Summary
Her presenterer vi en protokoll for genetisk endre primær eller utvidet menneskets naturlige killer (NK) celler ved hjelp av Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). Bruker denne protokollen, generert vi menneskelige NK celler mangelfull for omforming vekst faktor-b reseptor 2 (TGFBR2) og hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).
Abstract
CRISPR/Cas9 teknologi er akselererende genomet engineering i mange celletyper, men så langt, gen levering og stabil genet modifikasjon har vært utfordrende i primære NK celler. For eksempel resulterte ved lentiviral eller retroviral signaltransduksjon transgene levering i en begrenset avkastning av genmodifiserte NK celler på grunn av betydelig prosedyre-assosiert NK celle apoptose. Her beskriver vi en DNA-fri metode for genomet redigering av menneskelig primære og utvidet NK celler ved hjelp av Cas9 ribonucleoprotein komplekser (Cas9/RNPs). Denne metoden tillatt effektiv knockout av TGFBR2 og HPRT1 gener i NK celler. RT PCR data viste en signifikant nedgang i gene expression nivå, og en cytotoksisitet analysen representant celle produktet foreslo at RNP endret NK cellene ble mindre følsomme til TGFβ. Genmodifiserte celler kan være utvidet innlegg-electroporation ved stimulering med bestrålt mbIL21-uttrykke mater celler.
Introduction
Kreft immunterapi har vært avanserte i de siste årene. Genetisk endret chimeric antigen reseptor (bil) T-celler er et utmerket eksempel på utvikling immunceller distribuert i kreft immunterapi. Disse cellene var godkjent av FDA for behandling mot CD19 + B celle malignitet, men suksess hittil vært begrenset til sykdommer bærer noen targetable antigener og målretting slik begrenset antigen repertoar er utsatt for svikt immun flukten. Videre har bil T celler vært fokusert på bruk av autologous T-celler på grunn av risikoen for graft - versus - host sykdom forårsaket av allogene T-celler. I kontrast, NK celler kan drepe svulst mål i en antigen-uavhengig måte og forårsaker ikke GvHD, noe som gjør dem en god kandidat for kreft immunterapi6,7,8,9.
CRISPR/Cas9 teknologien har vært brukt nylig i engineering immunceller, men genetisk omprogrammering NK celler med plasmider har alltid vært utfordrende. Dette er på grunn av problemer i transgene levering på en DNA avhengige måte som lentiviral og retroviral signaltransduksjon forårsaker betydelig prosedyre-assosiert NK celle apoptose og begrenset produksjon av genmodifiserte NK celler4 , 9.
Mange medfødte immunceller express høye nivåer av reseptorer for patogen-forbundet molekylær mønster som Retinoic acid-induserbart genet jeg (RIGG-jeg), som aktiverer økt anerkjennelse av utenlandske DNA. Undertrykkelse av disse veiene har aktivert høyere signaltransduksjon effektivitet i NK celler ved DNA-baserte metoder for genetisk modifisering10.
Her beskriver vi metoden for å bruke en DNA-fri genomet redigering av primære og utvidet menneskelige NK celler utnytte Cas9 ribonucleoprotein komplekser (Cas9/RNPs). Cas9/RNPs består av tre komponenter, rekombinant Cas9 protein kompleksbundet med syntetisk single-guide RNA består av en kompleksbundet crRNA og tracerRNA. Disse Cas9/RNPs er stand til å spalte genomisk mål med høyere effektivitet sammenlignet med utenlandske DNA-avhengige tilnærminger på grunn av deres leveringsmidler som funksjonell komplekser. I tillegg kan rask klarering av Cas9/RNPs fra cellene redusere effekten av mål som induksjon av apoptose. Dermed kan de brukes til å generere fortrenging eller knock-ins kombinert med DNA for homologe rekombinasjon6,7. Vi viste at electroporation av Cas9/RNPs er en enkel og relativt effektiv metode som overvinner foregående begrensninger av genmodifisering i NK celler.
