Summary
어셈블리, 동작, 설명 그리고 흐름에서 실시간으로에서 이미지 균 biofilm 형성 하도록 설계 흐름 기구의 청소. 우리는 또한 제공 하 고 인수 이미지에 사용할 수 양적 알고리즘 토론.
Abstract
Oropharyngeal 칸디 다에서 칸디 다 속의 멤버 준수 하 고 침 흐름의 영향 아래 구두 점 막 표면에 성장 해야 합니다. 흐름에서 성장에 대 한 모델을 개발 하는 동안 이러한 시스템의 대부분, 또는 이미징 동안 셀 흐름에서 허용 하지 않습니다. 우리는 우리가 성장과 개발 흐름에서 실시간으로 칸디 다 albicans 셀의 이미지를 새로운 기구를 개발 했습니다. 여기, 우리 선발 어셈블리 및이 흐름 장치의 사용 뿐만 아니라 생성 되는 데이터의 정량화에 대 한 프로토콜. 우리 세포를 연결 하 고 슬라이드 뿐만 아니라 슬라이드에 바이오 매스의 측정 시간이 지남에 확인할에서 분리 속도 정할 수 있습니다. 이 시스템은 경제적이 고 다재 다능 한, 저렴 한 벤치탑 현미경를 포함 하 여 가벼운 현미경의 많은 종류 및 수 있는 확장 이미징 다른 흐름 시스템에 비해 시간. 전반적으로, 이것은 낮은 처리량 시스템 biofilm 성장의 흐름에서 곰 팡이 종에 매우 상세한 실시간 정보를 제공할 수 있는.
Introduction
Candida albicans (C. albicans)은 인간의 많은 조직 유형, 구강 점 막 표면을 포함 하 여, oropharyngeal 칸디 다 증을 일으키는 원인이 되 고 영향을 받는 개인1대 한 생명의 낮은 품질의 결과 감염 시킬 수 있는 기회 곰 팡이 병원 체 이다. C. albicans의 병 인에 대 한 중요 한 특성은 Biofilm 형성 및 형성과 C. albicans biofilms2,3,4,의 기능에 다 수의 연구 수행 되었습니다. 5, 생체 외에서 정적 (흐름)를 사용 하 여 실시 되어 많은 모델. 그러나, C. albicans 는 준수 하 고 구강에 타 액 흐름의 면 전에 서 성장 해야 합니다. 수많은 흐름 시스템 라이브 셀 이미징6,7,8,,910수 있도록 개발 되었습니다. 이러한 다른 흐름 시스템 다른 목적을 위해 설계 되었습니다 그리고 그러므로 각 시스템에 서로 다른 강점과 약점. 우리는 C. albicans 에 대 한 적절 한 시스템 흐름의 많은 비용이 많이 드는 했다, 필요한 복잡 한 부품, 조작 또는 하지 될 수 흐름 중 몇 군데와 이미징 이전 중지 했다 발견. 따라서, 우리는 흐름 제11 C. albicans biofilm 형성 연구에 새로운 흐름 장치를 개발 했다. 우리의 흐름 장치 설계, 동안 우리는 이러한 주요 고려 사항을 따라. 첫째, 우리 biofilm 성장과 발전의 여러 측면을 계량 수 싶 었 어 요 (수 있도록 우리 연구 돌연변이 체 긴장 및 수정 되지 않은 임상 분리를 쉽게) 형광 세포의 사용을 요구 하지 않고 실시간. 둘째, 우리가 원하는 모든 부분을 거의 수정 없이 상업적으로 사용할 수 (즉., 아니 주문 제작), 다른 더 쉽게 우리의 시스템을 다시 만들 수 있도록 하 고 쉽게 수리에 대 한 허용. 셋째, 우리 또한 하 고 싶 었 확장 수 있도록 합리적으로 높은 흐름 율에 이미징. 마지막으로, 우리 싶어, 흐름, 아래 기판에 연결 하는 셀의 기간 뒤에 새로운 셀을 도입 하지 않고 오랜된 시간 동안 biofilm 성장을 모니터 할 수 있을.
이러한 고려 사항 지도 그림 1에 나와 있는 2 플라스 크 반복 흐름 시스템을 개발 했다. 두 개의 플라스 크 2 단계, 셀 시드 첨부 플라스 크에서 그리는 첨부 파일 단계와 성장 단계를 사용 하 여 셀 무료 미디어 새로운 셀의 추가 없이 biofilm 성장을 계속 실험을 분할 수 있습니다. 이 시스템은 앞 (2 ~ 5, 그림 1), 인큐베이터 안에 배치 되 고 튜브 슬라이드와 현미경에 대 한 보육 챔버와 함께 작동 하도록 설계 하 고 밖에 서 큰 보조 컨테이너에서 다른 모든 구성 요소 배치는 현미경입니다. 또한, 연결 된 온도 프로브 열판 활동가 37 ° c.에 첨부 플라스 크에 균 세포를 유지 하기 위해 사용 됩니다. 재순환은이 시스템은 지속적인 영상 흐름 (36 h 이상의 조건에 따라 일 수 있다), 중 고 직 립 또는 거꾸로 벤치탑 현미경을 포함 하 여 대부분의 표준 현미경에 사용 될 수 있습니다. 여기, 우리 어셈블리, 작업, 토론 고 흐름 기구의 청소 뿐만 몇 가지 기본적인 ImageJ 양적 알고리즘 실험 후 비디오 분석을 제공 합니다.
