Summary
Nous décrivons le montage, exploitation, et le nettoyage d’un appareil à débit conçu pour la formation de biofilms fongiques d’image en temps réel sous flux. Nous également fournissons et discuter des algorithmes quantitatifs pour être utilisé sur les images acquises.
Abstract
Dans la candidose oropharyngée, les membres du genre Candida doivent respecter et se développent sur la surface de la muqueuse buccale, sous l’effet du flux salivaire. Tandis que les modèles de croissance sous flux ont été développés, beaucoup de ces systèmes sont chers, ou ne permettent pas d’imagerie tandis que les cellules sont sous flux. Nous avons développé un appareil novateur qui permet à l’image de la croissance et le développement des cellules de Candida albicans sous flux et en temps réel. Ici, nous détaillons le protocole pour le montage et l’utilisation de cet appareil de flux, ainsi que la quantification des données qui sont générées. Nous sommes en mesure de quantifier les taux que les cellules attachent à et se détachent de la diapositive, ainsi que pour déterminer une mesure de la biomasse sur la diapositive au fil du temps. Ce système est économique et polyvalent, travaillant avec nombreux types de microscopes légers, y compris les microscopes portatifs peu coûteux, et est capable d’étendue d’imagerie fois par rapport aux autres systèmes de flux. Dans l’ensemble, il s’agit d’un système de faible débit qui peut fournir des informations en temps réel très détaillées sur la croissance de biofilm des espèces fongiques sous flux.
Introduction
Candida albicans (C. albicans) est un champignon pathogène opportuniste des humains qui peuvent infecter de nombreux types de tissus, y compris les muqueuses orales, causant la candidose oropharyngée et résultant en une plus faible qualité de vie pour les personnes concernées1. La formation de biofilm est une caractéristique importante de la pathogenèse de c. albicanset de nombreuses études ont été faites sur la formation et la fonction de c. albicans biofilms2,3,4, 5, dont beaucoup ont été réalisées à l’aide de statique (pas de débit) in vitro des modèles. Cependant, c. albicans doivent adhérer et se développer en présence de flux salivaire dans la cavité buccale. Nombreux systèmes d’écoulement ont été développées pour permettre de vivre-cellule d’imagerie6,7,8,9,10. Ces systèmes de flux différents ont été conçus à des fins différentes, et donc chaque système possède différentes forces et faiblesses. Nous avons constaté que beaucoup de l’écoulement des systèmes appropriés pour c. albicans étaient coûteux, complexe requis fabriqué des pièces, ou pourrait être pas photographié au cours de l’écoulement et a dû être arrêté avant l’imagerie. Par conséquent, nous avons développé un appareil de nouveaux flux pour étudier la formation de biofilm de c. albicans sous flux11. Lors de la conception de nos appareils de débit, nous avons suivi ces considérations principales. Tout d’abord, nous voulions être en mesure de quantifier les multiples aspects de la croissance de biofilm et le développement en temps réel sans nécessiter l’utilisation de cellules fluorescentes (nous permettant d’étude souches mutantes et isolats cliniques non modifiées facilement). Deuxièmement, nous voulions que toutes les parties à être commercialisé avec peu ou aucune modification (i.e., aucune fabrication sur mesure), permettant à d’autres plus facilement recréer notre système et la possibilité pour des réparations faciles. En troisième lieu, nous voulions également permettre prolongée d’imagerie fois à raisonnablement des débits élevés. Enfin, nous avons voulu, après une période de cellules fixation au substrat sous flux, pour pouvoir surveiller la croissance de biofilm après un certain temps sans introduire de nouvelles cellules.
Ces considérations nous conduisent à développer le système d’écoulement recirculation deux-flacon illustré à la Figure 1. Les deux ballons nous permettent de partager l’expérience en deux phases, une phase d’attachement qui puise dans la fiole d’attachement cellulaire graines et une phase de croissance qui utilise les médias acellulaire pour poursuivre la croissance de biofilm sans l’ajout de nouvelles cellules. Ce système est conçu pour fonctionner avec une chambre d’incubation pour le microscope, avec le toboggan et le tube qui le précède (de 2 à 5, Figure 1) étant placé à l’intérieur de l’incubateur, et tous les autres composants placés dans un grand récipient secondaire à l’extérieur de la microscope. En outre, un agitateur de plaque chauffante avec une sonde de température ci-jointe est utilisé pour maintenir les cellules fongiques dans la fiole de pièce jointe à 37 ° C. Comme c’est le recyclage, ce système est capable de l’imagerie continue au cours de l’écoulement (peut être plus de 36 h selon les conditions) et peut être utilisé sur la plupart des microscopes, y compris les microscopes de benchtop inversé ou dressées. Ici, nous discutons de la montage, exploitation, et nettoyage de l’appareil à flux, tout en fournissant certains algorithmes quantitatives de base ImageJ pour analyser les vidéos après une expérience.