TGFβ er en stor suppressive cytokin, som hemmer aktivisering og funksjoner av NK celler. Det har blitt foreslått at målretting TGFβ veien kan øke immunforsvaret celle funksjoner. Vi målrettet regionen koding TGBR2 ectodomain som binder TGFβ11. Representant resultatene viser en betydelig reduksjon i nivået av mRNA uttrykk for dette genet og ytterligere demonstrere at endrede NK cellene blir motstandsdyktig mot TGFβ. I tillegg beholde de endrede cellene levedyktighet og proliferativ potensial, som de kunne være utvidet innlegg-electroporation benytter bestrålt mater celler. Derfor følgende metode er en lovende tilnærming til genetisk manipulere Celler NK for ytterligere kliniske eller forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Frisk donor buffy strøk ble innhentet som kildemateriale fra Central Ohio regionen amerikanske Røde Kors. Denne forskningen ble bestemt å være fritatt forskning av institusjonelle gjennomgang styret av landsomfattende barnesykehus.
1. menneskelige NK celle rensing og utvidelse
- Isolere PBMCs fra Buffy pels12.
- Lag 35 mL buffy pels prøve på 15 mL av Ficoll-Paque.
- Sentrifuge 400 x g i 20 minutter uten brems og samle PBMC fra grensesnittet.
- Vask de gjenopprettede PBMCs tre ganger ved å legge til minst en lik mengde PBS, sentrifugering 400 x g i 5 minutter og aspirating Playback Control vask. NK celle kan være isolert på dette stadiet av RosettesSep13.
- Utvide NK celler ved å stimulere med bestrålt 10 x 106 mbIL21-uttrykke mater celler dager 0, 7 og 14. Erstatte media med fersk RPMI som inneholder 10% FBS, 1% glutamin, 1% Penicillin Streptomycin og 100 IU/mL av IL-2 for hele media volumet annenhver dag.
2. gRNA Design og utvalg
- Velg de spesifikke genomisk loci å målrette, bruke nettet verktøy, f.eks NCBI, Ensemble.
Eksempel.
Beskrivelse: Transformasjon av vekstfaktor beta reseptor 2 (TGFBRR2) ectodomain
Se post: PF08917
Vis InterPro: IPR015013
Stilling: 49-157 aa
Målrettet sekvens: Ekson 4 av TGFBR2 genet (ENSG00000163513) - Design av gRNAs, bruk CRISPR design webverktøy som http://crispr.mit.edu og "Benchling."
- Angi i DNA sekvensen valgt i trinn 2.1. Velg menneskelige (hg 19) som et mål genom. CRISPR guider (20 nukleotider etterfulgt av en PAM sekvens: NGG) vil bli skannet fra sekvensen lagt inn tidligere. Den viser også mulig off-målet kamper gjennom valgte genomet.
- Velge de beste tre gRNAs som har den høyeste poengsummen, basert på deres på målet og off-målet priser. Tabell 1 viser for eksempel det designet CRISPR RNAs å målrette ekson 4 av TGFBR2 genet foreslått av CRISPR webverktøy.
- Bestille CRISPR RNAs som syntetisk sekvens-spesifikke crRNAs.
- Bestille en bevart, transactivating RNA (tracrRNA) for å kommunisere gjennom delvis homologi med crRNA.
3. design sletting Screening primere
- Design primere spenner gRNA cleavage nettstedene for T7E1 mutasjon analysen.
- Bruk primere minst 100 bp fra webområdet spådd cleavage slik liten innsetting sletting (indeler) på målområdet sgRNA vises på 1,5% agarose gel etter mutasjon analysen. Tabell 2 viser primerne som brukes til å forsterke TGFBR2 ectodomain.
4. signaltransduksjon menneskelige primære og utvidet NK celler
Merk: Albin på Cas9/RNPs elementer i NK er gjort av electroporation bruker 4D system som følger.
-
Celle Forberedelse
- For primære NK celler, ruge fersk isolert NK celler i RPMI medium i nærvær av 100 IU/mL av IL-2 i 4 dager og utføre electroporation på dag 5. Erstatte media annenhver dag som beskrevet tidligere, og dagen før signaltransduksjon.