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Protocol
1. 흐름 장치 조립
- 아래에서 설명 하는 고려 그림 1에서 도식에 따라 재료의 테이블에 에서 나열 된 부품을 구성 합니다.
참고: 편의 위해, 장치 두 가지 측면, 녹색 측면 (모든 업스트림 미디어 플라스 크를 슬라이드의), 그리고 오렌지 나누어 흐름 측면 (모든 다운스트림 미디어 플라스 크를 슬라이드의).- 모든 흐름 장치 공기 누출, 미디어 플라스 크 (그림 1, 1)의 유일한 예외를 방지 하기 위해 꽉 있는지 확인 합니다. 이 위해 적용할 배관공 테이프 맥 dampener (PD)와 2 µ m 필터 병 (FB)을 제외 하 고 조립 하기 전에 어떤 남성 스레딩 배관공 테이프 필요 없는 고무 가스 켓 밀폐 그들을 유지.
- 모든 가시 피팅 긍정적인 압력 하에서 정상 작동 중에 귀 클램프를 적용 (즉, 펌프의 하류).
- 사용 색상 코딩 A 또는 G 밸브 위치를 랩 테이프 (첨부 파일 및 성장, 각각), 펌프 위치, 슬라이드 연결 위치와 0.2 µ m 필터 연결.
- 현미경, 모든 흐름 장치를 하류 (오렌지 사이드의 대다수) 플라스 크에 펌프의에 있어야 보조 포함 다는 것을 명심 하 고 흐름 시스템 사이의 거리를 기반으로 하는 사용 되는 튜브의 길이 결정 합니다. 여분의 튜브의 약 1 m 추가 업스트림의 슬라이드 (선호 거품 트랩)이 슬라이드에 도달 하는 모든 미디어는 정확한 온도에 있을 것입니다 보장으로 현미경 인큐베이션 챔버 내를.
- 장소 슬라이드 선호 챔버 내부에 부 화는 실험 동안에 가능한 합리적으로 가깝게 거품 트랩 (거품 튜브 벽을 따라 종종 폼); 그러나, 명심 해야 작동 하는 진공에 연결.
- FB와 0.2 µ m 일회용 필터는 약 0.5 m 사이의 배관을 확인 합니다.
- 추가 각 미디어 플라스 크에 약 2 cm 자기 저 어 바.
- 차단 밸브 (hemostats를 사용할 수 있습니다) 역할을 튜브 클램프의 일종을 얻을.
- 사용의 용이성, 멸 바구니에 흐름 장치를 계속. 그것은 녹색 사이드와 오렌지 사이드의 쉬운 별거를 허용 하는 큰 하나에 두 번째 작은 바구니를가지고 유용할 수 있습니다.
- 4 m m 드릴 비트를 사용 하 여 첨부 파일 플라스 크에 대 한 열 프로브 (다른 구멍을 통해 갈 수 없습니다 돌)에 맞게 고무 마 개에 여분의 구멍을 드릴 합니다. 포트를 통해 튜브를 얻으려면 배관을 통해 밀어 핀셋; 일단, 장소, 그리고 핀셋 다시 밖으로 당겨에 게 튜브 클램프.
참고: 고무 마 개에 여분의 구멍을 추가 불가능, 4-포트 나사 모자와 함께 넓은 입 나사 병 플라스 크 및 고무 스 토퍼 대신 작동 수 있습니다.
- 일단 흐름 시스템은 완벽 하 게 조립 되었습니다, 모두 녹색과 주황색 쪽 성장 플라스 크의 밸브를 닫습니다. 첨부 파일 플라스 크 튜브와 졸업된 실린더 물을 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 연동 펌프를 보정.
2. 실험 수행
- 실험, 전날 미리 현미경 인큐베이션 챔버 37 ° C에 난방 시작 하 고 준비 하는 곰 팡이 긴장의 숙박 문화 (형광 필요 하지 않습니다).
- 단일 사용 하 여 구성 요소 및 펌프, 수집 하 고 살 균 biosafety 내각 장소.
- 거품 트랩 제거 온도 흐름 장치에서 조사 하 고 biosafety 내각에 배치 합니다.
- Detangle 하 고 필요한 경우는 튜브를 구성.
- 고압 무 균; 되도록 30 분 저 어 바를 포함 하 여 흐름 장치 완료 되 면, 캐비닛 biosafety 전송.
- 그림 1에서처럼 거품 트랩, 온도 프로브, 및 (슬라이드)를 제외 하 고 모든 단일 사용 구성 요소를 연결 합니다.
- 0.2 µ m 필터 (그림 1, 11)에서 "어댑터"로 그것을 만들기 위해 1 mL 주사기 플런저를 제거 합니다. 이 끝으로 FB에서 튜브를 강제 하 고 성장 플라스 크에 지도 하는 튜브를 0.2 µ m 필터를 연결 합니다.