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Protocol
1. monter l’appareil à flux
- Configurer les éléments énumérés dans la Table des matières selon le schéma de la Figure 1 avec les considérations discutées ci-dessous.
Remarque : Pour plus de commodité, le flux appareil est divisé en deux parties, le côté vert (tout en amont de la diapositive pour les fioles de médias) et l’orange côté (tout en aval de la diapositive pour les fioles de médias).- S’assurer que tous les appareils de débit est hermétique pour éviter les fuites, à la seule exception des fioles médias (Figure 1, 1). Pour ce faire, appliquer plombiers ruban sur n’importe quel filetage mâle avant de monter à l’exception de l’amortisseur de pulsations (pp) et de 2 µm filtre bouteille (FB), qui ne nécessitent pas de bureaucratie plombiers comme les joints de caoutchouc Gardez-les hermétique.
- Appliquer des pinces oreille à chaque raccord cannelé qui est sous pression positive durant le fonctionnement normal (c'est-à-dire, en aval de la pompe).
- Utiliser la couleur codée bandes lab d’étiqueter les emplacements de soupapes par un A ou G (pour la fixation et la croissance, respectivement), l’emplacement de la pompe, les lieux de connexion de diapositive et la connexion de filtre de 0,2 µm.
- Déterminer la longueur de tube à utiliser en fonction de la distance entre le système d’écoulement et le microscope, gardant à l’esprit que tout l’appareil d’écoulement en aval de la pompe pour les fioles (majorité du côté orange) soit dans l’enceinte de confinement secondaire. Ajouter environ 1 m de tuyau supplémentaire en amont de la diapositive (et de préférence le barboteur) à placer dans la chambre d’incubation de microscope, comme cela s’assurera que tous les médias pour atteindre la diapositive soient à la bonne température.
- Place le barboteur aussi près que possible à la diapositive, de préférence à l’intérieur de la chambre d’incubation pendant une expérience (bulles souvent forme le long de la paroi du tube) ; Cependant, gardez à l’esprit qu’il doit être relié à un aspirateur à exploiter.
- S’assurer que le tuyau entre le FB et le 0,2 µm filtre jetable est environ 0,5 m de long.
- Ajouter un environ barre d’agitation magnétique de 2 cm dans chaque fiole de médias.
- Obtenir une certaine forme de tubes pinces pour servir de robinets d’arrêt (une pince hémostatique peut être utilisée).
- Pour la facilité d’utilisation, garder l’appareil à flux dans un panier autoclavable. Il peut être utile d’avoir un deuxième panier plus petit dans un plus grand pour permettre une séparation facile du côté vert et l’orange.
- Pour le ballon de la pièce jointe, à l’aide d’un foret de 4 mm, percer un trou supplémentaire dans le bouchon en caoutchouc pour accueillir la sonde thermique (attention de ne pas passer par un autre trou). Pour obtenir la tuyauterie via les ports, pousser le tube à travers avec des pincettes ; une fois, serrer le tube pour le maintenir en place, puis tirez la pince à épiler Régularisez.
Remarque : S’il n’est pas possible d’ajouter le trou supplémentaire pour le bouchon en caoutchouc, une bouteille de large-bouche vis avec un bouchon à vis quatre ports peut fonctionner à la place le bouchon du flacon et en caoutchouc.
- Une fois que le système d’écoulement a été entièrement assemblé, fermer les vannes de deux fioles de croissance du côté vert et orange. Utiliser l’eau avec le tuyau de fiole de pièce jointe et un cylindre gradué pour calibrer la pompe péristaltique selon les instructions du fabricant.
2. réaliser une expérience
- Le jour avant l’expérience, commencer le préchauffage de la chambre d’incubation microscope à 37 ° C et préparer une nuit culture d’une souche fongique (fluorescence n’est pas nécessaire).
- Rassembler pompe et composants à usage unique et placer dans une stérile sur la biosécurité du cabinet.
- Enlever le collecteur de bulle et la température de sonde de l’appareil à flux et placez-les dans le cabinet de prévention des risques biotechnologiques.
- Démêler et organiser le tube, si nécessaire.
- Stériliser l’appareil à flux, y compris les barres de remuer, pendant 30 min assurer la stérilité ; Lorsque vous avez terminé, transfert à la biosécurité du cabinet.
- Fixez le barboteur, sonde de température et tous les composants réutilisables (sauf la diapositive) comme illustré à la Figure 1.
- Pour le filtre de 0,2 µm (Figure 1, 11), retirer le piston de la seringue de 1 mL pour le rendre comme un « adaptateur ». Forcer la tubulure de la FB dans cette extrémité et fixer le filtre de 0,2 µm à la tuyauterie menant à la fiole de croissance.
- Appliquez de la graisse sous vide silicone autour de l’ardillon de la diapo (attention de ne pas obtenir de graisse à l’intérieur) avant de se connecter, comme ce permet d’éviter les fuites d’air dans le système.