- For utvidet NK celler, stimulere cellene på dag 0 bestrålt mater cellene i forholdet 1:1 og utføre electroporation dag 5, 6 eller 7. Erstatte media annenhver dag som beskrevet tidligere, og dagen før signaltransduksjon.
- Ved electroporation, kan du forberede en T25 kolbe fylt med 8 mL av fersk RPMI som inneholder 100 IU/mL av IL-2 for cellene gjennomgår electroporation og pre incubate flasker i en fuktet 37 ° C og 5% CO2 inkubator.
Merk: Tinte celler eller celler som har gjennomgått 2nd eller 3rd stimulering kan være electroporated når som helst etter sine utvinning som beskrevet. - Ta 3-4 × 106 celler per betingelse for 26 µL signaltransduksjon mix.
Merk: Svært høy konsentrasjon av NK celler i electroporation løsningen forbedrer signaltransduksjon hastigheten. - Vask cellene 3 ganger med PBS fjerne alle FBS, som vanligvis inneholder RNase aktivitet. Nedspinning dem hver gang på 300 x g i 8 minutter.
Merk: Vurdere 7 electroporation for Cas/RNPs som enkelt gRNA (gRNA1, gRNA2, gRNA3) og en kombinasjon av to gRNAs (gRNA1 + gRNA2, gRNA1 gRNA3, gRNA2 ++ gRNA3) og en kontroll med ingen Cas9/RNPs.
-
Form crRNA:tracerRNA / komplisert
- Resuspend crRNAs (gRNA1, gRNA2 og gRNA3) og tracerRNA i 1 x TE løsning siste konsentrasjoner av 200 μM. Mix 2.2 μL av hver 200 μM gRNA med 200 μM tracerRNA som vist i tabell 3.
- Varme prøvene ved 95 ° C i 5 min og Avkjøl på benk toppen til romtemperatur (15-25 ° C). Store resuspended RNAs og crRNA: tracerRNA/komplekse ved 20 ° C for senere bruk.
-
Danne RNP komplekset
Merk: for å spare tid, danne RNP komplekse under vask trinn 4.1.5.- For enkelt crRNA:tracrRNA dupleks reaksjon, fortynne Cas9 endonuclease til 36 μM som vist av eksemplet i Tabell 4.
- For kombinasjon Albin på crRNA:tracrRNA duplexes, fortynne Cas9 endonuclease til 36 μM som vist av eksemplet i tabell 5.
- Legge til Cas9 endonuclease i crRNA:tracrRNA duplexes sakte mens virvlende pipette tips, over 30 s til 1 minutt.
- Inkuber blandingen i romtemperatur i 15-20 min. Hvis ikke klar til å bruke blandingen etter inkubasjon, holde blandingen på is til bruk.
-
Electroporation
- Legge hele supplement til electroporation løsningen P3 og holde det ved romtemperatur.
- Resuspend celle pellet (3-4 × 106 celler fra trinn 4.1.5) i 20 μL P3 primære 4 D electroporation løsning. Unngå luftbobler mens pipettering.
Merk: cellene skal ikke stå for lenge i P3 løsning. - Umiddelbart legge 5 µL av RNP kompleks (trinn 4.3) til celle suspensjon.
- Legg 1 μL 100 μM Cas9 electroporation enhancer til Cas9/RNPs/cellen blande.
- Overføre Cas9/RNPs/cell blanding i 20 μL electroporation strimler.
- Forsiktig Tapp strimler sørge for at prøven dekker bunnen av strimler.
- Starte 4D electroporation systemet og velg no-138 programmet.
5. innlegg signaltransduksjon
- La cellene hvile i 3 minutter i strimler.
- Legge til 80 µL av pre equilibrated kultur media cuvette og forsiktig overføre prøven i flasker.
- 48 timer etter transduction, ekstra genomisk DNA fra 5 × 105 celler for genet slettingene screening.
- Forsterke genet av interesse med primerne designet i trinn 3.2 med Taq DNA polymerase kits.
- Form PCR amplicon heteroduplexes for T7EI fordøyelsen og ruge produktet i 30-60 minutter med en T7EI enzym i 37 ° C.
