Summary
Vi beskriver montering, drift, og rengøring af et flow apparater designet til billede svampe Biofilmdannelse i realtid under flow. Vi også leverer og diskutere kvantitative algoritmer skal anvendes på de erhvervede billeder.
Abstract
I svælg candidiasis, skal medlemmer af slægten Candida overholde og vokse på den mundtlige slimhinden mens under virkningerne af spyt flow. Mens modeller for vækst under flow er blevet udviklet, mange af disse systemer er dyre, eller tillader ikke imaging mens cellerne er under flow. Vi har udviklet en roman apparat, der tillader os at billede af vækst og udvikling af Candida albicans celler under flow og i realtid. Her, detalje vi protokol for montage og brug af dette flow apparat og kvantificering af data, der genereres. Vi er i stand til at kvantificere de priser, som cellerne tillægger og løsne sig fra diaset, samt at bestemme en foranstaltning af biomasse på diaset over tid. Dette system er både økonomisk og alsidig, arbejde med mange typer af lys mikroskoper, herunder billig benchtop mikroskoper, og er i stand til udvidet imaging gange i forhold til andre flow systemer. Samlet set er dette en lav-overførselshastighed system, der kan give meget detaljerede real-time oplysninger om biofilm vækst af svampe arter under flow.
Introduction
Candida albicans (C. albicans) er en opportunistisk svampe patogen af mennesker, der kan inficere mange vævstyper, herunder mundtlige slimhindeinfektioner, forårsager oropharyngeale candidiasis og resulterer i en lavere livskvalitet for berørte personer1. Biofilmdannelse er et vigtigt kendetegn for patogenesen af C. albicans, og talrige undersøgelser har været udført på dannelsen og funktionen af C. albicans biofilm2,3,4, 5, hvoraf mange er blevet gennemført ved hjælp af statisk (ingen flow) in vitro- modeller. Men C. albicans skal overholde og vokse ved tilstedeværelse af spyt flow i mundhulen. Mange flow systemer er blevet udviklet for at give mulighed for live-celle imaging6,7,8,9,10. Disse forskellige flow systemer er designet til forskellige formål, og derfor hvert system har forskellige styrker og svagheder. Vi fandt, at mange af flow systemer er relevant for C. albicans var dyre, kræves kompleks fabrikerede dele, eller kunne ikke afbildet under flow og måtte stoppes før billeddannelse. Derfor udviklede vi en roman flow apparater for at studere C. albicans Biofilmdannelse under flow11. Under udformningen af vores flow apparater, vi har fulgt disse store overvejelser. Første, vi ønskede at være i stand til at kvantificere flere aspekter af biofilm vækst og udvikling i realtid uden at kræve anvendelse af fluorescerende celler (tillader os at undersøgelse mutantstammen og umodificeret kliniske isolater nemt). For det andet ønskede vi alle dele til at være kommercielt tilgængelige med lidt at ingen ændringer (dvs., ingen brugerdefinerede fabrication), så andre kan mere nemt genskabe vores system, og giver mulighed for nem reparationer. For det tredje ønskede vi også giver mulighed for udvidet imaging gange på rimelig høj strømningshastigheder. Endelig, vi ønskede, efter en periode med celler fastgørelse til underlaget under flow, at være i stand til at overvåge biofilm vækst over længere tid uden at indføre nye celler.
Disse overvejelser førte os til at udvikle de to-kolbe recirkulerende flow system illustreret i figur 1. De to kolber tillade os at opdele eksperiment i to faser, en vedhæftet fil fase, der trækker fra celle-seedede vedhæftet fil kolbe og en vækstfase, der bruger celle-gratis medier til at fortsætte biofilm væksten uden tilsætning af nye celler. Dette system er designet til at arbejde med en inkubation kammer for mikroskop, med diasset og slange går forud for det (2 til 5, figur 1) er placeret inde i rugemaskinen, og alle andre komponenter placeret i en stor sekundær beholder uden for de mikroskop. Desuden bruges en kogeplade omrører med en vedhæftet temperatursonden til at opretholde svampe celler i vedhæftede kolben ved 37 ° C. Som det recirkulerende, dette system er i stand til kontinuerlig Imaging under flow (kan være mere end 36 h afhængig af betingelser), og kan bruges på de fleste standard mikroskoper, herunder oprejst eller omvendt benchtop mikroskoper. Her diskuterer vi forsamlingen, drift, og rengøring af apparatet flow, såvel som giver nogle grundlæggende ImageJ kvantitative algoritmer til at analysere videoerne efter et eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Saml apparatet Flow
- Konfigurere de dele, der er anført i Tabel af materialer ifølge skematisk i figur 1 med de overvejelser, der er omtalt nedenfor.