- 이 수 시스템에 공기 누출을 방지, 그것을 연결 하기 전에 슬라이드 어댑터 (내부에 어떤 그리스를 받을 수 없습니다 돌)의 바바라 주위 실리콘 진공 그리스를 적용 합니다.
- 1% (w/v) 효 모 추출 물, 2% (w/v) 펩, 및 2% (w/v) 포도 당 (YPD), 100 mL와 함께 첨부 파일 플라스 크와 YPD의 200 mL와 함께 성장 플라스 크를 채우기. 녹색 측면 튜브 각 플라스 크에 미디어에 도달 하면 확인 하십시오.
- 모든 밸브가 열려 있는지 확인 합니다. 진공, 거품 트랩을 부착 하 고 녹색 측면 튜브에 펌프를 연결 거품 트랩의 다운스트림.
- 완전히 녹색 측면을 작성, 분배 그리고 밀리 리터의 처음 몇은 종종 죽은 세포 또는 무작위 파편을 포함 하기 때문에 미디어의 약 1-2 mL를 삭제를 3.3 mL/min의 유량에 액체 펌프. 튜브의 녹색 측면 미디어, 가득, 진행 하기 전에 거품의 하류 없는 거품 있다 확인 하십시오.
- 거품을 소개 하도록 하지 YPD에 채워 채널 슬라이드와 저수지.
- 버퍼를 만들려면 약 0.5 m의 오렌지 쪽에 더 많은 유체 흐름 장치 및 펌프를 슬라이드를 연결 합니다. 이것은 트랩 공기 역류 경우 슬라이드에서 실수로 방지 하입니다.
- 현미경을 전송에 대 한 흐름 장치 준비: 클램프 폐쇄 입구와 출구 거품 트랩, 그리고 녹색과 오렌지 사이드 첨부 플라스 크 밸브 폐쇄 클램프의. 압력가 마로 소독 하는 동안 불지 수로 PD와 FB 나사 뚜껑 꽉 있는지 확인 하십시오.
- 쉽게 전송 하기 위해 배관에서 펌프를 분리 합니다. 다음 현미경 근처 보조 용기에 열판 활동가 포함 하 여 모든 구성 요소를 이동 합니다.
- 이미징에 대 한 흐름 장치를 준비 합니다.
- 열판 교 반기를 온도 프로브를 연결 하 고 37 ° c 첨부 플라스 크를가 열 시작 300 rpm에서 미디어를 저 어 하 고이 모든 실험에 대 한 유지.
- 현미경에 슬라이드를 탑재 하 고 단단히 그것을 확보 하기 위해 필요한 경우 테이프를 사용 합니다.
- 진공 거품 트랩을 연결 (할 실행 취소 하지 클램프 아직).
- 그림 1에 표시 된 위치에서 흐름 장치에 펌프를 연결 합니다.
- 3.3 mL/min의 유량에 펌프를 시작 하 고 약 5-10 s, 실행할 수 있도록 다음 거품 트랩 입구/출구 클램프를 제거 합니다.
- 첨부 파일 플라스 크가 열 하는 동안 계속 해 서 펌프를 수 있습니다. 일단 미디어 흐름 시스템을 통해 유포 하고있다, 정상 작동 확인 합니다.
- 공기에 누출에 대 한 피팅 확인 업스트림 펌프 (일부 거품 형성은 정상 임), 또는 하류 밖으로 유출 하는 액체의.
- 성장 미디어 플라스 크, PD, FB는 모든 떨어지는 미디어 입구 관에서 (해당 되는 경우,이 막힌된 필터 또는 조이면된 귀 클램프를 나타낼 수 있습니다) 확인 합니다.
- 현미경을 사용 하 여 채널에 연결 된 또는 롤링 셀 확인 합니다. 세포의 과도 한 수 설정, 동안 오염 나타낼 수 있습니다 또는 교체 요구는 거품의 소계 (PTFE) 멤브레인 함정.
- 일단 첨부 파일 플라스 크와 배양 챔버는 37 ° C에서 둘 다, 1 x 106 셀/mL까지 첨부 플라스 크에 곰 팡이 세포의 충분 한 숙박 문화를 추가 합니다.
참고: 볼륨 µ L에 추가을 계산할 수 있습니다이 수식을 사용 하 여:
- 적응을 셀 수 있도록 15 분 기다립니다.
- 셀의 흐름을 시작 하 두 성장 플라스 크 밸브를 닫는 동안 모두 녹색과 주황색 쪽 첨부 파일 플라스 크 밸브를 엽니다.
- 셀 슬라이드에 연결할 수 있도록 약 5 분을 기다립니다 고 (이 이번 녹색 측면 튜브의 길이 따라 조정 해야 할 수도 있습니다) 현미경의 초기 초점 허용 합니다. 이 시간 동안 현미경 이전 실험에 사용 된 동일한 이미지 매개 변수를 조정 합니다. 첫 번째 실행 인 경우 다음이 단계를 따르십시오.
- 낮은 확대 공기 목적으로 전환 합니다.
- 찾기 및 연결 된 셀 또는 작은 신진 셀에 초점.
- 쾰러 조명에 대 한 콘덴서 구성 다음 darkfield를 전환 합니다.
- 300 ms 노출 시간을 설정 합니다.
