Summary
We beschrijven de vergadering, operatie, en schoonmaken van een apparaat van de stroom ontworpen om schimmel biofilm beeldvorming in real-time terwijl onder stroom. Wij bieden ook en bespreken van kwantitatieve algoritmen worden gebruikt op de verworven beelden.
Abstract
In orofaryngeale candidiasis, moeten leden van het geslacht Candida zich houden aan en groeien op de mondelinge mucosal oppervlakte terwijl onder de gevolgen van speeksel stroom. Terwijl de modellen voor de groei onder stroom hebben ontwikkeld, veel van deze systemen zijn duur, of niet toestaan imaging terwijl de cellen onder stroom. We hebben een nieuw apparaat dat ons toelaat om de groei en de ontwikkeling van Candida albicans cellen onder stroom en in real-time beeld ontwikkeld. Hier, detail we het protocol voor de vergadering en het gebruik van dit apparaat van de stroom, evenals het kwantificeren van gegevens die worden gegenereerd. We kunnen de tarieven die de cellen koppelen aan en loskoppelen van de dia, evenals over het bepalen van een maatregel van de biomassa op de dia na verloop van tijd kwantificeren. Dit systeem is zowel economische als veelzijdig, werken met vele soorten licht microscopen, met inbegrip van goedkope benchtop microscopen, en staat uitgebreid imaging keer in vergelijking met andere systemen van stroom. Globaal, dit is een laag-doorvoer systeem dat zeer gedetailleerde real-time informatie over de groei van de biofilm van schimmel soorten onder stroom verschaffen kan.
Introduction
Candida albicans (C. albicans) is een opportunistische schimmel pathogeen voor mensen die veel weefselsoorten, met inbegrip van mondelinge mucosal oppervlakken, orofaryngeale candidiasis veroorzaakt en wat resulteert in een lagere kwaliteit van leven voor beïnvloede individuen1kan infecteren. Biofilm vorming is een belangrijk kenmerk voor de pathogenese van C. albicans, en talrijke studies zijn gedaan over de vorming en de functie van C. albicans biofilms2,3,4, 5, waarvan vele zijn uitgevoerd met behulp van statische (geen stroom) in vitro modellen. C. albicans moet echter houden en groeien in aanwezigheid van speeksel stroming in de mondholte. Talrijke stroom systemen zijn ontwikkeld om te voorzien in live-cel imaging6,7,8,9,10. Deze verschillende stroom-systemen zijn ontworpen voor verschillende doeleinden, en daarom elk systeem heeft verschillende sterke en zwakke punten. Vonden wij dat veel van de stroom systemen geschikt zijn voor C. albicans waren duur, vereiste complex vervaardigde onderdelen, of kon niet worden beeld tijdens stroom en moest worden gestopt voordat de beeldvorming. Daarom ontwikkelden we een nieuwe stroom apparaat om te studeren C. albicans biofilm vorming onder stroom11. Tijdens het ontwerp van onze apparaten van de stroom, wij gevolgd deze belangrijke overwegingen. Ten eerste, we wilden kunnen kwantificeren van meerdere aspecten van de biofilm groei en ontwikkeling in real-time zonder het gebruik van fluorescerende cellen (toelatend ons aan studie gemuteerde stammen en ongewijzigde klinische isolaten gemakkelijk). Ten tweede wilden we alle onderdelen om commercieel beschikbaar met weinig tot geen wijzigingen (dwz., geen aangepaste fabricage), zodat anderen meer gemakkelijk opnieuw ons systeem en waardoor voor eenvoudige reparaties. Ten derde, we wilden ook toestaan voor uitgebreide imaging keer op redelijk hoog debiet. Tot slot, we wilden, na een periode van cellen verbonden zijn aan het substraat onder stroom, kunnen controleren de biofilm groei gedurende een langere tijd zonder de invoering van nieuwe cellen.