Bemærk: For bekvemmelighed, strømmen apparater er opdelt i to sider, den grønne side (alt opstrøms af dias til media kolber) og orange side (alt nedstrøms af dias til media kolber).- Sikre, at alle flow apparater luft stram til at forhindre lækager, med undtagelse af medier kolberne (figur 1, 1). For at opnå dette, Anvend blikkenslagere tape til enhver mandlig threading før montering undtagen pulsering dæmper (PD) og 2 µm filter flaske (FB), som ikke kræver blikkenslagere tape som gummipakninger holde dem lufttæt.
- Anvende øre klemmer på hvert pigtråd montering, der er under overtryk under normal drift (dvs., neden for pumpen).
- Brug farvekodede lab bånd til at mærke ventil placeringer med et A eller G (for vedhæftede og vækst, henholdsvis), pumpe placering, dias forbindelse steder og 0,2 µm filter forbindelsen.
- Afgør længden af slangen skal bruges baseret på afstanden mellem flow system og mikroskop, holde sig for øje, at alle flow apparatet nedstrøms pumpe til kolberne (størstedelen af den orange side) skal være i den sekundære indeslutning. Tilføje ca 1 m af ekstra slanger opstrøms af diaset (og helst boble fælde) at placere i mikroskop inkubation kammeret, da dette sikrer, at alle medier at nå diasset vil blive på den korrekte temperatur.
- Plads boble fælde så tæt som muligt til diaset, helst inde inkubation kammer under et eksperiment (bobler ofte form langs slanger væggen); men husk på, det skal være tilsluttet en vakuum til at fungere.
- Sikre, at slangen mellem FB og 0,2 µm engangs filter er ca 0.5 m lang.
- Tilføje en ca 2 cm magnetiske rør bar til hver medier kolbe.
- Få nogle form af slange klemmer til at fungere som afspærrings-ventiler (hemostats kan anvendes).
- Til brugervenlighed, holde apparatet flow i et autoklaverbart kurv. Det kan være nyttigt at have en anden mindre kurv i en større en til nem adskillelse af den grønne side og den orange side.
- Vedhæftet fil kolben, ved hjælp af en 4 mm borehoved, bore et ekstra hul i gummiprop til at rumme den termisk sonde (Vær forsigtig ikke at gå gennem en anden hul). For at få slangen gennem portene, skub slangen med pincet; en gang igennem, klemme slange for at holde det på plads, og derefter trække pincet ud igen.
Bemærk: Hvis det ikke er muligt at tilføje de ekstra hul til gummiprop, en bred mund skrue flaske med en fire-port skruelåg kan arbejde i stedet for den kolbe og gummi prop.
- Når flow-system har været fuldt samlet, Luk ventilerne af både grønne og orange side vækst kolber. Brug vand med vedhæftet fil kolbe slanger og et måleglas for at kalibrere den peristaltiske pumpe ifølge producentens anvisninger.
2. udføre et eksperiment
- Dagen før eksperimentet, begynder forvarmning mikroskop inkubation kammer til 37 ° C, og forberede en overnight kultur af en svampe stamme (Fluorescens er ikke påkrævet).
- Samle engangsbrug komponenter og pumpe, og anbringes i en steril biosikkerhed kabinet.
- Fjerne den boble fælde og temperatur sonde fra apparatet flow og placere disse i biosikkerhed kabinet.
- Detangle og organisere slangen, hvis nødvendigt.
- Autoklave flow apparater, herunder rør-barer i 30 min at sikre sterilitet; Når du er færdig, overføre til biosikkerhed kabinet.
- Vedhæfte den boble fælde, temperatur sonde og alle engangsbrug komponenter (undtagen dias) som afbilledet i figur 1.
- For 0,2 µm filter (figur 1, 11), skal du fjerne stemplet fra 1 mL sprøjte til at gøre det som en "adapter". Tvinge slangen fra FB ind herpå, og tillægger slangen fører til vækst kolbe 0,2 µm filter.
- Anvende vakuum siliconefedt omkring barb af dias adapter (Vær forsigtig ikke at få nogen fedt på indersiden) før der forbindes det, da dette hjælper med at forhindre luft lækager i systemet.
- Udfyld vedhæftede kolben med 100 mL 1% (w/v) gærekstrakt, 2% (w/v) pepton og 2% (w/v) glukose (YPD), og udfyld vækst kolben med 200 mL af YPD. Sikre, at den grønne side slanger når medierne i hver kolbe.
- Sikre, at alle ventilerne er åbne. Vedhæfte den boble fælde til et vakuum, og tilslutte pumpen til den grønne side slanger neden for den boble fælde.