- 작은 셀 희미 한 아직 배경 (신진 딸 셀 배경 비율이 약 7-8의 신호는 합리적인 값)에 대 한 명확 하 게 표시 될 때까지 조명 강도 조정 합니다. 참고/마크 미래 실험을 위한 조명 강도.
- 이미지 마다 2 분 이상 2 시간을 취득 하는 소프트웨어를 구성 합니다.
- 첨부 파일 단계에 대 한 이미지 수집을 시작 합니다. 약 5 후 다시 확인 하 고 초점을 보장 하기 위해 10 분 유지 되었습니다. 그렇지 않은 경우에 다음 이미지를 획득 한 후에 즉시 초점을 조정 하려고.
- 첨부 파일 단계 완료 된 후에 즉시 파일을 저장 한 다음 두 첨부 파일 플라스 크 밸브를 닫는 동안 모두 녹색과 주황색 쪽 성장 플라스 크 밸브를 엽니다. 알아서 하지 어떤 밸브는 챔버 내부에 부 화 하는 경우 단계를 범프.
- 열판 교 반기에서 온도계 프로브를 분리 합니다.
- 열판 교 반기에서 첨부 파일 플라스 크를 제거 하 고 그 자리에 성장 플라스 크를 놓습니다.
- 이미지 마다 15 분 이상 22 h 고 성장 단계에 대 한 이미지 수집을 시작 하는 소프트웨어를 구성 합니다. 다시 초점 해서는 안 필요, 하지만 몇 시간 후 흐름 장치를 확인 하기 좋습니다.
- 공기에 누출에 대 한 피팅 확인 펌프 (다시 일부 거품 형성은 정상), 또는 하류 밖으로 유출 하는 액체의 업스트림
- 확인 성장 미디어 플라스 크, PD, FB는 모두 떨어지는 미디어 (해당 되는 경우,이 막힌된 필터, 조이면된 귀 클램프 또는 가시 피팅 셀 사용 되 고 flocculate 하는 경우에 덩어리를 나타낼 수 있습니다).
- FB에 액체 수준을 확인 합니다. 미디어 병 (이상 필터의 상단 위에 1.5 cm)의 상단에 도달 하면 (할 하지 느슨하게이 플라스 크 압력으로) 두 screwcaps를 조입니다. 그들은 더 강화 하지 것입니다, 계속 실험 (비록이 누수에서 될 수 있습니다), 다음 청소 후 PD와 FB에 고무 가스 켓을 교체 하 고.
- 성장 단계 취득 완료 되 면, 파일을 저장 한 다음 오렌지 측에는 압력 해제로 소음을 만들 수 있습니다 녹색 및 주황색 첨부 플라스 크 밸브를 엽니다. 그들은 미디어 위에 적어도 몇 센티미터까지 모두 미디어 플라스 크에서 오는 녹색 측 배관에 올려. 훨씬 더 쉽게 청소 하 게 배관에서 모든 미디어를 제거 하는 고속 (약 100 mL/min 또는 펌프에 빨리 감기 버튼을 길게) 펌프를 실행 합니다. 비운, 흐름 장치는 펌프에서 분리 하 고 현미경에서 그것을 제거.
3. 깨끗 한 흐름 장비
- (단일 사용 구성 요소, 거품 트랩 및 온도 프로브), 모든 비 멸 구성 요소를 제거 하 고 압력솥 30 분 삭제에 대 한 흐름 장치 단일 사용 구성 요소, 70% 에탄올으로 깨끗 한 프로브를 사용 하 고 거품 트랩을 따로.
- 압력가 마로 소독 완료 후 미디어, 폐기 린스 하 고 미디어 플라스 크를 따로 설정. 거품 트랩에 다시 연결, ibidi 채널 슬라이드 (재사용), 청소 하는 데 사용할 고 그림 1에 표시 된 위치에 펌프에 흐름 시스템을 연결.
- 클램프는 오렌지 사이드 성장 플라스 크 밸브를 폐쇄.
- 비 커에 undiluted 백제의 약 200 mL를 놓습니다. 표 백제, 고무 마 개를 삽입 하 고 순환 흐름 장치 (를 제외 하 고 모든 필터)에 걸쳐 표 백제를 높은 속도에서 펌프를 시작 합니다. 표 백제로 가득, 일단 착용 하 고 휴식 튜브는 고속에 펌프를 떠나 있기 때문에 펌프를 중지 합니다.
- 15 분 동안 표백 후 비 커 위에 고무 마 개를 누른 펌프 흐름 장치에서 제거 하는 표 백제를 다시 시작 합니다.
- 3.4와 3.5 흐름 시스템을 씻어 표 백제 대신 초과 물으로 두 번 단계를 반복 합니다. 이 시간 동안 다른 청소 요원 부식 또는 필터를 방해할 것 이기 때문에 물으로만 필터를 청소.
- 일반적으로 연결할 것 (2 µ m FB에서에서 오는) 0.2 µ m 미디어 필터 고무 마 개와 비 커 물으로 단계 3.6에서에서 튜브를 놓습니다.
- 당길 수 있다 일반적으로 떨어져 쉽게 귀 클램프에도 불구 하 고 20 µ m 인라인 필터의 입구에 연결 된 튜브를 분리 합니다.