Deze overwegingen leidde ons naar het ontwikkelen van het twee-kolf recirculatie-stroomsysteem geïllustreerd in Figuur 1. De beide kolven kunnen we het experiment in twee fasen, de fase van een bijlage die uit de cel-geplaatste bijlage kolf trekt en een groeifase waarbij de cel-vrije media om te blijven de biofilm groei zonder de toevoeging van nieuwe cellen splitsen. Dit systeem is ontworpen om te werken met een incubatie kamer voor de Microscoop, waarbij de dia en de slang voorafgaand aan het (2 tot en met 5, Figuur 1) wordt geplaatst in de incubator, en alle andere onderdelen geplaatst in een grote secundaire container buiten de Microscoop. Een kookplaat roerder met een bijgevoegde temperatuursonde wordt bovendien gebruikt om schimmel cellen in de kolf van de bijlage bij 37 ° C. Zoals het opnieuw circuleren is, dit systeem is geschikt voor continue imaging tijdens stroom (kan worden meer dan 36 h afhankelijk van omstandigheden), en kan worden gebruikt op de meeste standaard microscopen, met inbegrip van rechte of omgekeerde benchtop microscopen. Hier bespreken we de vergadering, operatie, en schoonmaken van het apparaat van stroom, ook als bieden sommige fundamentele ImageJ kwantitatieve algoritmen voor het analyseren van de video's na een experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Monteer het apparaat van de stroom
- Configureer de onderdelen weergegeven in de Tabel van de materialen volgens het schema in Figuur 1 met de overwegingen hieronder besproken.
Opmerking: Voor het gemak, de stroom apparaat is verdeeld in twee kanten, de groene kant (alles stroomopwaarts van de dia aan de media kolven) en de oranje kant (alles stroomafwaarts van de dia aan de media kolven).- Zorg ervoor dat alle van het apparaat van stroom luchtdicht te voorkomen van lekken, met uitzondering van de media kolven (Figuur 1, 1). Om dit te bereiken, toepassing loodgieters tape op alle mannelijke draadsnijden voor het monteren met uitzondering van de pulsatie demping (PD) en 2 µm filter fles (FB), die geen loodgieters tape vereisen zoals de rubberdichting Bewaar ze luchtdicht.
- Oor klemmen op elke prikkeldraad montage thats onder overdruk tijdens normale verrichting van toepassing (d.w.z., stroomafwaarts van de pomp).
- Gebruik kleurgecodeerde lab tapes op het etiket van de locaties van de klep met een A- of G (voor gehechtheid en groei, respectievelijk), de locatie van de pomp, de dia verbinding locaties en de 0,2 µm filter verbinding.
- Bepaal de lengte van de buis moet worden gebruikt op basis van de afstand tussen de stroomsysteem en Microscoop, houdend in mening dat alle stroom apparatuur stroomafwaarts van de pomp naar de kolven (meerderheid van de oranje kant) in het secundaire indammen worden moet. Toevoegen van ongeveer 1 m van extra buizen stroomopwaarts van de dia (en bij voorkeur het waterventiel) moet worden geplaatst binnen de Microscoop incubatie kamer, zoals dit zorgt ervoor dat alle media bereiken de dia op de juiste temperatuur.
- Plaats de waterventiel zo dicht als redelijkerwijs mogelijk is aan de dia, bij voorkeur binnen de incubatie kamer tijdens een experiment (bellen vaak vorm langs de buis muur); Houd er echter rekening mee dat het moet worden aangesloten op een vacuüm te werken.
- Zorg ervoor dat de buis tussen de FB en de 0,2 µm wegwerp filter ongeveer 0,5 m lang is.
- Voeg een ongeveer 2 cm magnetische roer bar aan elke maatkolf media.
- Het verkrijgen van een soort slang klemmen om op te treden als uitschakeling kleppen (hemostats kan worden gebruikt).
- Houd het apparaat van de stroom in een autoclaaf mand voor gebruiksgemak. Het kan het nuttig zijn indien er een tweede kleinere mand in een groter exemplaar dat eenvoudige scheiding van de groene kant en de kant van Oranje.
- Boor voor de kolf van de bijlage, met behulp van een 4 mm boor, een extra gat in de rubberstop voor de thermische sonde (zorg niet te gaan door een ander gat). Als u de slang via de poorten, erdoor de buis met een pincet; eenmaal door, klem de buis te houden het in de plaats, en dan trek de pincet terug uit.
Opmerking: Als het niet mogelijk om de extra hole toevoegen aan de rubberstop, een wide-mouth schroef fles met schroefdop van een vier-poorts kan werken in plaats van de kolf en rubber stop.