- Pumpe væske med en væskehastighed på 3,3 mL/min. til helt fylde den grønne side, derefter dispensere og kassér ca 1-2 mL af medierne, fordi de første par milliliter indeholder ofte døde celler eller tilfældige debris. Sikre, at den grønne side af slangen er fyldt med medier, og har ingen bobler nedstrøms af boble fælden før du fortsætter.
- Fyld kanal dias og reservoir med YPD, pas på ikke for at indføre bobler.
- Tilslut diasset til flow apparater og pumpe mere væske for at oprette en buffer på ca. 0,5 m på den orange side. Dette er at forhindre utilsigtet fældefangst luft i diasset ved tilbagestrømning.
- Forberede transport til mikroskop apparatet flow: klemme lukket ind- og udløb af boble fælde, og klemme den grønne og orange side vedhæftet fil kolbe ventiler lukkede. Sikre at skruelåg for PD og FB er stramme, som de kan løsne under autoklavering.
- Afbryde pumpen fra slanger at gøre transporten nemmere. Derefter flytte alle komponenter, herunder kogeplade omrører, i en sekundær beholder nær mikroskop.
- Forberede imaging flow apparater.
- Tillægger kogeplade omrører temperatursonden og begynde at varme vedhæftet fil kolben til 37 ° C. Rør medierne på 300 rpm og vedligeholde dette for hele eksperimentet.
- Mount diaset på mikroskop, og bruge tape, hvis det er nødvendigt at sikre it-stramt.
- Tillægger en vakuum boble trap (Fortryd ikke klemme endnu).
- Tilslut pumpen til apparatet flow på den placering, der er angivet på figur 1.
- Start pumpen med en væskehastighed på 3,3 mL/min., gør det muligt at køre for ca 5-10 s, og fjern derefter boble fælde indløb/udløb klemme.
- Tillad pumpen til at fortsætte med at køre mens vedhæftet fil kolben opvarmes. Når media har rundsendt hele flow system, kontrollere for normal drift.
- Tjekke udstyr til luften siver ud i upstream pumpe (nogle boble dannelse er normale), eller væske siver ud nedstrøms.
- Kontroller, at væksten medier kolbe, PD og FB er alle dryppende medier fra fjorden rør (hvis ikke, kunne det tyde på et tilstoppet filter eller en overtightened øre klemme).
- Ved hjælp af mikroskop, check for vedhæftede eller rullende celler på diasset kanal. Et overdrevet antal celler kan være tegn på forurening under set-up, eller at polytetrafluorethylen (PTFE) membranen af boblen fælde skal udskiftes.
- Når vedhæftet fil kolbe og inkubering salen er både ved 37 ° C, nok overnight kultur af svampe cellerne vedhæftet fil Kolben tilsaettes til 1 x 106 celler/mL.
Bemærk: Lydstyrken til tilføje i µL kan beregnes ved hjælp af denne formel:
- Vente 15 minutter for at tillade cellerne til at acclimate.
- Åbne både grønne og orange side vedhæftet fil kolbe ventiler under lukning af begge vækst kolbe ventiler for at starte flow af celler.
- Vent i ca 5 min at tillade celler at nå diasset, og mulighed for indledende fokusering af mikroskop (denne gang muligvis justeres afhængigt af længden af den grønne side slanger). I løbet af denne tid, justere mikroskop til de samme imaging parametre, der bruges i tidligere forsøg. Hvis dette er den første kørsel, skal du følge disse trin:
- Skifte til en lav forstørrelse luft mål.
- Finde og fokusere på en tilknyttet celle eller små spirende celle.
- Konfigurere kondensatoren for Köhler belysning, derefter skifte til darkfield.
- Indstille eksponering til 300 ms.
- Justere den lysende intensitet, indtil en lille celle er dæmpet endnu klart synlig baggrund (et signal til baggrunden forholdet mellem ca 7-8 for en spirende datter celle er en rimelig værdi). Bemærk/mark den lysende intensitet for fremtidige eksperimenter.
- Konfigurere softwaren til at erhverve et billede hver 2 min over 2 h.
- Begynde billede erhvervelse for den vedhæftede fil fase. Check tilbage efter ca 5 og 10 min til at sikre, at fokus er blevet fastholdt. Hvis ikke, forsøge at justere fokus umiddelbart efter det næste billede er erhvervet.
- Umiddelbart efter den vedhæftede fil fase er afsluttet, Gem filen, og Åbn derefter både grønne og orange side vækst kolbe ventiler under lukning af begge vedhæftet fil kolbe ventiler. Passe på ikke for at støde fase, hvis alle ventiler er inde i inkubation kammer.