- 진공 필터 플라스 크 및 예비 3 구멍 마 개를 통해 튜브의 긴 단면도 사용 하 여 흐름 장치에 연결할 수 있는 진공 시스템을 만들.
- 20 µ m 필터 입구의 입구에이 진공 시스템을 연결 하 고 진공; 시작 이 죽은 세포를 제거 하는 반대 방향에서 필터를 통해 물을 끌어.
- 필터를 다음 제거 물 필터 라인을 물에서 튜브를 통해 물 풀 적어도 200 mL.
- 20 µ m 필터에서 진공 시스템을 분리 하 고 필터는 일반 튜브를 다시 연결 합니다.
4. 측정 동영상
참고: 모든 파일 작업 태그 이미지 파일 (TIF) 형식으로 변환 해야 합니다. 또한, 실험 사이 비교, 그것은 중요 한 모든 이미지 같은 현미경 및 이미징 매개 변수와 함께 찍은 위에서 설명한 대로.
- 다운로드 및 아직 설치 하지 않은 경우 ImageJ를 설치.
- 추가 매크로 파일을 다운로드 하 고 ImageJ\macros 폴더에.
- 제공 된 매크로 조정:
- ImageJ에 이전 실험에서 이미지 스택을 열고 세포 존재와 시간 점을 선택 합니다.
- 를 통해 메뉴에서 선택 "이미지 | 유형 | 8 비트 ".
- 를 통해 메뉴에서 선택 "이미지 | 조정 | 임계값". "어두운 배경" 확인란을 선택 합니다. 빨강 오른쪽 드롭다운 메뉴를 설정 합니다.
- 모든 셀은 빨간색 (일부 비-셀 speckling 괜 찮 아 요 및 매크로 의해 처리 될 것 이다) 최소한의 초과 잡음으로 덮여 때까지 낮은 값을 조정 합니다. 이 더 낮은 가치를 적어 둡니다.
- 임계값 창 및 오픈 이미지를 닫습니다.
- 를 통해 메뉴에서 선택 "플러그인 | 매크로 | 편집". 파일을 열 것인지 묻는 메시지가 나타나면: "한 폴더 수준 위로 이동", 다음 매크로 폴더를 선택 하 고 흐름 biofilm 정량화 매크로 파일을 엽니다.
- 15 "setThreshold (15, 255);" 의 모든 인스턴스 값 단계 4.3.4에서에서 결정 하는 값을 변경 합니다. 파일을 저장 하 고이 창을 닫습니다.
- 통해 메뉴에서 선택 "플러그인 | 매크로 | "설치 하 고 선택 흐름 biofilm 정량화 파일.
- 이제는 에서 "플러그인 | 매크로" 메뉴, 다양 한 비디오 quantifications에 대 한 6 개의 새로운 옵션이 나타납니다. 완전 한 분석 을 실행 하 고 첨부 파일 및 성장 비디오 파일 수집 된 데이터에서 모든 사용할 수 있는 분석을 수행 하 고 자동으로 출력 파일을 생성 하 라는 메시지가 나타나면 선택 합니다.
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Representative Results
보통의 대표 이미지 하룻밤 시간 경과 실험 야생-타입 C. albicans 를 사용 하 여 셀 37 ° C에서 볼 수 있습니다 그림 2A 에 추가 동영상 1. 이미지 대비 가시성 향상을 향상 되었습니다. 원래 데이터의 정량화를 수행 하 고 대표적인 그래프 그림 2B에서 볼 수 있습니다. 이러한 그래프를 생성 하려면 데이터 했다 처음으로 정규화 된 이미징 영역 (즉, 이미징 영역 전체로 나눈 값), 그리고 위에서 설명한 대로 분리 추가 바이오 매스를 정규화 되었는지. 또한, 첨부 파일 및 분리 흐름 biofilm 정량화 매크로 의해 생성 된 개별 프레임 값 보다는 시간에 누적 값을 표시. 그래프에는이 단계에 도달 했습니다, 일단 통계적 비교는 회귀 분석을 통해 수행할 수 있습니다.