Merk: T7EI analysen er foretrukket for screening som det er raskt, enkelt og gir ren geleelektroforese resultater sammenlignet benytter landmåler analysen. Men denne metoden ikke finner innsettinger og slettinger av < 2 baser som genereres av ikke-homologe slutten med (NHEJ) aktivitet i Cas9 RNPs eksperimenter14. - Kjøre fordøyd DNA på 1,5% agarose gel på 110 V i 30-45 minutter, hvert 15 visualisere gel.
- Stimulere resten av cellene med mbIL21-uttrykke mater celler i forholdet 1:1.
- Fem dager etter stimulering ekstra RNA for gene expression nivå ved hjelp av qPCR.
- Utføre calcein analyser som tidligere rapportert12. Kort, laste målcellene med calcein AM (i eksempelet vist, 3 µg/mL/1.000.000 DAOY celler ble brukt). Forberede Celler NK cytotoksisitet analyser ved hvile over natten i IL2 (100 IU/mL) pluss eller minus 10 ng/mL løselig TGFβ. Utføre calcein analyser i samme cytokiner som NK cellene var hvilte i overnatting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Electroporation effektivitet
For å optimalisere electroporation av Cas9/RNPs, testet vi 16 forskjellige programmer med signaltransduksjon GFP ikke målretting siRNA og DNA plasmider i NK celler. Flow cytometri analysen viste at no-138 hadde den høyeste andelen av cellen levedyktighet og signaltransduksjon effektivitet (35% live GFP positive celler) for begge partikler (figur 1 og figur 2). Interessant, var effektiviteten av å bruke dette programmet for Cas9/RNPs electroporation høyere som vi så 60% reduksjon i TGFBR2 mRNA uttrykk nivå (figur 5). I tillegg kunne genmodifiserte NK cellene vokst og utvidet 30 dager og cryopreserved (data ikke vist).
Mutasjon analysen
Cas9/RNPs som inneholder gRNA2, gRNA1 + gRNA2 og gRNA3 hadde vellykket TGFBR2 ectodomain gene knockout, men gRNA1 alene gjør ikke noen T7E1 synlig indeler (Figur 3). I tillegg indikerer Figur 4 vellykket knockout av menneskelig HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1) i utvidet menneskelige NK celler ved hjelp av kommersielt levert gRNAs. Ifølge bandet densitometry, proporsjonal indel priser bruker gRNA1 + gRNA2 resulterte i 34% band for TGFBR2 endret NK celler, 25% for gRNA3 og 81% for HPRT genet endret NK celler.
Gene expression nivå analysen
Som en representant for våre resultat viser figur 5 effekten av Cas9/RNPs (gRNA1 + gRNA2) på mRNA produksjonsnivået av TGFBR2 ectodomain, analyseres av RT PCR. Som sett i diagrammet, hvilket mRNA uttrykk målrettet genet betydelig redusert.
Cytotoksisitet
Som vist i figur 6, etter rugende gRNA1 + gRNA2, gRNA2 og gRNA3 endret Cas9/RNPs celler med TGFβ1, co kultivert med DAOY celler. de endrede cellene viser ikke noen betydelig reduksjon i graden cytotoksisitet sammenlignet med kontrollgruppen som hadde IL-2 i media over natten. Dette resultatet viser at Cas9/RNPs endret cellene beholde sin cytotoksisitet funksjon i nærvær av TGFβ1 og viser at de endrede cellene ble TGFβ1 motstandsdyktig.