- Afmonterer termometer sonden fra kogeplade omrører.
- Vedhæftet fil kolben fjernes fra kogeplade omrører og kolben vækst i dens sted.
- Konfigurere softwaren til at erhverve et billede hvert 15 min over 22 h og begynde at image erhvervelse til vækstfasen. Igen fokus bør ikke være nødvendigt, men det er stærkt anbefales at tjekke strømmen apparatet efter et par timer.
- Tjekke udstyr til luften siver ud i upstream pumpe (igen nogle boble dannelse er normale), eller væske siver ud nedstrøms
- Kontrol, at væksten medier kolbe, PD og FB er alle dryp medier (hvis ikke, kunne det tyde på et tilstoppet filter, en overtightened øre klemme eller en træsko på en pigtråd montering, hvis de celler, der anvendes flocculate).
- Kontrollere væskeniveau i FB. Hvis medierne nærmer sig toppen af flasken (over 1,5 cm over toppen af filteret), stramme begge screwcaps (ikke løsne dem, som denne kolbe er under pres). Hvis de ikke vil stramme yderligere, fortsætte eksperimentet (selvom dette kan resultere i en lækage), og erstatte gummipakninger på PD og FB efter den næste rengøring.
- Når vækst fase erhvervelse er færdig, Gem filen, og Åbn derefter de grønne og orange side vedhæftet fil kolbe ventiler, der kan gøre en støj som presset udgivelser i orange side. Trække op på den grønne side slanger kommer fra begge medier kolber, indtil de er mindst flere centimeter over mediet. Køre pumpen på en høj hastighed (ca 100 mL/min. eller hold hurtigt fremad-knappen på pumpen) for at fjerne alle medier fra slangen, hvilket gør rengøring nemmere. Når tømt, afbryde strømmen apparater fra pumpen, og fjern det fra mikroskop.
3. ren apparatet Flow
- Fjern alle ikke-autoklaverbart komponenter (engangsbrug komponenter, boble fælde og temperatur sonde), og autoklave flow apparater til 30 min. kassere brugt engangsbrug komponenter, ren sonde med 70% ethanol, og der er afsat boble fælde.
- Efter autoklavering er færdig, kassere medier, og skyl og afsætte media kolber. Derefter re-forbindelse den boble fælde, tilslutte en ibidi kanal dias skal anvendes til rengøring (kan genbruges) og forbinde flow-system til at pumpe henne ved den placering vist i figur 1.
- Klemme lukket orange side vækst kolbe ventil.
- Læg ca. 200 mL ufortyndet blegemiddel i et bægerglas. Placere gummipropper i blegemiddel, og derefter begynde at pumpe med høj hastighed til at cirkulere blegemiddel i hele flow apparater (undtagen alle filtre). Når fyldt med blegemiddel, stop pumpen fordi forlader pumpen på en høj hastighed kan bære og bryde slangen.
- Efter blegning for 15 min, holde gummipropper ovenfor bægerglasset og starter pumpen igen for at fjerne blegemiddel fra apparatet flow.
- Gentag trin 3.4 og 3.5 to gange med overskydende vand i stedet for blegemiddel at skylle flow-system. Rengøre filtre kun med vand i løbet af denne tid, fordi andre rengøringsmidler vil ætse eller blokere filtrene.
- Placere slangen, der normalt ville forbinde til filteret 0,2 µm medier (kommer fra de 2 µm FB) i bægerglasset vandet med gummipropper fra trin 3.6.
- Afbryde slangen knyttet til indløb af 20 µm inline filter, som kan normalt trækkes fra hinanden med lethed trods den øre klemme.
- Bruge en vakuum sugekolbe og en lang sektion af slanger gennem en ekstra 3-huls prop til at skabe et vakuum system, der kan forbinde til apparatet flow.
- Tilslut dette vakuum system til indgang 20 µm filter fjorden, og starte vakuum; Dette vil trække vand gennem filtrene i den modsatte retning, fjerner døde celler.
- Træk mindst 200 mL vand gennem filtre og derefter fjerne slangen fra vandet til at tømme vand filter linjer.
- Afbryde den vakuum system fra filteret 20 µm, og Tilslut filter til sin normale slanger.
4. kvantificering af videoer
Bemærk: Alle filer skal konverteres til det mærkatformat image fil (TIF) til at arbejde. Derudover for at sammenligne mellem eksperimenter, det er afgørende, at alle billeder er taget med de samme mikroskop og billedbehandling parametre, som beskrevet ovenfor.
- Hent og Installer ImageJ, hvis ikke allerede er installeret.
- Download filen supplerende makro, og placere den i mappen ImageJ\macros.