그림 1 : 2 단계 반복 흐름 장치 회로도. 검은 연결선 튜빙, 나타내고 화살촉 정상 작동 중의 흐름 방향을 표시 합니다. (A) A 흐름 시스템의 일반적인 구조 개요를 보여 줍니다. 편의 위해 흐름 시스템 녹색 측면으로 나누어져 (슬라이드의 업스트림)와 오렌지 사이드 (슬라이드의 하류). 굵은 숫자 부품 자료의 테이블에 나열 된에 해당 합니다. 밸브에 대 한 레이블을 단순히 튜브 클램프 또는 hemostats 실험 동안 배치 될 위치를 표시 합니다. 필터 순서는 다음과 같습니다: 8-20 µ m 인라인 필터, 9-10 µ m 인라인 필터, 10-2 µ m 필터 병 (FB), 그리고 11-0.22 μ m 단일 사용 일회용 필터. 회로도 규모. (B) 포트를 통해 전달 하는 4 개의 구성 요소를 보여주는 첨부 플라스 크에 대 한 고무 스 토퍼의 근접 보기: 언론 매체, 가스 교환을 허용 하는 0.2 µ m에 어 필터, 온도 프로브 (여분의 구멍을 드릴링 필요), 그리고 미디어를 반환합니다. (C) 각 포트에 사용 되는 스크류 캡 어셈블리 뿐만 아니라 맥 dampener (PD)와, FB의 근접 보기. 이러한 병 기능 완벽 해야 합니다. PD에 대 한 콘센트 배관 입구 배관 적절 한 기능에 대 한 보다 병에 더 깊은 되어야만 합니다. FB에 있는 회색 직사각형 강철 필터를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 칸디 다 albicans 37 흐름에서 성장 하는 야생-타입 셀 ° C. (A) 대표 암시 야 현미경 이미지 표시 시간 지점에서 37 ° C에서 흐름에서 형성 하는 microcolonies의. 눈금 막대 = 100 µ m. (B) 대표 이미지 정량화 데이터. (Densitometry 분석에 의해 결정) 이미징 지역, 셀 첨부 파일의 누적 비율 및 백분율 바이오 매스 분리 (분리 속도 바이오 매스를 정규화) 총 바이오 매스 시간 동안 각 변형에 대 한 표시 됩니다. 데이터는 n ≥ 3 실험. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 비디오 1. Candida albicans 37 흐름에서 성장 하는 야생-타입 셀 ° C. WT의 첨부 파일 (왼쪽 상단에 표시 된 시간, 이미지 마다 2 분 인수), 첨부 파일 단계는 기판에 셀이 시간 경과 암시 야 현미경 비디오 쇼 이후 성장과 개발 중 이어서는 성장 단계 (2 h에서 시작, 매 15 분을 인수 하는 이미지). 셀-무료 미디어 성장 단계에서 사용한 하는 동안 셀 시드 미디어 (1 x 106) 첨부 파일 단계 동안 사용 되었다. 흐름 왼쪽에서 오른쪽으로입니다. 눈금 막대 = 50 µ m. 하시기 바랍니다 여기를 클릭이이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
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Discussion
흐름 시스템을 사용 하 여 위에서 설명한 대로 균 biofilm 성장과 개발의 양적 시간 경과 비디오의 생성에 대 한 수 있습니다. 비교 실험에 대 한 수 있도록 그것 이미징 매개 변수는 같은 유지 되도록 중요 한 중요성 이다. 현미경 (많은 가이드 온라인 사용할 수 있습니다이 프로세스에 대 한) 각 실험에 대 한 쾰러 조명에 대 한 설정 되어 보장 포함 됩니다. 매개 변수, 이미징 제외 흐름 장치를 작업할 때 마음에 계속 몇 가지 중요 한 단계 있다. 첫째, 이렇게 하지 않으면 공기 거품 트랩을 통해 끌려가고 이어질 것으로 거품 트랩은 유체 흐름, 중 진공에서 유지 되도록 중요 하다. 마찬가지로, 거품 트랩 진공 (즉, 흐름 장치를 운반 하는 경우)에 포함 되지 않은 경우 입구와 출구 있어야 채워 종료; 그렇지 않으면 공기에서 PTFE 멤브레인을 통해 누수 됩니다. 이 클램프 거품 트랩은 다시 한번 진공에서 배치 될 때까지 제거 될 필요가 없습니다. 마지막으로, 그것은 잠재적인 방해물 또는 누출에 대 한 흐름 장치를 모니터링 하는 데 매우 중요 하다입니다. 시스템에 나 막 신에 대 한 확인 하는 가장 효율적인 방법을 첨부 파일 또는 성장 플라스 크, PD, FB의 후미에서 떨어지는 미디어 확인 하는 것입니다. 이들 로부터 미디어 모든 원활 하 게 작동 하는 경우 상대적으로 비슷한 속도로 떨어지는 되어야 한다. 한 덩어리 있으면 일반적으로 튜브로 위치 결정할 수 있습니다 단지의 업스트림 방해할 더 엄격한 될 것입니다.
일단 데이터를 얻은 우리 수많은 ImageJ 매크로 quantitate 비디오를 제공 합니다. 이 매크로 biofilm 성장과 발전, 바이오 매스, 그리고 세포를 연결 하 고 표면 또는 biofilm에서 분리 속도의 측정 등의 여러 매개 변수를 결정 합니다. 제공 된 매크로 대 한 설명은 아래에 제공 됩니다.
완전 한 분석 , 아래에 나열 된 모든 분석을 수행 하 고 자동으로 데이터를 출력. 이 매크로 오픈 비디오를 필요로 다른 모든 열려있는 이미지 파일 없이 실행할 수 있습니다. 실행 될 때, 그것은 사용자가 첨부 파일 스택 파일, 다음 성장 스택 파일을 자극할 것 이다. 이것 다음, 그것은 자동으로 이미지를 분석 하 고 첨부 파일 이미지 파일 같은 폴더에, 아래에 설명 된 모든 데이터 테이블을 포함 하는 데이터 폴더를 출력 됩니다. 첨부 파일 카운터 매크로 첨부 파일;에 수행 됩니다. 다른 모든 분석은 성장과 첨부 파일의 연결 된 스택에서 수행 됩니다. 생성 된 파일은 텍스트 파일, 하지만로 수입 해야 출력 데이터 사용의 용이성을 위해 능가 한다.