- Zodra de stroomsysteem volledig heeft samengesteld, sluiten de kleppen van beide kolven van groene en oranje kant groei. Het gebruik van water met de bijlage kolf buis en een afgestudeerd cilinder kalibreren de slangenpomp volgens de instructies van de fabrikant.
2. uitvoeren van een Experiment
- De dag voor het experiment begint voorverwarming de kamer incubatie Microscoop tot 37 ° C, en bereiden een overnachting cultuur van een schimmel stam (fluorescentie is niet vereist).
- Verzamel Eenpersoonsgebruik onderdelen en pomp, en plaatst in een steriele bioveiligheid kabinet.
- Verwijder de waterventiel en de temperatuur sonde uit het flow-apparaat en plaats deze in het kabinet van de bioveiligheid.
- Ontwar en organiseren van de buis, indien nodig.
- Autoclaaf het flow-apparaat, met inbegrip van de roer bars, gedurende 30 minuten om ervoor te zorgen de steriliteit; Wanneer u klaar bent, overbrengen naar het biosafety kabinet.
- Bevestig de Waterventiel, temperatuursonde en alle Eenpersoonsgebruik onderdelen (met uitzondering van de dia) zoals afgebeeld in Figuur 1.
- Voor de 0,2 µm filter (Figuur 1, 11), verwijder de zuiger uit de 1 mL spuit om het te maken als een 'adapter'. Dwingen de slang van de FB in dit verband, en bevestig de 0,2 µm filter aan de leidingen die leiden tot de groei-kolf.
- Toepassing vacuüm Siliconenvet rond de Berber van de dia-adapter (zorg niet om vet aan de binnenkant) voorafgaand aan te sluiten, als dit helpt te voorkomen dat de lucht lekken in het systeem.
- Vul de bijlage kolf met 100 mL 1% (m/v) gistextract, 2% (g/v) pepton, glucose van 2% (g/v) (YPD), en vul de groei kolf met 200 mL van YPD. Zorg ervoor dat de groene kant-buis de media in elke kolf bereikt.
- Ervoor zorgen dat alle kleppen open. De waterventiel hechten aan een vacuüm, en sluit de pomp aan de groene kant-buis stroomafwaarts van de waterventiel.
- Pomp de vloeistof op een debiet van 3,3 mL/min tot volledig vullen van de groene kant, dan afzien en negeren van ongeveer 1-2 mL van de media, omdat de eerste paar milliliter vaak dode cellen of willekeurige puin bevatten. Zorg ervoor dat de groene kant van de buis is gevuld met media, en geen luchtbellen stroomafwaarts van de waterventiel voordat u verdergaat heeft.
- Vul de dia van het kanaal en het reservoir met YPD, verzorgen niet in te voeren van de bubbels.
- Verbinden met de dia de stroom apparaat, en de pomp meer vloeistof als u wilt maken van een buffer van ongeveer 0,5 m aan de kant van Oranje. Dit is om te voorkomen dat per ongeluk overlapping lucht in de dia in het geval van terugvoer.
- Voorbereiding van het apparaat van de stroom voor het transport naar de Microscoop: klem gesloten de inlaat en uitlaat van de Waterventiel, en klem de groene en oranje kant bijlage kolf kleppen gesloten. Ervoor zorgen dat de schroef caps voor de PD en FB strak als ze tijdens de autoclaaf kunnen losmaken.
- De pomp verbreken door de buis vervoer om gemakkelijker te maken. Verplaats alle onderdelen, inclusief de kookplaat roerder, secundaire verpakkingsgasssen in de buurt van de Microscoop.
- Het apparaat van stroom voorbereiden op imaging.
- De temperatuursonde hechten aan de schudinrichting kookplaat en beginnen verwarming de bijlage kolf aan de 37 ° C. Roer de media op 300 rpm en dit te onderhouden voor het hele experiment.
- Monteren van de dia op de Microscoop en gebruik van tape eventueel strak om het te beveiligen.
- De waterventiel hechten aan een vacuüm (kan niet ongedaan maken de klem nog).
- Sluit de pomp aan op het apparaat van de stroom op de locatie aangegeven op Figuur 1.