- Remplissez la fiole de fixation avec 100 mL d’extrait de levure 1 % (p/v), 2 % (p/v) de peptone et 2 % (p/v) de glucose (DPJ) et remplir la fiole de croissance avec 200 mL de la DPJ. Veiller à ce que la tubulure latérale verte atteint les médias dans chaque fiole.
- Veiller à ce que toutes les vannes sont ouvertes. Fixez le barboteur à une dépression et raccorder la pompe au tuyau vert côté en aval du piège à bulle.
- Pomper le liquide à un débit de 3,3 mL/min à complètement remplir le côté vert, puis extruder et jeter environ 1 à 2 mL des médias, parce que les deux premiers millilitres contiennent souvent des cellules mortes ou des débris au hasard. Faire en sorte que le côté vert du tube est rempli avec les médias et qu’il n’a aucuns bulles en aval du piège à bulle avant de continuer.
- Remplir la diapositive de canal et le réservoir avec la DPJ, prenant soin de ne pas pour introduire des bulles.
- Connectez la diapositive à l’appareil de flux et pompe plus fluide pour créer une mémoire tampon d’environ 0,5 m sur le côté orange. Il s’agit d’empêcher accidentellement air de piégeage dans la diapositive en cas de reflux.
- Préparer l’appareil à flux pour le transport au microscope : pince fermée amont et aval du barboteur et pince le vert et l’orange robinets attachement fiole fermée. Veiller à ce que les cache-vis pour le PD et FB sont serrés car ils peuvent desserrer durant l’autoclavage.
- Débrancher la pompe du circuit respiratoire pour faciliter le transport. Puis déplacez tous les composants, y compris l’agitateur de la plaque de cuisson, dans un conteneur secondaire près du microscope.
- Préparer l’appareil à flux pour l’imagerie.
- Fixer la sonde de température à l’agitateur de la plaque chauffante et commencer à chauffer le ballon de l’attachement à 37 ° C. Remuer les médias à 300 tr/min et tenez ceci pour l’expérience entière.
- Monter la culasse sur le microscope et utilisez du ruban si nécessaire pour bien le fixer.
- Fixez le barboteur à vide (pas défaire le collier sans pourtant).
- Raccorder la pompe à l’appareil de flux à l’emplacement indiqué sur la Figure 1.
- Démarrer la pompe à un débit de 3,3 mL/min et laissez-le tourner pendant environ 5 à 10 s puis débrancher la pince d’entrée/sortie du piège à bulle.
- Laissez la pompe fonctionner alors que le ballon de la pièce jointe s’échauffe. Une fois que les médias a distribué dans tout le système d’écoulement, vérifier le fonctionnement normal.
- Vérifier les raccords pour une fuite dans l’air en amont de la pompe (une formation de bulles est normale), ou liquide qui s’écoule en aval.
- Vérifiez que la fiole de croissance médias, PD et FB sont tous médias dégoulinant du tube d’aspiration (si pas, cela peut indiquer un filtre obstrué, ou une pince à oreilles trop serrée).
- À l’aide du microscope, recherchez les cellules attachées ou roulement sur la diapositive de canal. Un nombre excessif de cellules peut indiquer la contamination lors de l’installation, ou que la membrane de polytétrafluoroéthylène (PTFE) de la bulle piège doit être remplacée.
- Une fois que la chambre de fiole et incubation de fixation sont tous deux à 37 ° C, ajouter assez durant la nuit de la culture des cellules fongiques dans le ballon de la pièce jointe pour atteindre 1 x 106 cellules/mL.
Remarque : Le volume d’ajouter en µL peut être calculé à l’aide de cette formule :
- Attendre 15 min pour permettre les cellules s’acclimater.
- Ouvrir les deux robinets de fiole de fixation côté vert et orange tout en fermant les deux vannes de fiole de croissance pour démarrer le flux de cellules.
- Attendre environ 5 min permettre des cellules atteindre la diapositive et permettent la mise au point initiale du microscope (ce temps peut devoir être ajustée selon la longueur de la tubulure latérale verte). Pendant ce temps, ajuster le microscope pour les mêmes paramètres d’imagerie utilisés dans des expériences antérieures. Si il s’agit de la première manche, procédez comme suit :
- Placez-vous dans un objectif d’air de faible grossissement.
- Trouver et se concentrer sur une cellule attachée ou petits bourgeonnement.
- Configurer le condensateur pour l’éclairage de Koehler, puis passez à fond noir.
- Définir la durée d’exposition à 300 ms.
- Réglez l’intensité de l’éclairage jusqu'à ce qu’une petite cellule est dim encore clairement visible sur l’arrière-plan (un rapport signal sur fond d’environ 7 à 8 pour une cellule de fille en herbe est une valeur raisonnable). Marque/note l’intensité d’éclairage pour de futures expériences.