Figur 1. Disse illustrasjonene viser electroporation effektiviteten av siRNA og plasmider DNA uttrykke GFP i NK celler ved hjelp av no-138 programmet. Sett her, er NK celle levedyktigheten 77,5% og 35% av levende celler var GFP positive. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Denne illustrasjonen viser levedyktighet og effektiviteten av en 16-programmene (DN-100) testet for electroporation optimalisering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Cas9/RNPs-mediert TGFBR2 knockout i utvidet (a) primære NK celler (b) målt ved T7E1 mutasjon analysen. T7E1 enzym gjenkjenner og innstiftet umake DNA. Hver liten gruppe (blå piler) representerer fordøyd DNA fragmenter som bærer en indel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Cas9/RNPs - mediert HPRT avbrudd i utvidet NK celler målt ved T7E1 mutasjon analysen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. mRNA uttrykk nivå av TGFBR2 ectodomain i CRISPR endret NK celler introdusert av Cas9/RNPs (gRNA1 + gRNA2) bruke RT PCR. GAPDH ble brukt som en endogen kontroll genet. Reduksjonen i RNA nivåer angir en forstyrrelse av TGFBR2 genet (mener ± SEM, P verdien < 0,0001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. a. Cytotoksisitet analysen bruke et representativt utvalg av Cas9/RNPs endret (gRNA1 + gRNA2, gRNA2 og gRNA3) NK celler viser at natten inkubasjonstiden for cellene med TGFβ1 ikke reduseres betydelig deres evne til å lyse DAOY celler. b. sammenlignet med ingen-modifisert NK celler, Cas9/RNP endret NK celler (gRNA2 og gRNA3) er mindre følsomme til TGFβ1 (mener ± SEM). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| gRNA nr. | gRNA orden | Bestilte som syntetisk crRNA | |||||
| gRNA1 | 5 CCCCTACCATGACTTTATTC 3 | / AltR1/rArGrUrCrArUrGrGrUrArGrGrGrGrArGrCrUrUrGrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArUrGrCrU/AltR2 / | |||||
| gRNA2 | 5 ATTGCACTCATCAGAGCTAC 3 | / AltR1/rArUrUrGrCrArCrUrCrArUrCrArGrArGrCrUrArCrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArUrGrCrU/AltR2 / | |||||
| gRNA3 | 5 AGTCATGGTAGGGGAGCTTG 3 | / AltR1/rArG rUrCrA rUrGrG rUrArGrGrGrG rArGrC rUrUrG rGrUrUrUrUrA rGrArG rCrUrA rUrGrCrU/AltR2 / | |||||
Tabell 1. Tre utformet gRNAs å målrette ekson 4 av TGFBR2 ectodomain som syntetiske crRNA.
| TGFBR 2 ectodomain primere FWD | 5 GTC TGC TCC AGG TGA TGT TTA T3 |
| TGFBR2 ectodomain Primer REV | 5 GGG CCT GAG AAT CTG KATTEN TTA 3 |
Tabell 2. Primere brukt for å forsterke TGFBR2 ectodomain genet
| Komponent | Beløp (uL) |
| Jektet 200 µm bakover crRNA | 2.2 |
| 200 µM tracer RNA | 2.2 |
| IDTE Buffer | 5.6 |
| Sluttprodukt | 10 |
Tabell 3. Form crRNA:tracerRNA / komplisert med 200 µM RNAs
| Komponent | Beløp (µL) |
| PBS | 1 |
| crRNA:tracrRNA dobbeltsidig (fra trinn 4.2) | 2 (200 pmol) |
| Alt-R Cas9 endonuclease (61 µM stock) | 2 |
| Totalt volum | 5 ul |
Tabell 4. For enkelt crRNA:tracrRNA dupleks reaksjon, fortynne Cas9 endonuclease til 36 µM.
| Komponent | Beløp (µL) |
| PBS | 1 |
| crRNA:tracrRNA dobbeltsidig (ex. gRNA1) | 1 (100 pmol) |
| crRNA:tracrRNA dobbeltsidig (ex. gRNA2) | 1 (100 pmol) |
| Alt-R Cas9 endonuclease | 2 |
| Totalt volum | 5 ΜL |
Tabell 5. For kombinasjon Albin på crRNA:tracrRNA duplexes fortynne Cas9 endonuclease til 36 µM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNA-avhengige endring av NK celler har vært utfordrende4,9. Vi derfor introdusert direkte en syntetisk preformed ribonucleoprotein (RNPs) kompleks og Cas9 protein som renset protein i primære og utvidet NK celler8. Denne metoden tillatt oss å eliminere capping, tailing, og andre transcriptional og translasjonsforskning prosesser startet av RNA polymerase II, som kan forårsake NK celle apoptose forbundet med DNA-avhengige signaltransduksjon metoder.