- Start de pomp op een debiet van 3,3 mL/min, laten draaien voor ongeveer 5 – 10 s en verwijder vervolgens de bubble trap inlaat/uitlaat klem.
- Laat de pomp om te blijven uitvoeren terwijl de bijlage kolf opwarmt. Zodra de media heeft verspreid in het hele stroomsysteem, Controleer voor normale werking.
- Controleren van hulpstukken voor lucht lekken stroomopwaarts van de pomp (sommige bubble vorming is normaal), of vloeistof lekt stroomafwaarts.
- Controleer of de groei media kolf, PD en FB alle druipende media uit de inlaat buis (indien niet, dit op een verstopte filter, of een overtightened oor-klem duiden kan).
- Controleer met de Microscoop voor bijgevoegde of rollende cellen op de dia kanaal. Een buitensporig aantal cellen kan wijzen op besmetting tijdens de set-up, of dat het membraan van polytetrafluorethyleen (PTFE) van de zeepbel val moeten worden vervangen.
- Zodra de bijlage kolf en incubatie zaal zijn beide bij 37 ° C, genoeg overnachting cultuur van de schimmel cellen aan de kolf van de bijlage te bereiken 1 x 106 cellen/mL toevoegen.
Opmerking: Het volume toe te voegen in µL kan worden berekend met behulp van deze formule:
- Wacht 15 minuten zodat de cellen om te acclimatiseren.
- Open beide groene en oranje kant bijlage kolf kleppen tijdens het sluiten van de beide kleppen kolf groei om te beginnen met de stroom van cellen.
- Wacht ongeveer 5 min om cellen te bereiken van de dia, en toestaan voor initiële zich het concentreren van de Microscoop (ditmaal misschien moet worden aangepast afhankelijk van de lengte van de groene kant-buis). Gedurende deze tijd aanpassen de Microscoop op de dezelfde imaging parameters gebruikt in eerdere experimenten. Als dit de eerste run, gaat u als volgt te werk:
- Overschakelen naar een lage vergroting lucht doelstelling.
- Vinden en gericht op een gekoppelde cel of kleine ontluikende.
- Condensor voor Köhler verlichting configureren en vervolgens overschakelen naar donkerveld.
- Stel de belichtingstijd op 300 ms.
- Aanpassen de lichtdoorlatende intensiteit totdat een kleine cel is dim nog duidelijk zichtbaar tegen de achtergrond (een signaal achtergrond/ratio van ongeveer 7-8 voor een ontluikende dochtercel is een redelijke waarde). Opmerking/mark de verhelderende intensiteit voor toekomstige experimenten.
- Configureer de software voor het verwerven van een afbeelding elke 2 min meer dan 2 uur.
- Beeldacquisitie voor de bijlage fase beginnen. Controleer terug na ongeveer 5 en 10 min om ervoor te zorgen dat focus is gehandhaafd. Als dit niet het geval is, proberen aan te passen de aandacht onmiddellijk na de volgende afbeelding wordt verworven.
- Onmiddellijk nadat de bijlage fase is voltooid, slaat u het bestand en open beide kleppen met groene en oranje kant groei kolf terwijl beide bijlage kolf kleppen sluiten. Wees voorzichtig niet te stoten van het werkgebied als alle kleppen binnen de incubatie-zaal zijn.
- Haal de sonde thermometer van de kookplaat roerder.
- Verwijder de bijlage kolf uit de roerder kookplaat en plaats de kolf groei in zijn plaats.
- Configureren van de software om te verwerven van een afbeelding elke 15 min meer dan 22 h en beeldacquisitie voor de groeifase. Opnieuw gericht zou niet nodig moeten zijn, maar het is raadzaam om te controleren van het apparaat van de stroom na een paar uur.
- Controleren van hulpstukken voor lucht lekken stroomopwaarts van de pomp (sommige bubble vorming is weer normaal), of vloeistof lekt stroomafwaarts
- Selectievakje dat de groei media kolf, PD en FB allemaal zijn druipend media (indien niet, kan dit duiden op een verstopte filter, een overtightened oor-klem, of een klomp op een prikkeldraad montage als flocculate van de cellen wordt gebruikt).
