중재 TGFBR2 녹아웃 팽창한 (a) 1 차 NK 세포 (b) T7E1 돌연변이 시험에 의해 측정. T7E1 효소는 인식 하 고 일치 하지 않는 DNA를 앞. 각 작은 밴드 (파란색 화살표)는 indel 수행 소화 DNA 조각을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4. Cas9/RNPs-T7E1 돌연변이 시험에 의해 측정 하는 확장 된 NK 세포에 HPRT 장애 중재. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5. CRISPR에서 TGFBR2 ectodomain의 mRNA 식 수준 수정 Cas9/RNPs (gRNA1 + gRNA2)에 의해 도입 된 NK 세포 RT-PCR를 사용 하 여. GAPDH 생 제어 유전자로 사용 되었다. RNA 수준에 감소 TGFBR2 유전자의 파괴를 나타냅니다 (± SEM을 의미 P 값 < 0.0001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6. a. Cas9/RNPs의 대표 샘플을 사용 하 여 세포 독성 분석 결과 수정 (gRNA1 + gRNA2, gRNA2, 및 gRNA3) NK 세포 쇼는 TGFβ1에 포함 된 셀의 하룻밤 인큐베이션 감소 하지 않습니다 크게 DAOY 세포를 lyse 그들의 능력. b. 비 수정 NK 세포, Cas9/RNP 수정된 NK 세포 (gRNA2 및 gRNA3)에 비해 TGFβ1에 덜 민감합니다 (± SEM을 의미). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| gRNA 호 | gRNA 시퀀스 | 합성 crRNA로 주문 | |||||
| gRNA1 | 5 CCCCTACCATGACTTTATTC 3 | / AltR1/rArGrUrCrArUrGrGrUrArGrGrGrGrArGrCrUrUrGrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArUrGrCrU/AltR2 / | |||||
| gRNA2 | 5 ATTGCACTCATCAGAGCTAC 3 | / AltR1/rArUrUrGrCrArCrUrCrArUrCrArGrArGrCrUrArCrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArUrGrCrU/AltR2 / | |||||
| gRNA3 | 5 AGTCATGGTAGGGGAGCTTG 3 | / AltR1/rArG rUrCrA rUrGrG rUrArGrGrGrG rArGrC rUrUrG rGrUrUrUrUrA rGrArG rCrUrA rUrGrCrU/AltR2 / | |||||
표 1입니다. 3 gRNAs 합성 crRNA로 TGFBR2 ectodomain의 exon 4를 대상으로 설계 되었습니다.
| TGFBR 2 ectodomain 뇌관 FWD | 5 GTC TGC TCC AGG TGA TGT TTA T3 |
| TGFBR2 ectodomain 뇌관 레 브 | 5 GGG CCT AAT CTG 고양이 온 3 개 그 |
표 2입니다. TGFBR2 ectodomain 유전자를 증폭 하는 데 사용 하는 뇌관
| 구성 요소 | 금액 (uL) |
| 200 µ M crRNA | 2.2 |
| 200 µ M 추적 RNA | 2.2 |
| IDTE 버퍼 | 5.6 |
| 최종 제품 | 10 |
표 3입니다. 형태는 crRNA:tracerRNA / 200 µ M RNAs를 사용 하 여 복잡 한
| 구성 요소 | 금액 (µ L) |
| PBS | 1 |
| crRNA:tracrRNA (4.2 단계)에서 이중 | 2 (200 pmol) |
| Alt-R Cas9 endonuclease (61 µ M 주식) | 2 |
| 총 볼륨 | 5 ul |
표 4입니다. 단일 crRNA:tracrRNA 이중 반응에 대 한 36 µ m Cas9 endonuclease 희석.
| 구성 요소 | 금액 (µ L) |
| PBS | 1 |
| crRNA:tracrRNA 이중 (예: gRNA1) | 1 (100 pmol) |
| crRNA:tracrRNA 이중 (예: gRNA2) | 1 (100 pmol) |
| Alt-R Cas9 endonuclease | 2 |
| 총 볼륨 | 5 Μ L |
표 5입니다. CrRNA:tracrRNA duplexes의 조합 변환에 대 한 36 µ m Cas9 endonuclease 희석.
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Discussion
NK 세포의 DNA-종속 수정4,9도전 하고있다. 우리는, 따라서, 도입 직접 종합적으로 미리 형성한 ribonucleoprotein (RNPs) 복잡 하 고 Cas9 단백질 순화 된 단백질으로 기본 및 확장 된 NK 세포8로. 이 방법은 미행, 상한, 제거를 허용 하 고 다른 transcriptional 및 변환 프로세스는 RNA 중 합 효소 II는 DNA 의존 변환 메서드에 연결 된 NK 세포 apoptosis를 발생할 수 있습니다 의해 시작.
또한, 보고 하는 방법 여기 사용 순화 Cas9 단백질에 complexed electroporation 직후 활성화 하 고 신속 하 게, 그로 인하여 증가에 대상 및 현재 프로토콜을 통해 감소 하는 대상에서 효과 저하는 Cas9/RNPs 5 , 6 , 7 , 16. 또한, 높은 효율으로 Cas9/RNP transduce 새로운 electroporation 접근을 최적화는 여기 소개 하는 또 다른 중요 한 단계는 관심의 다른 유전자에 적용 됩니다. 이 방법은 상용 큰 electroporation 큐 벳 (데이터 표시 되지 않음)를 사용 하 여 NK 세포의 큰 숫자의 수정에 대 한 확장할 수 있습니다.
요약 하자면, Cas9/RNPs 유전자 수정 암 immunotherapy 위의 설명된 방법을 활용에 대 한 인간의 기본 및 확장 된 NK 세포를 사용할 수 있습니다. 우리의 결과 또한 TGFBR2 ectodomain 유전자의 성공적인 녹아웃 되는 저항 하는 TGFβ111이 수정 된 NK 세포를 리드 설명 했다.
RNP 배달 템플릿 (예: 자연스럽 게 recombinogenic adeno 관련 바이러스 (AAV) 기증자 벡터) DNA의 소스와 결합 하 여 동종 재결합3,,1819 사이트 관련 유전자 삽입 사용 .
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Disclosures
DAL 에서는/택배 치료제, 흑 요 석 치료제, Intellia 치료제, 머 크 연구소, 및 Miltenyi Biotec 컨설턴트 역임 했다와 주식/리더십 CytoSen 치료제에 합니다.
Acknowledgments
우리는 원고 편집에 그의 친절 한 도움에 대 한 브라이언 툴 리를 인정 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15065 | The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection. |
| Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare - Life Sciences | 17-1440-02 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | Synthetically produced as Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest | |
| Alt-R® Genome Editing Detection Kit | Integrated DNA Technologies | 1075931 | Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls. |
| Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304-011 | |
| 4D-Nucleofector™ System | Lonza | AAF-1002B | |
| Human recombinant IL-2 Protein | Novartis | 65483-0116-07 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit | Lonza | V4XP-3032 | Contains pmaxGFP™ Vector, Nucleofector™ Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette™ Strips |
| Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
| Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9 Nuclease |
| DNeasy® Blood & Tissue Handbook | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | |
| TGFβ | Biolegend | 580706 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human | Integrated DNA Technologies | 1072554 | Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer. |
| IDTE pH 7.5 (1X TE Solution) | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | Cas9 Electroporation Enhancer |
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