I tillegg bruker metoden rapporterte her renset Cas9 protein kompleksbundet som Cas9/RNPs, som er aktive umiddelbart etter electroporation og er degradert raskt, og dermed øke på målet og redusere off-målet effekter over gjeldende protokoller 5 , 6 , 7 , 16. videre optimalisere en ny electroporation tilnærming for å transduce Cas9/RNP med høy effektivitet er et kritisk steg innført her, som gjelder for alle andre gener av interesse. Denne metoden kan skaleres endring av større antall NK celler ved hjelp av kommersielt tilgjengelig større electroporation cuvettes (data ikke vist).
I sammendraget, kan Cas9/RNPs brukes til å endre genetisk menneskelige primære og utvidet NK celler for kreft immunterapi utnytte metoden ovenfor beskrevet. Resultatene viste også at en vellykket knockout av TGFBR2 ectodomain genet fører til disse endrede NK cellene blir TGFβ1 motstandsdyktig11.
Kombinerer RNP levering med en kilde av DNA (som naturlig recombinogenic adeno-assosiert virus (AAV) donor vektorer) kan aktivere områdespesifikke genet innsetting av homologe rekombinasjon3,18,19 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DAL serverer/har fungert som konsulent for Courier Therapeutics, Obsidian Therapeutics, Intellia Therapeutics, Merck forskningslaboratorier og Miltenyi Biotec, og har egenkapital/ledelse i CytoSen Therapeutics.
Acknowledgments
Vi erkjenner Brian Tullius for hans type hjelp redigering manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15065 | The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection. |
| Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare - Life Sciences | 17-1440-02 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | Synthetically produced as Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest | |
| Alt-R® Genome Editing Detection Kit | Integrated DNA Technologies | 1075931 | Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls. |
| Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304-011 | |
| 4D-Nucleofector™ System | Lonza | AAF-1002B | |
| Human recombinant IL-2 Protein | Novartis | 65483-0116-07 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit | Lonza | V4XP-3032 | Contains pmaxGFP™ Vector, Nucleofector™ Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette™ Strips |
| Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
| Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9 Nuclease |
| DNeasy® Blood & Tissue Handbook | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | |
| TGFβ | Biolegend | 580706 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human | Integrated DNA Technologies | 1072554 | Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer. |
| IDTE pH 7.5 (1X TE Solution) | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | Cas9 Electroporation Enhancer |
References
- Guven, H., et al. Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction. Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).
- Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. Retroviral gene transfer into primary human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 508, 127-137 (2009).
- Carlsten, M., Childs, R. W. Genetic Manipulation of NK Cells for Cancer Immunotherapy: Techniques and Clinical Implications. Frontiers in Immunology. 6, 266 (2015).
- Mehta, R. S., Rezvani, K. Chimeric Antigen Receptor Expressing Natural Killer Cells for the Immunotherapy of Cancer. Frontiers in Immunology. 283, 9 (2018).
- Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
- Wang, M., et al. Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles. PNAS. 113 (11), 2868-2873 (2016).
- Liang, Z., et al. Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 8, 14261 (2017).
- DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein. Methods. , 9-15 (2017).
- Rezvani, K., Rouce, R., Liu, E., Shpall, E. Engineering Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy. Molecular Therapy. 25 (8), 1769-1781 (2017).
- Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Human Gene Therapy. 23 (10), 1090-1100 (2012).
- Viel, S., et al. TGF-beta inhibits the activation and functions of NK cells by repressing the mTOR pathway. Science Signaling. 9 (415), (2016).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. JoVE. (48), (2011).
- Lee, D. A., Verneris, M. R., Campana, D. Acquisition, preparation, and functional assessment of human NK cells for adoptive immunotherapy. Methods in Molecular Biology. , 61-77 (2010).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), Bethesda. 407-415 (2015).
- Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
- Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Chmielecki, J., et al. Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra. Cancer Research. 77 (2), 509-519 (2017).
- Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors. Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).