- Configurer le logiciel afin d’acquérir une image de plus de 2 h toutes les 2 min.
- Commencer l’acquisition d’images pour la phase d’attachement. Vérifiez après environ 5 et 10 min pour faire en sorte qui mettent l’accent a été maintenue. Si ce n’est pas le cas, essayez d’ajuster la mise au point immédiatement après que l’image suivante est acquis.
- Immédiatement après que la phase d’attachement terminée, enregistrez le fichier et ouvrez les deux valves de fiole de croissance côté vert et orange tout en fermant les deux vannes de fiole de pièce jointe. Prendre soin de ne pas pour cogner la scène si les vannes sont à l’intérieur de la chambre d’incubation.
- Débrancher la sonde du thermomètre de l’agitateur de la plaque chauffante.
- Enlever le ballon de l’attachement de l’agitateur de la plaque chauffante et placer le ballon de la croissance à sa place.
- Configurer le logiciel afin d’acquérir une image toutes les 15 minutes sur une période de 22 h et commencer l’acquisition d’images pour la phase de croissance. Re-mise au point n’est pas nécessaire, mais il est fortement recommandé de vérifier l’appareil à flux après quelques heures.
- Vérifier les raccords pour une fuite dans l’air en amont de la pompe (encore une fois une formation de bulles est normale), ou le liquide qui s’écoule en aval
- Vérifier que la fiole de croissance médias, PD et FB sont tout dégoulinant de médias (si pas, cela pourrait indiquer un filtre obstrué, une pince à oreilles trop serrée ou une obstruction à un raccord cannelé, si les cellules utilisées floculent).
- Vérifier le niveau du liquide dans le FB. Si les médias se rapproche de la partie supérieure de la bouteille (plus de 1,5 cm au-dessus du haut du filtre), serrer les deux vis (ne pas desserrer, ce flacon est sous pression). Si ils ne serrera pas plus loin, poursuivre l’expérience (bien que cela peut entraîner une fuite) et remplacez les joints de caoutchouc sur le PD et le FB après le prochain nettoyage.
- Lorsque l’acquisition de phase de croissance est terminée, enregistrez le fichier et puis ouvrez les vannes de fiole de fixation côté vert et orange qui peuvent faire un bruit comme la pression libère le côté orange. Tirez sur le tube de côté vert provenant de deux flacons de médias jusqu'à ce qu’ils soient au moins plusieurs centimètres au-dessus de la presse. Faire fonctionner la pompe à vitesse élevée (environ 100 mL/min ou maintenez enfoncée la touche avance rapide sur la pompe) pour supprimer tous les médias de la tuyauterie, ce qui rend le nettoyage plus facile. Lorsque vide, déconnecter l’appareil de débit de la pompe et retirez-le du microscope.
3. Nettoyez l’appareil à flux
- Supprimez tous les composants non autoclavable (composants réutilisables, barboteur et sonde de température), et stériliser l’appareil à flux pour 30 min. jetez utilisé des composants réutilisables, nettoyer la sonde avec l’éthanol à 70 % et mettre de côté barboteur.
- Après que autoclavage est terminée, jeter des médias et rincer et mis de côté des flacons de médias. Puis rebrancher le barboteur, connectez une diapositive ibidi de canal à utiliser pour le nettoyage (réutilisable) et relier le système de débit de la pompe à l’endroit indiqué sur la Figure 1.
- Pince fermée orange croissance ballon robinet d’arrêt.
- Placer environ 200 mL d’eau de Javel non diluée dans un bécher. Placez les bouchons de caoutchouc dans l’eau de Javel et puis démarrez la pompe à une vitesse élevée pour circuler l’eau de Javel tout au long de l’appareil de flux (sauf tous les filtres). Une fois rempli d’eau de Javel, arrêter la pompe parce que les partis de la pompe à une vitesse élevée peuvent porter et casser le tube.
- Après le blanchiment pendant 15 min, tenir les bouchons en caoutchouc au-dessus le bécher et démarrer la pompe à nouveau pour retirer l’appareil de flux de l’eau de Javel.
- Répétez les étapes 3.4 et 3.5 deux fois avec l’excès d’eau au lieu de rincer le système d’écoulement d’eau de Javel. Pendant ce temps, nettoyez les filtres d’eau parce que les autres agents de nettoyage vont se corroder ou obstruer les filtres.
- Déposer le tube qui relierait normalement pour le filtre de 0,2 µm (venant de la FB de 2 µm) dans l’eau du bécher avec les bouchons de caoutchouc à l’étape 3.6.
- Débrancher le tuyau attaché à l’entrée du filtre inline 20 µm, qui peut habituellement être tiré apart avec aisance malgré la pince à oreilles.
- Utilisez une fiole de filtre à vide et une longue section de tuyau au travers d’un bouchon de 3 trous rechange pour créer un système d’aspiration qui peut se connecter à l’appareil de flux.
