Génération des cellules de knock-out primaire et élargi NK humaine à l’aide de Cas9 ribonucléoprotéines

Résumé

Nous présentons ici un protocole visant à modifier génétiquement les cellules primaires ou agrandis humaines tueuses naturelles (NK) à l’aide de Cas9 ribonucléoprotéines (Cas9/RNP). En utilisant ce protocole, nous avons généré des cellules NK humaines déficients pour transformer le récepteur du facteur de croissance – b 2 (TGFBR2) et de l’hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Résumé

CRISPR/Cas9 technologie s’accélère génie de génome dans plusieurs types de cellules, mais jusqu'à présent, livraison de gène et gène stable modification ont été difficiles dans les cellules NK primaires. Par exemple, livraison de transgene en utilisant des gènes ou retroviral transduction a entraîné un rendement limité de cellules NK par génie génétique en raison de l’apoptose des cellules NK associée à procédure substantiel. Nous décrivons ici une méthode sans ADN pour l’édition de génome de cellules NK primaires et élargis humaines utilisant des complexes ribonucléoprotéiques Cas9 (Cas9/RNP). Cette méthode a permis knockout efficace des TGFBR2 et HPRT1 de gènes dans les cellules NK. Les données de RT-PCR ont montré une diminution significative du niveau d’expression de gène, et un essai de cytotoxicité d’un produit de cellules représentant a suggéré que les cellules NK RNP modifiés sont devenus moins sensibles aux TGFβ. Des cellules génétiquement modifiées pourraient être élargi post-électroporation de stimulation avec irradiés mbIL21 exprimant des cellules nourricières.

Introduction

Immunothérapie contre le cancer a progressé ces dernières années. Les cellules de T de récepteurs (voiture) antigène chimérique génétiquement modifiés sont un excellent exemple de cellules immunitaires machinés, déployé en immunothérapie contre le cancer. Ces cellules ont été récemment approuvés par la FDA pour le traitement contre CD19 + B des cellules malignes, mais succès a été jusqu'à présent limitée aux maladies portant quelques antigènes targetable et ciblant ces répertoires antigéniques limitées est sujette à l’échec par évasion immunitaire. En outre, les cellules T de voiture ont surtout portés sur l’utilisation de cellules autologues de T en raison du risque ....

Protocole

Manteaux de buffy donneur sain ont été obtenues comme matériel de base de la Central Ohio région Croix Rouge américaine. Cette recherche a été jugée recherche exonéré par l’institutionnel Review Board de dans tout le pays hôpital pour enfants.

1. expansion et Purification de cellules NK humaines

1. Isoler les PBMC du¹²de la couche leuco-plaquettaire.
   1. 35 mL d’échantillon de la couche leuco-plaquettaire sur 15 mL de Ficoll-Paque de couche.
   2. Centrifuger à 400 x g pendant 20 minutes sans frein et recueillir le PBMC de l’interface.
   3. Laver les PBMC récupérés trois fois en ajoutant au moin....

Résultats

Efficacité d’électroporation

Pour optimiser l’électroporation de Cas9/RNP, nous avons testé 16 programmes différents avec transduction de GFP ne pointeraient siRNA et plasmides d’ADN dans les cellules NK. Dosage de cytométrie en flux ont montré que le fr-138 le plus fort pourcentage de viabilité et transduction efficacité des cellules (35 % GFP positive des cellules vivantes) pour les deux particules (

Discussion

Modification de l’ADN-dépendante des cellules NK a été difficile de^4,9. Nous, donc, introduit directement un complexe synthétique préformé ribonucléoprotéines (RNP) et Cas9 protéine comme la protéine purifiée dans primaire et élargi de cellules NK⁸. Cette méthode nous a permis d’éliminer le plafonnement, équeutage, et autres processus de transcriptionnelles et translationnelles a commencé par l’ARN polymérase II, ce qui peut provoquer l’ap.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
RosetteSep&commerce ; Cocktail d’enrichissement des cellules NK humaines	STEMCELL Technologies	15065	La RosetteSep&trade ; Le cocktail d’enrichissement en cellules NK humaines est conçu pour isoler les cellules NK du sang total par sélection négative.
Ficoll-Paque® ; PLUS	GE Healthcare - Sciences de la vie	17-1440-02
Alt-R® ; Les	technologies intégrées d’ADN	1072532	TracrRNA qui contient des modifications chimiques exclusives conférant une résistance accrue aux nucléases. S’hybride en ARNcr pour activer l’enzyme Cas9
Alt-R® ; CRISPR-Cas9 crRNA Integrated	DNA Technologies		Produit synthétiquement sous forme de Alt-R® ; L’ARNcr CRISPR-Cas9, basé sur la séquence de l’ARNg conçu ciblant le gène de l’intérêt
Alt-R® ; Technologies	d’ADN intégrées	1075931	Chaque kit contient des commandes d’endonucléase T7EI, de tampon de réaction T7EI et de contrôle de test T7EI.
Platine® ; Taq ADN polymérase haute fidélité	Invitrogen	11304-011
4D-Nucleofector&commerce ; Système	Lonza	AAF-1002B
Protéine IL-2 recombinante humaine	Novartis	65483-0116-07
P3 Cellule primaire 4D-Nucleofector&trade ; X Kit	Lonza	V4XP-3032	Contient pmaxGFP&trade ; Vecteur, Nucleofector&Trade ; Solution, Supplément, Nucléocuvette 16 puits&Trade ; Bandelettes
non ciblées : siRNA personnalisé, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus	Dharmacon	CTM-360019
Alt-R® ; S.p. Cas9 Nucléase 3NLS	Integrated DNA Technologies	1074181	Cas9 Nucléase
DNeasy® ; Sang & Manuel des tissus	Qiagen	69504
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Calcein AM	ThermoFisher	C3099
TGF&beta ;	Biolegend	580706
Alt-R® ; Kit de contrôle CRISPR-Cas9,	technologies d’ADN humain intégrées	1072554	Comprend l’ARNtracr, l’ARNcr à contrôle positif HPRT, l’ARNcr#1 à contrôle négatif, le mélange d’amorces HPRT et le tampon duplex sans nucléase.
IDTE pH 7.5 (solution 1X TE)	Technologies d’ADN intégrées	11-01-02-02
Alt-R® ; Amplificateur d’électroporation	Cas9 Technologies d’ADN intégrées	1075915	Amplificateur d’électroporation Cas9

CRISPR-Cas9 tracrRNA