- Justere den angivne makro:
- Åbne en billedstak fra et tidligere eksperiment i ImageJ, og vælg et tidspunkt med celler til stede.
- Vælg fra menuen via "billede | Type | 8-bit".
- Vælg fra menuen via "billede | Justere | Tærskel". Afkryds boksen "mørk baggrund" . Sæt højre side dropdown menu til rød.
- Justere den lavere værdi, indtil alle celler er dækket i rød med minimal overskydende støj (nogle ikke-celle pletter er okay og vil blive behandlet ud af makroen). Læg mærke til denne lavere værdi.
- Luk vinduet tærskel og åbne billedet.
- Vælg fra menuen via "Plugins | Makroer | Redigere". Når du bliver bedt om at åbne en fil: "gå ét mappeniveau op", derefter Vælg mappen makroer og åbne filen flow biofilm kvantificering makro.
- Ændre den 15 værdi i alle forekomster af "setThreshold (15, 255);" til værdien bestemmes i trin 4.3.4. Gem filen, og Luk vinduet.
- Vælg fra menuen via "Plugins | Makroer | Installer"og vælg filen flow biofilm kvantificering.
- Nu, under "Plugins | Makroer" menu, seks nye muligheder for forskellige video kvantificeringer vises. Kør komplet analyse og vælg de vedhæftede fil og vækst video filer når bedt om at udføre alle tilgængelige analyser på de indsamlede data og automatisk generere output-filer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative billeder af en normal natten time-lapse eksperiment ved hjælp af wild-type C. albicans celler ved 37 ° C kan ses i figur 2A og supplerende Video 1. Billederne har været kontrastfremhævede for at forbedre synligheden. Kvantificering af de oprindelige data blev udført, og repræsentative grafer kan ses i figur 2B. For at generere disse grafer, dataene blev først normaliseret til det billeddiagnostiske område (dvs., divideret med det samlede imaging område), og distance blev yderligere normaliseret til biomasse, som beskrevet ovenfor. Derudover viser attachment og udstationeringsprocedurer de kumulative værdier over tid i stedet for de enkelte ramme værdier dannet af flow biofilm kvantificering makro. Når graferne har nået dette stadie, kan statistiske sammenligninger udføres gennem regression analyser.
Figur 1 : Skematisk af den tofasede recirkulerende flow apparater. Forbinder sorte linjer angiver, slanger, og pilespidser angive retningen af flow under normal drift. (A) A generelle skematisk oversigt over flow-system er illustreret. For nemheds skyld, flow system er opdelt i en grøn side (opstrøms af dias) og en orange side (downstream dias). Fed tal svarer til dele, der er anført i tabel materialer. Etiketter til ventiler blot mark placeringen for slange klemmer eller hemostats skal placeres under eksperimenter. Filterrækkefølge er som følger: 8 – 20 µm inline filter, 9-10 µm inline filter, 10-2 µm filter flaske (FB), og 11-0,22 µm engangsbrug engangs filter. Skematisk er ikke til skala. (B) en nærbillede af gummiprop for vedhæftet fil kolben, illustrerer de fire komponenter, der passerer gennem havnene: media outlet, 0,2 µm luftfilter, der giver mulighed for gasudveksling, temperatur sonde (kræver bore et ekstra hul), og medierne vende tilbage. (C) en nærbillede af pulsering dæmper (PD) samt FB og skruelåg forsamlingen bruges for hver port. Disse flasker skal være lufttæt til funktion. Outlet rør til PD bør nå dybere ind i flasken end inlet-slangen for velfungerende. Den grå rektangel i FB repræsenterer det stål filter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Candida albicans wild-type celler dyrkes under flow på 37 ° C. (A) repræsentant darkfield mikroskopi billeder af den microcolonies, som danne under flow ved 37 ° C på de angivne tidspunkter. Skalalinjen = 100 µm. (B) repræsentative kvantitativ bestemmelse billeddata. Den samlede biomasse inden for regionen imaging (bestemmes af densitometri analyse), den kumulative celle vedhæftet fil, og procent biomasse distance (distance sats normaliseret til biomassen) over tid er vist for hver stamme. Data er middel til n ≥ 3 forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Video 1. Candida albicans wild-type celler dyrkes under flow på 37 ° C. Denne time-lapse darkfield mikroskopi video viser udlæg i WT celler til underlaget fasen vedhæftet fil (angivet i øverste venstre hjørne; billeder erhvervet hver 2 min), efterfulgt af efterfølgende vækst og udvikling i løbet af de vækstfase (starter ved 2 h; billeder erhvervet hvert 15 min). Celle-seedede media (1 x 106) blev brugt under den vedhæftede fil fase, mens celle-gratis medier blev brugt under vækstfasen. Flow er fra højre til venstre. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjælp af flow system som skitseret ovenfor giver mulighed for generation af kvantitative time-lapse videoer af svampe biofilm vækst og udvikling. For at muliggøre sammenligninger mellem eksperimenter er det af afgørende betydning at sikre, at de billeddiagnostiske parametre holdes det samme. Dette omfatter, at sikre, at mikroskopet er sat op til Köhler belysning til hvert eksperiment (mange guider er tilgængelige online for denne proces). Bortset fra imaging parametre, er der nogle vigtige skridt at huske når man arbejder med apparatet flow. For det første er det vigtigt at sikre, at den boble fælde vedligeholdes under vakuum under væskestrøm, som manglende evne til at gøre det vil føre til luft bliver trukket gennem den boble fælde. På samme måde, når den boble fælde ikke er under vakuum (dvs.ved transport af apparatet flow) både indsugnings- og udstødningsporte skal være fastspændt lukke; ellers vil air sive i gennem PTFE membran. Denne klemme behøver ikke at være fjernet før boblen fælden er igen placeret under vakuum. Endelig er det meget vigtigt at overvåge dit flow apparater til potentielle træsko eller utætheder. Den mest effektive måde at tjekke for træsko i dit system er at kontrollere, at der er medier dryp fra fjorde vedhæftet fil eller vækst kolben, PD og FB. Medier fra disse bør dryp på forholdsvis ensartede satser, hvis alt fungerer gnidningsløst. Hvis en træsko er til stede, du generelt kan bestemme placeringen som slangen bare opstrøms af tilstoppe bliver mere stiv.
Når dataene er opnået, leverer vi adskillige ImageJ makroer til at kvantificere videoerne. Disse makroer bestemme flere parametre af biofilm vækst og udvikling, herunder en foranstaltning af biomassen, og den sats, som cellerne tillægger og løsne sig fra overfladen eller biofilm. Beskrivelser af de angivne makroer er angivet nedenfor.
Komplet analyse udfører alle de analyser, der er anført nedenfor, og output automatisk data. Denne makro kan udføres uden en åben billedfil, mens alle andre kræver en åben video. Hvor udført, vil sig lynhurtig brugeren til at åbne en vedhæftet fil stakfilen, derefter en vækst stakfilen. Efter dette, vil det automatisk analysere billederne og output en datamappe, der indeholder alle datatabellerne, som beskrevet nedenfor, til den samme mappe som filen vedhæftet billede. Makroen vedhæftet fil counter udføres kun på den vedhæftede fil; alle andre analyser er udført på en sammenkædet stak af filerne vedhæftet fil og vækst. Outputdata filer genereret er tekstfiler, men bør være importeret til excel for brugervenlighed.
Summen intensitet analyse vil analysere hver ramme af det aktive vindue. Det tilføjer alle grå værdier for hver pixel, der er lavere tærskel udpeget i trin 4.3.7 op, og udgange én kumulative værdi pr. ramme. De værdier, der er genereret er proportional med biomasse inden for rammen, indtil nogen kamera mætning, der opstår. Dataene bør derefter blive normaliseret til området af imaging-regionen; Dette er ikke udføres af makroen.
Dækningsområde analyse vil analysere hver ramme af det aktive vindue til inden for den ramme, der er omfattet af celler (over den lavere grænseværdi) som en procentdel.
Vedhæftet fil counter vil bruge frame subtraktion til at bestemme summen intensiteten af alle de celler, der lægger mellem hver ramme. Det første datapunkt er således, at biomassen af de celler, der lægger mellem rammer 1 og 2; det andet datapunkt er biomassen af montering cellerne mellem rammer 2 og 3, osv. Disse data bør være normaliseret til området af det billeddiagnostiske område. For lettere læsbarhed er det også nyttigt at integrere denne værdi før graftegning.
Detachement counter fungerer på samme måde som vedhæftet fil counter, men vender frame subtraktion, sådan at det bestemmer summen intensiteten af de celler, der frigør mellem hver ramme. Disse data bør også normaliseret til området i regionen billedbehandling og integreret før graftegning. Forud for integration, kan disse data yderligere normaliseres samlede sum intensiteten af den foregående ramme beregnet i summen intensitet analyse. Denne nye værdi udgør andelen af celler, der løsnes fra biofilm på dette tidspunkt, som ofte er mere værdifulde data, da biomasse af de afmonterer celler vil øges med stigende biofilm biomasse.