- Raccorder ce système d’aspiration à l’entrée de l’entrée du filtre 20 µm et commencer le vide ; Cela va tirer l’eau au travers des filtres dans le sens inverse, en enlevant les cellules mortes.
- Tirer au moins 200 mL d’eau à travers les filtres, puis enlevez le tuyau de l’eau pour vider les lignes de filtre d’eau.
- Débrancher le système d’aspiration du filtre 20 µm, et rebrancher le filtre pour son tube normal.
4. quantifier les vidéos
Remarque : Tous les fichiers doivent être convertis au format de fichier (TIF) balise image à travailler. En outre, pour comparer entre les expériences, il est essentiel que toutes les images sont prises avec le même microscope et paramètres d’imagerie, comme indiqué plus haut.
- Téléchargez et installez ImageJ si pas déjà installé.
- Téléchargez le fichier de macro complémentaire et placez-le dans le dossier ImageJ\macros.
- Ajuster la macro fournie :
- Ouvrir une pile d’image d’une expérience précédente dans ImageJ, puis sélectionnez un point de temps avec des cellules présentes.
- Choisissez parmi le menu via « Image | Type | 8-bit ».
- Choisissez parmi le menu via « Image | Ajuster | Seuil ». Cochez la case « fond sombre » . Le menu déroulant de droite la valeur rouge.
- Régler la valeur inférieure jusqu'à ce que toutes les cellules sont couverts en rouge avec un minimum de bruit excessif (certaines cellules non mouchetures est OK et sera traitée sur la macro). Prenez note de cette valeur inférieure.
- Fermez la fenêtre de seuil et l’image ouverte.
- Choisissez parmi le menu via « Plugins | Les macros | Edit ». Lorsque vous êtes invité à ouvrir un fichier : « déplacer vers le haut niveau d’un seul dossier », puis sélectionnez le dossier macros et ouvrez le fichier de macro de quantification de biofilm flux.
- Modifiez la valeur 15 dans toutes les instances de « setThreshold (15, 255) ; » à la valeur déterminée à l’étape 4.3.4. Enregistrez le fichier et fermer cette fenêtre.
- Sélectionnez via le menu « Plugins | Les macros | Installer » et sélectionnez le fichier de quantification de biofilm de flux.
- Maintenant, en vertu de la « Plugins | Macros » menu, six nouvelles options pour les quantifications vidéo divers apparaissent. Exécuter l' analyse complète , puis sélectionnez les fichiers vidéo, pièce jointe et de croissance, lorsque vous êtes invité à effectuer toutes les analyses disponibles sur les données acquises et de générer automatiquement des fichiers de sortie.
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Representative Results
Time-lapse expérience la nuit images représentatives d’une vie normale à l’aide de type sauvage c. albicans cellules à 37 ° C peuvent être vu dans la Figure 2A et la vidéo 1. Les images ont été conçue pour améliorer la visibilité de contraste. Quantification des données originales a été réalisée, et des graphiques représentant peuvent être vu dans la Figure 2B. Pour générer ces graphiques, les données ont été tout d’abord normalisées pour la zone d’imagerie (c.-à-d., divisé par le total zone d’imagerie), et le détachement a été normalisé plus loin à la biomasse, comme décrit ci-dessus. En outre, l’attachement et détachement indiquent les valeurs cumulées au fil de temps, plutôt que les valeurs de l’image générés par la macro de quantification de biofilm de flux. Une fois que les graphiques ont atteint ce stade, des comparaisons statistiques pouvant être exécutées par des analyses de régression.