합계 강도 분석 활성 창의 각 프레임을 분석 합니다. 그것은 단계 4.3.7에서 지정 하는 더 낮은 임계값 위에 있는 각 픽셀에 대 한 모든 회색 값을 추가 하 고 출력 하는 프레임 당 하나의 누적 값. 생성 된 값은 바이오 매스 발생 하는 모든 카메라 채도까지 내 현재에 비례. 이미징 영역;의 영역에 다음 데이터를 정규화 한다 이 매크로 의해 수행 되지 않습니다.
범위 영역 분석 백분율 (위 낮은 임계값) 셀에 포함 된 프레임의 영역에 대 한 활성 창의 각 프레임을 분석 합니다.
첨부 파일 카운터 프레임 빼기 사용 하 여 각 프레임 사이 연결 하는 모든 셀의 합계 강도 결정. 따라서, 첫 번째 데이터 요소는 프레임 1과 2 사이 연결 하는 셀의 바이오 매스 두 번째 데이터 요소는 바이오 매스는 프레임 2와 3 사이의 연결 셀, 등등. 이러한 데이터 이미징 영역의 면적을 정규화 해야 합니다. 쉽게 가독성을 위해 그것은 또한 그래프 전에이 값을 통합 하는 데 도움이입니다.
분리 카운터 첨부 파일 카운터와 동일 하지만 각 프레임 사이 분리 하는 셀의 합계 강도 결정 되도록 프레임 빼기를 반대로 바꿉니다. 이러한 데이터 또한 이미징 영역의 영역으로 정규화 하 고 그래프 이전 통합 한다. 통합, 이전 이러한 데이터 추가 합 강도 분석에 계산 이전 프레임의 총 합계 강도 정규화 될 수 있습니다. 이 새로운 값은 종종 더 그 시간 시점 biofilm에서 분리 된 셀의 비율을 나타냅니다 중요 한 데이터는 분리의 바이오 매스는 셀 이후 증가 biofilm 바이오 매스 증가.
여기에 제시 된 흐름 시스템을 이용 다른 흐름 시스템 보다 더 복잡 한 동안, 그것은 몇 가지 장점을 제공지 않습니다. 이러한 장점 중 많은 상용 채널 슬라이드의 사용에서 유래한 다. 이 슬라이드에 사용할 수 있는 조직 문화 치료 칸디 다 세포 표면에 수 있도록 충분 하다. 또한, 전통적인 슬라이드와 비슷한이 채널 슬라이드의 프로필 쉽게 낮은 확대율에서 전송 된 빛을 사용 하 여 똑바로 현미경을 포함 한 현미경 시스템의 다양 한에서 사용할 수 있습니다. 현미경의이 유형을 사용 하 여 (로 photobleaching 및 낮은 phototoxicity 이었다) 특히 형광 현미경 검사 법에 비해 훨씬 더 쉽게 데이터의 정량화는 암시 야 현미경을 사용할 수 있었습니다. 전통적인 현미경 검사 법 (없이 광학 구분), 전력 보수, 초점 세포에서 의미 기여 비슷한 크기12의 초점 세포는 이미지에 광자의 비슷한 숫자 이다. 즉, 영상의 우리의 단일 면에도 불구 하 고 풀 3D 성장 biofilm는 여전히 되 고 정량 실험을 통해 비록 높은 영역은 초점. 이 단일 평면 영상 극적으로 낮추는 셀, phototoxicity 손상의 장점이 있지만 biofilm의 3D 아키텍처에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다. 그러나,이 흐름 시스템도 사용할 수 있습니다 형광 세포와 confocal 현미경이 정보13를.
독특한 2 또한 우리의 흐름 기구의 설치를 재순환 플라스 크는 많은 이점이 있다. 그러나 첫째, 많은 흐름 시스템 슬라이드 셀과 시드 전 수, 별도 셀 시드 첨부 플라스 크의 사용 이미지 아래 흐름, 동안 슬라이드를 준수 하 고 우리가 생각 하는 셀을 계량 하 우리이 있습니다 비슷합니다 더 발생 < c0 > vivo에서. 또한, 우리 이전 수 있다에서 발생 한 고속 이미징 및 이미지 접착 이벤트에 대 한 우리의 현미경 조정 실시간, 사실11후 측정에 반대. 둘째, recirculates 고 셀 무료 biofilms 이상 24 h에 대 한 흐름에서 성장 하는 방법을 이해 하는 확장 된 기간 동안 유지 될 수 있다 셀 무료 성장 플라스 크, 비 재순환 시스템 일반적으로 수행할 수 없는 기간을 데 . 우리 시간 상한 우리의 흐름 시스템을 얻을 수 있는 무엇을 아직 결정 되지 않은 하지만 우리 완료 36 h 실험; 그러나, 더 이상 실험, 누출 또는 막힌된 필터의 큰 기회. 수많은 요인 실험, 셀, 그들은 어떻게 접착제, 고 균 형성, 실험의 기간에 상한값을 정의 하 고 어려운 정도의 성장 속도 포함 하 여 잠재적인 기간을 발생할 수 있습니다. 그러나, 제시 흐름 장치 달성 될 수 있다 보다 훨씬 더 긴 기간 원하는 앞에서 설명한8되었습니다 필터 라인에서 자외선 (UV) 살 균 상자가 대체 수 있습니다. 이 살 균 상자 또한이 흐름 장치 이미지 박테리아; 하는 데 사용 될 수 있습니다. 우리의 이전 하려고 이미지 세균성 긴장 빠른 0.2 µ m 필터의 막힘에 결과. 궁극적으로, 우리는 하지 상자는 사용자 정의 그리고이 죽은 세포 재순환 될 UV 살 균을 채택 하기로 했다.