Mens flow system præsenteres her er mere kompliceret at opføre og drive end andre flow systemer, giver det flere fordele. Mange af disse fordele som følge af vores brug af et kommercielt tilgængelige kanal dias. Den vævskultur behandling til rådighed for disse dias er tilstrækkelige til at tillade Candida celler til at holde sig til overfladen. Desuden, profilen af denne kanal dias der ligner en traditionel dias gør det muligt at nemt kan bruges på en bred vifte af mikroskop systemer, herunder opretstående mikroskoper med gennemlysning ved lav forstørrelse. Ved hjælp af denne type af mikroskop tilladt os at bruge darkfield mikroskopi, hvilket gjorde kvantificering af data meget lettere, især i forhold til fluorescerende mikroskopi (som der var ingen photobleaching og lav fototoksicitet). Traditionelle mikroskopi (uden optisk skæring), er magt konservative, betydningen af fokus celler bidrager tilsvarende numre af fotoner til et billede i fokus celler af lignende størrelse12. Det betyder, at trods vores enkelt fly Imaging, den fuld 3D voksende biofilm er stadig bliver kvantificeret hele eksperimentet, selv om de højere regioner er ude af fokus. Denne single-plane imaging har fordel af dramatisk sænke fototoksicitet skader på celler, men indeholder ikke nogen oplysninger på 3D-arkitekturen af biofilm. Dette flow system kan dog også bruges med fluorescerende celler og konfokal mikroskoper for at få denne information13.
De unikke to kolbe recirkulerende opsætningen af vores flow apparater også har mange fordele. Første, mange flow systemer kræver, at slides forhåndsudfyldes pre med celler, men vores brug af en separat celle-seedede vedhæftede kolbe tillader os at billede og kvantificere celler, så de overholder dias mens under flow, og vi mener, at dette er mere lig hvad opstår < C0 > in vivo. Derudover har vi tidligere været i stand til at justere vores mikroskop for høj hastighed billedbehandling og image vedhæftning begivenheder som de opstod i realtid, i modsætning til kvantificere dem efter faktum11. For det andet har en celle-fri vækst kolbe, der recirkulerer og kan vedligeholdes celle-fri over en længere varighed, tilladt os at forstå, hvordan biofilm vokse under flow i over 24 timer, en varighed, der ikke kan typisk ske med ikke-recirkulerende systemer . Vi har endnu ikke fastlagt den øverste frist af hvad man kan opnå med vores flow system, men vi har fuldført 36t eksperimenter; men jo længere eksperimentet, jo større chance for en lækage eller tilstoppet filter. Mange faktorer kan påvirke den potentielle varighed af et eksperiment, herunder vækst af celler, hvor klæbende de er, og graden af hyfer formation, hvilket gør det vanskeligt at definere en øvre grænse på varigheden af et eksperiment. Men hvis meget længere varighed er ønsket end der kan opnås med apparatet flow som præsenteret, filtrene kan erstattes med en rækkemotor ultraviolet (UV) sterilisation boks som det har været tidligere beskrevet8. Feltet sterilisation kan også tillade flow apparatet skal bruges til billedet bakterier; vores tidligere forsøg på at billedet bakteriestammer resulterede i hurtige tilstopning af filteret 0,2 µm. I sidste ende, vi har valgt ikke for at vedtage UV sterilisation, som boksen er brugerdefineret opdigtet, og da dette ville resultere i recirkulerende døde celler.
En anden fordel ved dette flow system er, at det er rimeligt billigt i forhold til kommercielle systemer, især hvis du skal købe et mikroskop med det. I vores laboratorium var vi i stand til at købe en grundlæggende transmitteres lys benchtop mikroskop og placere hele mikroskopet inde i en stor standard konvektion inkubator. Den eneste større krav er, at mikroskopet bør have en lukkertid funktion (enten mekanisk eller elektrisk) for at udføre time-lapse mikroskopi.
Mens dette system er alsidig og giver mange fordele, er det en lav produktion metode. Vores flow apparaturet er ude af stand til at dyrke flere stammer i parallel, i modsætning til andre tilgængelige flow systemer. På grund af den omfattende forberedelse og rengøring tid er vi kun kan udføre to eksperimenter om ugen. Men mange andre flow systemer er temmelig dyre, og kan tilstoppe når Candida celler dyrkes under hyfer danner betingelser.