Figure 1 : Schématique de l’appareil en deux phases de flux recirculation. Raccordement des lignes noires indiquent des tubes, et pointes de flèches indiquent le sens de circulation en fonctionnement normal. (A), A aperçu schématique du système de débit est illustré. Pour plus de commodité, le système d’écoulement est divisé en un côté vert (en amont de la diapositive) et une côté orange (en aval de la diapositive). Chiffres en gras correspondent aux parties énumérés dans la Table des matières. Étiquettes pour vannes a simplement marquent l’emplacement de la serre-tube ou une pince hémostatique à placer au cours d’expériences. Ordre de filtre est le suivant : 8 – 20 µm filtre, filtre en ligne de 9 – 10 µm, 10 – 2 µm filtre bouteille (FB) et 11 – 0,22 µm à usage unique jetable. Schéma n’est pas à l’échelle. (B) une vue rapprochée du bouchon en caoutchouc pour le ballon de l’attachement, illustrant les quatre éléments qui transitent par les ports : le média, le filtre à air de 0,2 µm qui permet les échanges gazeux, la sonde de température (nécessite le perçage d’un trou supplémentaire), et les médias renvoient. (C) une vue rapprochée de l’amortisseur de pulsations (DP) et le FB, ainsi que l’Assemblée de bouchon à vis utilisée pour chaque port. Ces bouteilles doivent être étanche à l’air de fonctionner. Le tube de sortie pour la periode devrait atteindre plus profondément dans la bouteille que le tuyau d’arrivée pour un bon fonctionnement. Le rectangle gris dans le FB représente le filtre en acier. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Candida albicans sauvage cultivées sous flux à 37 ° C. (A) fond noir représentant des images de microscopie des microcolonies qui se forment dans un écoulement à 37 ° C aux points de l’heure indiquée. Echelle = 100 µm. (B) données de la quantification image représentative. La biomasse totale dans la région d’imagerie (déterminée par analyse de densitométrie), le taux cumulatif de fixation des cellules et le détachement de pour cent de la biomasse (taux de détachement normalisé à la biomasse) au fil du temps sont affichés pour chaque souche. Données sont des moyens de n ≥ 3 expériences. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Vidéo supplémentaire 1. Candida albicans des cellules de type sauvage cultivés dans un écoulement à 37 ° C. Ce Time-lapse darkfield microscopie vidéo montre l’attachement de WT cells au substrat au cours de la phase d’attachement (heure indiquée dans le coin supérieur gauche, les images acquises toutes les 2 min), suivie de la croissance subséquente et le développement au cours de la phase de croissance (départ à 2 h ; images acquises toutes les 15 min). Graines cellule media (1 x 106) ont été utilisés pendant la phase d’attachement, tandis qu’acellulaire des médias ont été utilisés pendant la phase de croissance. Circule de droite à gauche. Echelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
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Discussion
En utilisant le système d’écoulement décrites ci-dessus permet la génération de vidéos time-lapse quantitatives des biofilms fongiques croissance et le développement. Pour permettre la comparaison entre les expériences, c’est d’une importance cruciale pour s’assurer que les paramètres d’imagerie restent les mêmes. Cela inclut de veiller à ce que le microscope est mis en place pour l’éclairage de Köhler pour chacune des expériences (de nombreux guides sont disponibles en ligne pour ce processus). En dehors de l’imagerie des paramètres, il y a quelques étapes importantes à garder à l’esprit lorsque vous travaillez avec le dispositif d’écoulement. Tout d’abord, il est important de s’assurer que le barboteur est maintenu sous vide pendant l’écoulement du fluide, car si vous conduira à air aspiré par le barboteur. De même, quand le barboteur n’est pas sous vide (c'est-à-dire, lorsque vous transportez l’appareil à flux) l’entrée et la sortie doivent rester fermée serrée ; dans le cas contraire air s’en échappera à la membrane PTFE. Cette borne n’a pas besoin d’être retiré jusqu'à ce que le barboteur est une fois de plus placé sous vide. Enfin, il est très important de contrôler votre appareil à flux pour sabots potentiels ou de fuites. Le moyen le plus efficace pour vérifier les sabots de votre système est de vérifier qu’il y a des médias dégoulinant des criques de la fiole d’attachement ou de croissance, le parti démocrate et le FB. Les médias de ces devraient être dégoulinant à des vitesses relativement semblables, si tout fonctionne sans à-coup. Si une obstruction est présente, vous pouvez généralement déterminer l’emplacement sous le tuyau juste en amont du sabot sera plus rigide.
Une fois que les données ont été collectées, nous fournissons plusieurs macros ImageJ pour quantifier les vidéos. Ces macros déterminent plusieurs paramètres de croissance de biofilm et de développement, y compris une mesure de la biomasse et le taux auquel les cellules attachent à et se détachent de la surface ou le biofilm. Descriptions des macros fournis sont fournies ci-dessous.
Analyse complète effectue toutes les analyses énumérées ci-dessous et génère automatiquement les données. Cette macro peut être exécutée sans un fichier image ouverte tandis que tous les autres nécessitent une vidéo ouverte. Lorsqu’il est exécuté, il invitera l’utilisateur à ouvrir un pièce jointe pile, puis un fichier croissance pile. Suite à cela, il sera automatiquement analyser les images et sortie un dossier de données contenant toutes les tables de données, tel que décrit ci-dessous, dans le même dossier que le fichier d’image de pièce jointe. La macro de comptoir de pièce jointe est exécutée uniquement sur le fichier de pièce jointe ; toutes les autres analyses sont effectuées sur une pile concaténée les fichiers de pièce jointe et la croissance. Les données de sortie, les fichiers générés sont des fichiers texte, mais doivent être importé dans excellent pour la facilité d’utilisation.
L’analyse de l’intensité de la somme va analyser chaque image de la fenêtre active. Il additionne toutes les valeurs de gris pour chaque pixel qui est au-dessus du seuil désigné à l’étape 4.3.7 et renvoie une valeur cumulée par image. Les valeurs générées sont proportionnelles à la biomasse présente dans le cadre, jusqu'à une saturation de caméra qui se produit. Les données devraient alors être normalisées à la surface de la région d’imagerie ; ce n’est pas exécuté par la macro.