- Controleer het vloeistofniveau in de FB. Als de media is het naderen van de bovenkant van de fles (meer dan 1,5 cm boven de bovenkant van het filter), Draai beide schroefdop (doen niet maak ze los, zoals deze kolf onder druk is). Als ze niet verder versterken zal, blijven het experiment (hoewel dit in een lek resulteren kan), en het vervangen van de rubberen afdichtingen op de PD en FB na de volgende reiniging.
- Wanneer de groei fase overname is voltooid, slaat u het bestand en open vervolgens de groene en oranje kant bijlage kolf kleppen die lawaai maken kunnen zodra de druk op de oranje kant worden vrijgegeven. Optrekken op de groene kant-buis vanuit beide media kolven totdat zij ten minste enkele centimeters boven de media zijn. Voer de pomp op een hoge snelheid (ongeveer 100 mL/min of houd de fast forward knop op de pomp) als u wilt verwijderen van alle media van de buis, waardoor het veel gemakkelijker schoonmaken. Wanneer leeggemaakt, loskoppelen van het apparaat van de stroom van de pomp en verwijder deze uit de Microscoop.
3. Reinig het apparaat van de stroom
- Verwijder alle niet-autoclaaf onderdelen (eenpersoonsgebruik onderdelen waterventiel en temperatuursonde) en autoclaaf het apparaat van de stroom voor 30 min. Discard gebruikt eenmalig gebruik componenten, schone sonde met 70% ethanol, en waterventiel gereserveerd.
- Nadat de autoclaaf is voltooid, media, negeren en spoel en zet opzij media kolven. Sluit de waterventiel opnieuw verbinding maken met een ibidi kanaal dia moet worden gebruikt voor het reinigen van (herbruikbaar) en de stroomsysteem verbinden met de pomp op de locatie die is afgebeeld in Figuur 1.
- Klem gesloten de oranje kant groei kolf klep.
- Plaatsen van circa 200 mL onverdund bleekmiddel in een bekerglas. Plaats de rubberen stoppen in het bleekmiddel, en start de pomp op een hoge snelheid te laten circuleren bleekmiddel in het apparaat van de stroom (met uitzondering van alle filters). Eenmaal gevuld met bleekmiddel, stop de pomp omdat het verlaten van de pomp op een hoge snelheid kan dragen en breken van de buis.
- Na het ontkleuren aangebracht voor 15 min, houd de rubber stoppen boven het bekerglas en start de pomp weer te verwijderen van het bleekmiddel uit het apparaat van de stroom.
- Herhaal stap 3.4 en 3.5 tweemaal met overtollig water in plaats van bleekwater te spoelen de stroomsysteem. Gedurende deze tijd, schoon de filters alleen met water, omdat andere schoonmaakmiddelen roest ontstaat of de filters verstoppen.
- Plaats de buis die normaal verbinding met de 0,2 µm media filter maken zou (afkomstig uit de 2 µm FB) in het bekerglas water met de rubberen stoppen vanaf stap 3.6.
- Loskoppelen van de slang gekoppeld aan de inlaat van de 20 µm inline filter, die kan meestal worden uit elkaar met gemak ondanks de oor-klem getrokken.
- Gebruik een vacuüm filtreerkolf en een lang stuk buis via een vrije 3 holes stop te creëren een vacuümsysteem dat verbinding met het apparaat van de stroom maken kan.
- Dit vacuüm systeem sluit aan op de inlaat van de 20 µm filter inlaat en start het vacuüm; Dit zal water door de filters in de omgekeerde richting, het verwijderen van dode cellen trekken.
- Trek ten minste 200 mL water door de filters, dan verwijderen de slang uit het water te legen van de lijnen van de filter van water.
- Het vacuümsysteem verbreken het 20 µm filter en het filter zijn normale buis sluit.
4. het kwantificeren van de video 's
Opmerking: Alle bestanden moeten worden geconverteerd naar de tag image file (TIF)-indeling te werken. Bovendien, om te vergelijken tussen experimenten, is het essentieel dat alle images zijn geschoten met de dezelfde Microscoop en imaging parameters, zoals hierboven besproken.
- Download en installeer ImageJ indien nog niet geïnstalleerd.
- Downloaden van de aanvullende macro-bestand en plaats deze in de map ImageJ\macros.