Derudover dette flow system er meget kompliceret i forhold til andre, og kan være svært at holde i drift. Efter mange eksperimenter, filtre begynder at tilstoppe, slangen begynder at bære tynde og dele begynder at ruste eller blive løst; Derfor kræver disse komponenter udskiftes. Brug af filtre gør dette system uforenelig med vækstbetingelser for nogle svampe stammer; især vil noget, der inducerer flokkulering hurtigt tilstoppe 20 µm i linje filter. Men med tilstrækkelig erfaring ved hjælp af flow system, bliver det lettere at opdage potentielle problemer før de resulterer i en mislykket eksperiment. En ting, der kan gøres for at gøre den daglige drift af apparatet flow lidt enklere er at have en maskinarbejder, lave en kopi af den boble fælde boliger ud af et autoklaverbart materiale (såsom aluminium eller rustfrit stål), så du kan autoklave boblen fælde med resten af apparatet flow som PTFE membran og adapter komponenter af den boble fælde er autoklaverbart.
Afslutningsvis repræsenterer den tofasede recirkulerende flow apparat præsenteres her en unik model til billede og kvantificere i vitro Biofilmdannelse af svampe under flow og i realtid. Mens systemet har sine begrænsninger, det er meget tilpasningsdygtige og fungerer godt med de fleste mikroskoper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Dr. Wade Sigurdson for at give værdifulde input i udformningen af apparatet flow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pump | Cole Parmer | 07522-20 | 6 |
| Pump head | Cole Parmer | 77200-60 | 6 |
| Tubing | Cole Parmer | 96410-14 | N/A |
| Bubble trap adapter | Cole Parmer | 30704-84 | 3 |
| Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line | Cole Parmer | 31500-55 | 3 |
| In-line filter adapter (4 needed) | Cole Parmer | 31209-40 | 8,9 |
| Orange-side Y | Cole Parmer | 31209-55 | 7 |
| Green-side Y | ibidi | 10827 | 2 |
| * Slides | ibidi | 80196 | 4 |
| * Slide luers | ibidi | 10802 | 4 |
| Vacuum assisted Bubble trap | Elveflow/Darwin microfluidics | KBTLarge - Microfluidic Bubble Trap Kit | 3 |
| Media flasks | Corning | 4980-500 | 1 |
| 0.2 µm air filter | Corning | 431229 | 1 |
| Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed) | Corning | 1395-100 | 5,10 |
| Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed) | Wheaton | 1129750 | 5,10 |
| Screwcap tubing connector | Wheaton | 1129814 | 5,10 |
| Tubing connector beveled washer | Danco | 88579 | 5,10 |
| Tubing connector flat washer | Danco | 88569 | 5,10 |
| Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed) | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 15100002-100 | 7,8,9 |
| Clamp tool | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 14100386 | N/A |
| 20 μm in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1331 | 8 |
| 10 μm in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1333 | 9 |
| 2 μm inlet media filter | Supelco/Sigma-Aldrich | 58267 | 10 |
| * 0.22 µm media filter | Millipore | SVGV010RS | 11 |
| * 0.22 µm media filter “adapter” | BD Biosciences | 329654 | 11 |
| Rubber stopper | Fisher Scientific | 14-131E | 1 |
| Hotplate stirrer with external probe port | ThermoFisher Scientific | 88880006 | N/A |
| Temperature probe | ThermoFisher Scientific | 88880147 | N/A |
References
- Pankhurst, C. L. Candidiasis (oropharyngeal). BMJ clinical evidence. 2012, 1304 (2012).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Revista iberoamericana de micología. 18 (4), 163-170 (2001).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Current biology: CB. 15 (12), 1150-1155 (2005).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Current opinion in microbiology. 9 (6), 588-594 (2006).
- Araújo, D., Henriques, M., Silva, S. Portrait of Candida Species Biofilm Regulatory Network Genes. Trends in microbiology. 25 (1), 62-75 (2017).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of visualized experiments. (59), e3349 (2012).
- Bakker, D. P., van der Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Applied and environmental microbiology. 69 (10), 6280-6287 (2003).
- Zhang, W., Sileika, T. S., Chen, C., Liu, Y., Lee, J., Packman, A. I. A novel planar flow cell for studies of biofilm heterogeneity and flow-biofilm interactions. Biotechnology and bioengineering. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J. L. An easy and economical in vitro method for the formation of Candida albicans biofilms under continuous conditions of flow. Virulence. 1 (6), 483-487 (2010).
- Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
- McCall, A., Edgerton, M. Real-Time Approach to Flow Cell Imaging of Candida albicans Biofilm Development. Journal of fungi. 3 (1), Basel, Switzerland. 13 (2017).
- Zhang, B., Zerubia, J., Olivo-Marin, J. -C. Gaussian approximations of fluorescence microscope point-spread function models. Applied optics. 46 (10), 1819-1829 (2007).
- Tati, S., et al. Candida glabrata Binding to Candida albicans Hyphae Enables Its Development in Oropharyngeal Candidiasis. PLoS pathogens. 12 (3), 1005522 (2016).