L’analyse de la zone de couverture va analyser chaque image de la fenêtre active pour la zone de la trame qui est couvert par les cellules (au-dessus de la valeur seuil inférieure) en pourcentage.
Le compteur de pièce jointe utilisera le frame soustraction pour déterminer l’intensité de la somme de toutes les cellules qui se fixent entre chaque image. Ainsi, le premier point de données est la biomasse des cellules qui se fixent entre les images 1 et 2 ; le deuxième point de données est la biomasse des fixation des cellules entre cadres 2 et 3, etc.. Ces données devraient être normalisées à la surface de la région d’imagerie. Pour une lecture plus facile, il est également utile d’intégrer cette valeur avant la représentation graphique.
Le compteur de détachement fonctionne comme le compteur de pièce jointe, mais renverse la soustraction de l’image, telle qu’elle détermine l’intensité de la somme des cellules qui se détacher entre chaque image. Ces données devraient également être normalisées à la surface de la région d’imagerie et intégrées avant la représentation graphique. Avant l’intégration, ces données peuvent être encore normalisées à l’intensité de la somme totale de la trame précédente calculée dans l’analyse de l’intensité de la somme . Cette nouvelle valeur représente la proportion de cellules qui se détachent du biofilm à ce moment, qui est souvent plus précieuses données, étant donné que la biomasse de la détacher des cellules sera augmentent avec augmentation de la biomasse biofilm.
Si le système d’écoulement présenté ici est plus compliqué à construire et à exploiter que les autres systèmes de flux, il offre plusieurs avantages. Bon nombre de ces avantages résultent de l’utilisation d’une lame de canal disponible dans le commerce. Le traitement de culture de tissus disponible pour ces diapositives est suffisant pour permettre aux cellules de Candida à adhérer à la surface. En outre, le profil de cette diapositive canal étant semblable à une lame traditionnelle permet facilement l’utiliser sur une grande variété de systèmes de microscope, y compris des microscopes verticale à l’aide de lumière transmise à faible grossissement. En utilisant ce type de microscope nous a permis d’utiliser darkfield microscopy, qui a fait la quantification des données beaucoup plus faciles, surtout par rapport à la microscopie fluorescente (comme il n’y avait pas de photoblanchiment et phototoxicité faible). La microscopie traditionnelle (sans sectionnement optique), est de pouvoir conservateur, sens hors des cellules de mise au point contribuer un nombre similaire de photons d’une image comme dans les cellules de mise au point de même taille12. Cela signifie que, malgré notre seul plan de l’imagerie, le biofilm croissant en 3D est encore étant quantifié tout au long de l’expérience, même si les régions plus élevées sont flous. Cette imagerie seul plan présente l’avantage d’abaisser considérablement les dommages de phototoxicité aux cellules, mais ne donne pas d’information sur l’architecture 3D du biofilm. Cependant, ce système de flux aussi utilisable avec cellules fluorescentes et microscopes confocaux à obtenir cette information13.
Les deux uniques fiole d’installation de nos appareils de débit de recirculation aussi présente de nombreux avantages. Tout d’abord, de nombreux systèmes d’écoulement exigent que les diapositives être préalablement ensemencé avec les cellules, cependant notre utilisation d’une fiole de fixation de graines cellule séparée permet de d’images et de quantifier les cellules qu’ils adhèrent à la diapositive tout en sous flux, et nous pensons que cela est plus semblable à ce qui se passe < C0 > in vivo. En outre, nous avons pu précédemment ajuster notre microscope pour les événements d’adhérence à grande vitesse d’imagerie et de l’image qu’elles ont eu lieu en temps réel, par opposition à les quantifier après le fait11. Deuxièmement, avoir une fiole de croissance acellulaire qui recircule et peut être maintenue sans cellule pendant une durée prolongée, nous a permis de comprendre comment les biofilms poussent sous flux pendant plus de 24 heures, une durée qui ne peut généralement être accomplie avec les systèmes non-recyclage . Nous n’avons pas encore déterminé la limite supérieure du temps de ce qui peut être atteint grâce à notre système de flux, mais nous avons complété avec succès les expériences de 36 h ; Cependant, plus l’expérience, plus le risque de fuite ou de filtre colmaté. De nombreux facteurs peuvent affecter la durée potentielle d’une expérience, y compris le taux de croissance des cellules, adhésif comment ils sont et le degré de formation des hyphes, rendant difficile de définir une limite supérieure sur la durée de l’expérience. Toutefois, si on durées beaucoup plus longues qu’est possible avec le dispositif d’écoulement tel que présenté, les filtres peuvent être remplacées avec une boîte de stérilisation en ligne ultraviolette (UV) comme cela a été décrit précédemment8. Cette boîte de stérilisation peut également permettre cet appareil de flux à utiliser pour les bactéries de l’image ; nos tentatives précédentes de souches bactériennes image entraîné rapide colmatage du filtre de 0,2 µm. En fin de compte, nous avons choisi de ne pas pour adopter la stérilisation UV, comme la boîte est fabriqué sur mesure, et que cela se traduirait par recirculation des cellules mortes.