- De meegeleverde macro aanpassen
- Een afbeeldingsstapel opent vanuit een eerdere experiment in ImageJ en selecteer een punt van de tijd met cellen aanwezig.
- Selecteer uit het menu via "afbeelding | Type | 8-bit".
- Selecteer uit het menu via "afbeelding | Aanpassen | Drempel". Vink het vakje "donkere achtergrond" . Het dropdown-menu van rechterkant op rood ingesteld.
- Pas de lagere waarde totdat alle cellen zijn bedekt met rood met minimale teveel ruis (sommige niet-cellen speckling is oke, en zal worden verwerkt door de macro). Noteer deze lagere waarde.
- Sluit het venster drempel zowel de afbeelding openen.
- Selecteer uit het menu via "Plugins | Macro's | Bewerken". Wanneer u wordt gevraagd een bestand te openen: "Verplaats omhoog één mapniveau", selecteer vervolgens de macro's map en openen van de stroom-bestand voor macrofuncties biofilm kwantificering.
- Wijzig de waarde bepaald in stap 4.3.4 de 15 waarde in alle exemplaren van "setThreshold (15, 255);" . Sla het bestand op en sluit dit venster.
- Selecteer uit het menu via "Plugins | Macro's | Installeer"en selecteer het bestand dat stroom biofilm kwantificering.
- Nu, onder de "Plugins | Macro's " menu, zes nieuwe opties voor verschillende video ondermeer weergegeven. De volledige analyse uitvoeren en selecteer de gehechtheid en groei video bestanden wanneer gevraagd alle beschikbare analyses uitvoeren op de verworven gegevens en automatisch genereren output bestanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve beelden van een normale nachtelijke time-lapse experiment met wild-type C. albicans cellen bij 37 ° C te zien in Figuur 2 en aanvullende Video 1. De beelden zijn contrast enhanced ter verbetering van de zichtbaarheid. Kwantificering van de oorspronkelijke gegevens werd uitgevoerd, en representatieve grafieken te zien in Figuur 2B. Voor het genereren van deze grafieken, waren de gegevens eerst op het imaginggebied (d.w.z., gedeeld door het totaal opnamegebied) genormaliseerd en het detachement werd verder genormaliseerd naar de biomassa, zoals hierboven beschreven. Bovendien, Toon de gehechtheid en detachement de cumulatieve waarden over de tijd, in plaats van de waarden van de afzonderlijk frame gegenereerd door de stroom biofilm kwantificering macro. Zodra de grafieken dit stadium bereikt hebben, kunnen statistische vergelijkingen door regressieanalyses worden uitgevoerd.
Figuur 1 : Schematische van de twee fasen recirculatie stroom apparatuur. Aansluitende zwarte lijnen geven leidingen, en pijlpunten geven de richting van de stroom bij normaal functioneren. (A) A algemene schematisch overzicht van de stroomsysteem wordt geïllustreerd. Voor het gemak, de stroomsysteem is onderverdeeld in een groene kant (stroomopwaarts van dia) en een oranje kant (stroomafwaarts van de dia). Vet nummers komen overeen met delen die zijn vermeld in de tabel van materialen. Etiketten voor kleppen markeren eenvoudig de locatie voor slang klemmen of hemostats worden geplaatst tijdens de experimenten. Filtervolgorde is als volgt: 8 – 20 µm inline filter, 9-10 µm inline filter 10 – 2 µm filter fles (FB) en 11-0,22 µm Eenpersoonsgebruik wegwerp filter. Schema is niet op schaal. (B) een vergrote weergave van de rubberstop voor de kolf van de bijlage, ter illustratie van de vier onderdelen die de poorten passeren: de media-outlet, de 0,2 µm luchtfilter waarmee gasuitwisseling, de temperatuursonde (vereist een extra gat boren), en de media terug. (C) A vergrote weergave van de pulsatie demping (PD) en de FB, evenals de schroefdop vergadering gebruikt voor elke poort. Deze flessen moeten luchtdicht te laten functioneren. De uitlaat slang voor de PD moet bereiken dieper in de fles dan de inlaat buis voor goede werking. De grijze rechthoek in de FB vertegenwoordigt het stalen filter. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Candida albicans wild-type cellen geteeld onder stroom bij 37 ° C. (A) vertegenwoordiger darkfield microscopie beelden van de microcolonies die onder stroom bij 37 ° C op de aangegeven tijdstippen vormen. Schaal bar = 100 µm. (B) vertegenwoordiger kwantificering afbeeldingsgegevens. De totale biomassa binnen de imaging regio (bepaald door densitometrie analyse), het cumulatieve percentage van gehechtheid van de cel en het percentage biomassa detachement (detachement tarief genormaliseerd naar de biomassa) na verloop van tijd worden weergegeven voor elke stam. Gegevens zijn middelen voor n ≥ 3 experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende Video 1. Candida albicans wild-type cellen geteeld onder stroom bij 37 ° C. Deze time-lapse donkerveld microscopie video toont de gehechtheid van WT cellen op de ondergrond tijdens de fase van de bijlage (tijd die zijn aangegeven in de linker bovenhoek; afbeeldingen verworven elke 2 min), gevolgd door de verdere groei en ontwikkeling tijdens de de groeifase (begint bij 2 h; afbeeldingen verworven elke 15 min). Cel-geplaatste media (1 x 106) werden gebruikt tijdens de fase van de bijlage, terwijl cel-vrije media werden gebruikt tijdens de groeifase. Stroom is van rechts naar links. Schaal bar = 50 µm. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met behulp van de stroomsysteem zorgt zoals hierboven beschreven voor de generatie van kwantitatieve time-lapse video's van schimmel biofilm groei en ontwikkeling. Als u wilt toestaan voor vergelijkingen tussen experimenten is het van cruciaal belang ervoor te zorgen dat de imaging parameters hetzelfde blijven. Het is hierbij om ervoor te zorgen dat de Microscoop is ingesteld voor Köhler verlichting voor elk experiment (vele gidsen zijn online beschikbaar voor dit proces). Naast de imaging parameters, zijn er enkele belangrijke stappen in gedachten te houden wanneer u werkt met het apparaat van de stroom. Ten eerste is het belangrijk ervoor te zorgen dat de waterventiel onder vacuüm wordt gehandhaafd tijdens vloeistofstromen, aangezien niet doen tot lucht leiden zullen wordt getrokken door de waterventiel. Eveneens, wanneer de waterventiel niet onder vacuüm (dat wil zeggen, bij het vervoer van het apparaat van de stroom) zowel de inlaat en de uitlaat moeten blijven geklemd afsluiten; anders zal de lucht lekken via de PTFE-membraan. Deze klem hoeft niet te worden verwijderd totdat de waterventiel nogmaals onder vacuüm wordt geplaatst. Tot slot is het zeer belangrijk om te controleren uw stroom toestellen voor potentiële klompen of lekken. De meest efficiënte manier om te controleren op klompen in uw systeem is te controleren dat er media druipen van de inhammen van de bijlage of groei kolf, de PD en de FB. De media van deze moet worden druipend tegen relatief vergelijkbare tarieven, als alles soepel draait. Als een klomp aanwezig is, kunt u over het algemeen bepalen de locatie als de slang gewoon stroomopwaarts van de klomp zullen meer rigide.
Zodra de gegevens zijn verkregen, bieden wij talrijke ImageJ-macro's voor het kwantificeren van de video's. Deze macro's bepalen meerdere parameters van biofilm groei en ontwikkeling, met inbegrip van een maatregel van de biomassa, en het tarief dat cellen koppelen aan en loskoppelen van de oppervlakte of de biofilm. Hieronder vindt u beschrijvingen van de verstrekte macro's.
Volledige analyse uitgevoerd van alle onderstaande analyses en uitgangen automatisch de gegevens. Deze macro kan worden uitgevoerd zonder een open spiegelbeeld vijl, terwijl alle anderen een open video vereisen. Wanneer uitgevoerd, zal het de gebruiker een bijlage stapel bestand, vervolgens een groei stapel bestand te openen. Na dit, zal het automatisch analyseren van de beelden en output van een gegevensmap met alle gegevenstabellen, zoals hieronder beschreven, naar dezelfde map als de bijlage spiegelbeeld vijl. De bijlage teller macro wordt alleen uitgevoerd op het bijlagebestand; alle andere analyses worden uitgevoerd op een aaneengeschakelde stapel van de gehechtheid en groei bestanden. De uitvoergegevens gegenereerde bestanden zijn tekstbestanden, maar moeten worden geïmporteerd in excel voor gebruiksgemak.