이 흐름 시스템의 다른 장점은 그것은 합리적으로 저렴 상용 시스템을 기준으로 그것으로 현미경을 구입 해야 하는 경우에 특히. 우리 실험실에서 큰 표준 대류 인큐베이터 안에 전체 현미경을 기본 전송된 빛 벤치탑 현미경을 구입할 수 있었습니다. 유일한 주요 현미경 시간 경과 현미경을 수행 하기 위해 셔터 기능 (기계 또는 전기) 있어야입니다.
이 시스템은 다양 한 많은 장점을 제공 하는 동안 낮은 처리량 방법 이다. 우리의 흐름 장치는 다른 사용 가능한 흐름 시스템과 달리 동시에 여러 종자를 성장 수 없습니다. 광범위 한 준비 및 청소 시간, 우리는 주 두 실험을 수행할 수입니다. 그러나, 다른 많은 흐름 시스템은 다소 비용이 많이 드는, 그리고 칸디 다 세포는 균 조건 형성에서 성장 될 때 방해할 수 있습니다.
또한,이 흐름 시스템은, 다른 사람에 비해 매우 복잡 하다 고 운영에서 유지 하기가 어려울 수 있습니다. 많은 실험 후 필터 방해할 시작, 튜브 얇은 착용 시작 하 고 부품 녹 또는 느슨한; 시작 따라서 이러한 구성 요소 교체 요구. 필터를 사용 하 여가이 시스템을 일부 곰 팡이 긴장;의 성장 상태와 호환 되지 않는 게 특히, 응집을 유도 하는 것 빠르게 20 µ m에 라인 필터를 방해할 것 이다. 그러나, 충분 한 경험으로 흐름 시스템을 사용 하 여, 그들은 실패 한 실험 발생 전에 잠재적 문제를 감지 쉽게 된다. 흐름 장치의 일상 작업을 좀 간단 하 게 할 수 있는 한 가지 기계 거품 트랩 (알루미늄 이나 스테인리스 스틸) 등 멸 소재 주택, 거품 압력솥에 수의 복제본을 만들 것입니다. 거품 트랩의 PTFE 멤브레인 및 어댑터 구성 요소는 멸 흐름 장치의 나머지와 함께 트랩.
끝으로, 여기에 제시 된 2 단계 반복 흐름 장치 이미지 흐름 아래와 실시간으로 버섯의 biofilm 형성 체 외에서 계량을 독특한 모델을 나타냅니다. 시스템의 한계에, 하는 동안 매우 적응력이 이며 대부분 현미경에서 잘 작동 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 흐름 장치의 디자인에서 중요 한 입력을 제공 하기 위한 박사 웨이드 Sigurdson를 인정 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pump | Cole Parmer | 07522-20 | 6 |
| Pump head | Cole Parmer | 77200-60 | 6 |
| Tubing | Cole Parmer | 96410-14 | N/A |
| Bubble trap adapter | Cole Parmer | 30704-84 | 3 |
| Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line | Cole Parmer | 31500-55 | 3 |
| In-line filter adapter (4 needed) | Cole Parmer | 31209-40 | 8,9 |
| Orange-side Y | Cole Parmer | 31209-55 | 7 |
| Green-side Y | ibidi | 10827 | 2 |
| * Slides | ibidi | 80196 | 4 |
| * Slide luers | ibidi | 10802 | 4 |
| Vacuum assisted Bubble trap | Elveflow/Darwin microfluidics | KBTLarge - Microfluidic Bubble Trap Kit | 3 |
| Media flasks | Corning | 4980-500 | 1 |
| 0.2 µm air filter | Corning | 431229 | 1 |
| Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed) | Corning | 1395-100 | 5,10 |
| Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed) | Wheaton | 1129750 | 5,10 |
| Screwcap tubing connector | Wheaton | 1129814 | 5,10 |
| Tubing connector beveled washer | Danco | 88579 | 5,10 |
| Tubing connector flat washer | Danco | 88569 | 5,10 |
| Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed) | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 15100002-100 | 7,8,9 |
| Clamp tool | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 14100386 | N/A |
| 20 μm in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1331 | 8 |
| 10 μm in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1333 | 9 |
| 2 μm inlet media filter | Supelco/Sigma-Aldrich | 58267 | 10 |
| * 0.22 µm media filter | Millipore | SVGV010RS | 11 |
| * 0.22 µm media filter “adapter” | BD Biosciences | 329654 | 11 |
| Rubber stopper | Fisher Scientific | 14-131E | 1 |
| Hotplate stirrer with external probe port | ThermoFisher Scientific | 88880006 | N/A |
| Temperature probe | ThermoFisher Scientific | 88880147 | N/A |
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