Un autre avantage de ce système est qu’il est raisonnablement bon marché par rapport aux systèmes commerciaux, surtout si vous devez acheter un microscope avec elle. Dans notre laboratoire, nous avons pu acheter un microscope de base benchtop lumière transmise et placez le microscope ensemble à l’intérieur d’un incubateur de grande convection standard. La seule grande exigence est que le microscope doit avoir une fonction de déclencheur (mécanique ou électrique) afin d’effectuer la microscopie Time-lapse.
Bien que ce système est polyvalent et offre de nombreux avantages, c’est une méthode de débit faible. Notre appareil de flux ne peut pas se développer des souches multiples en parallèle, contrairement aux autres systèmes de flux disponible. En raison de la vaste préparation et de nettoyage, nous sommes seulement en mesure d’effectuer des expériences de deux par semaine. Cependant, beaucoup d’autres systèmes de flux est plutôt coûteux et peut-être obstruer lorsque les cellules de Candida sont cultivées sous les hyphes formant des conditions.
En outre, ce système d’écoulement est assez complex par rapport aux autres et peut être difficile à maintenir en fonctionnement. Après de nombreuses expériences, filtres commencent à boucher les tubes commence à porter des minces et pièces commencent à rouiller ou se détacher ; ce qui nécessite ces composants à remplacer. L’utilisation de filtres rend ce système incompatible avec les conditions de croissance de certaines souches fongiques ; en particulier, tout ce qui induit la floculation sera rapidement obstruer le filtre en ligne de 20 µm. Toutefois, avec une expérience suffisante en utilisant le système d’écoulement, il devient plus facile de détecter les problèmes potentiels avant qu’ils résultent en une expérience ratée. Une chose qui peut être faite pour rendre l’opération tous les jours de l’appareil de débit un peu plus simple est d’avoir un machiniste à construire une réplique du piège à bulle de logement dans un matériau autoclavable (comme l’aluminium ou acier inoxydable), vous permettant de l’autoclave de la bulle piège avec le reste de l’appareil de flux, comme les composants de membrane et adaptateur PTFE du piège à bulle sont stérilisables en autoclave.
En conclusion, l’appareil en deux phases de flux recirculation présentée ici représente un modèle unique à l’image et à quantifier in vitro la formation de biofilm de champignons sous flux et en temps réel. Alors que le système a ses limites, il est très adaptable et fonctionne bien avec la plupart des microscopes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs aimerait Dr Wade Sigurdson pour apporter une contribution précieuse dans la conception de l’appareil à flux.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pump | Cole Parmer | 07522-20 | 6 |
| Pump head | Cole Parmer | 77200-60 | 6 |
| Tubing | Cole Parmer | 96410-14 | N/A |
| Bubble trap adapter | Cole Parmer | 30704-84 | 3 |
| Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line | Cole Parmer | 31500-55 | 3 |
| In-line filter adapter (4 needed) | Cole Parmer | 31209-40 | 8,9 |
| Orange-side Y | Cole Parmer | 31209-55 | 7 |
| Green-side Y | ibidi | 10827 | 2 |
| * Slides | ibidi | 80196 | 4 |
| * Slide luers | ibidi | 10802 | 4 |
| Vacuum assisted Bubble trap | Elveflow/Darwin microfluidics | KBTLarge - Microfluidic Bubble Trap Kit | 3 |
| Media flasks | Corning | 4980-500 | 1 |
| 0.2 µm air filter | Corning | 431229 | 1 |
| Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed) | Corning | 1395-100 | 5,10 |
| Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed) | Wheaton | 1129750 | 5,10 |
| Screwcap tubing connector | Wheaton | 1129814 | 5,10 |
| Tubing connector beveled washer | Danco | 88579 | 5,10 |
| Tubing connector flat washer | Danco | 88569 | 5,10 |
| Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed) | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 15100002-100 | 7,8,9 |
| Clamp tool | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 14100386 | N/A |
| 20 μm in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1331 | 8 |
| 10 μm in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1333 | 9 |
| 2 μm inlet media filter | Supelco/Sigma-Aldrich | 58267 | 10 |
| * 0.22 µm media filter | Millipore | SVGV010RS | 11 |
| * 0.22 µm media filter “adapter” | BD Biosciences | 329654 | 11 |
| Rubber stopper | Fisher Scientific | 14-131E | 1 |
| Hotplate stirrer with external probe port | ThermoFisher Scientific | 88880006 | N/A |
| Temperature probe | ThermoFisher Scientific | 88880147 | N/A |
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