De intensiteit van de som -analyse analyseert elk frame van het actieve venster. Het is de som van alle grijze waarden voor elke pixel dat boven de lagere drempel in stap 4.3.7 aangewezen en uitgangen een cumulatieve waarde per frame. De waarden die zijn gegenereerd in verhouding staan tot de biomassa aanwezig binnen het frame, tot elke camera verzadiging dat zich voordoet. De gegevens moeten vervolgens worden genormaliseerd naar het gebied van de beeldvorming regio; Dit gebeurt niet door de macro.
Het dekkingsgebied analyse analyseert elk frame van het actieve venster voor de ruimte van het frame dat wordt gedekt door cellen (boven de lagere drempelwaarde) als een percentage.
De bijlage teller zal frame aftrekken gebruiken om te bepalen van de intensiteit van de som van alle cellen die tussen elk frame koppelen. Het eerste gegevenspunt is dus de biomassa van de cellen die tussen frames 1 en 2 koppelen; het tweede gegevenspunt is de biomassa van de bevestigen cellen tussen frames 2 en 3, enz. Deze gegevens moeten op het gebied van de beeldvorming regio worden genormaliseerd. Voor gemakkelijker leesbaarheid is het ook handig om deze waarde vóór graphing integreren.
De detachement teller werkt hetzelfde als de bijlage teller, maar keert de frame aftrekken, zodat het bepaalt de intensiteit van de som van de cellen die tussen elk frame loskoppelen. Deze gegevens moeten ook worden op het gebied van de beeldvorming regio genormaliseerd en voorafgaand aan graphing geïntegreerd. Voorafgaand aan integratie, kan deze gegevens verder worden genormaliseerd naar de intensiteit van het totale bedrag van het voorafgaande frame berekend in de analyse van de som intensiteit . Deze nieuwe waarde vertegenwoordigt het aantal cellen die loskoppelen van de biofilm op dat punt van tijd, dat vaak meer is waardevolle gegevens, aangezien de biomassa van het loskoppelen van de cellen zal toenemen met toenemende biofilm biomassa.
Terwijl de stroomsysteem hier gepresenteerd meer ingewikkeld om te bouwen en te beheren dan andere systemen van stroom is, biedt het verschillende voordelen. Veel van deze voordelen voortvloeien uit het gebruik van een commercieel beschikbare kanaal dia. De weefselkweek behandelmethoden voor deze dia's is voldoende om Candida -cellen om zich te houden aan de oppervlakte. Bovendien, kunt het profiel van de dia van dit kanaal vergelijkbaar met een traditionele dia te gemakkelijk worden gebruikt op een breed scala aan Microscoop systemen, met inbegrip van rechtop microscopen met doorvallend licht bij lage vergroting. Gebruik van dit type van Microscoop konden we donkerveld microscopie, waardoor het kwantificeren van gegevens veel gemakkelijker, vooral in vergelijking met fluorescent microscopie (als er geen photobleaching en lage fototoxiciteit was) gebruiken. Traditionele microscopie (zonder optische afdelen), is macht conservatief, zin uit focus cellen dragen vergelijkbaar aantal fotonen aan een afbeelding zoals in focus cellen van vergelijkbare grootte12. Dit betekent dat, ondanks onze enkel vliegtuig voor imaging, de volledige 3D groeiende biofilm nog worden gekwantificeerd gedurende het gehele experiment, ook al zijn de hogere regionen onscherp. Deze single-vliegtuig imaging heeft het voordeel dat het drastisch verlagen van de fototoxiciteit schade aan cellen, maar wordt geen informatie verstrekken over de 3D-architectuur van de biofilm. Deze stroomsysteem kan echter ook worden gebruikt met fluorescerende cellen en confocal microscopen te verkrijgen van deze informatie13.
De unieke twee kolf opnieuw circuleren installatie van onze apparatuur van stroom ook heeft vele voordelen. Eerste, veel stroom systemen vereisen dat de dia's worden vooraf bezaaid met cellen, echter het gebruik van een aparte cel-geplaatste bijlage kolf laat ons toe om beeld en kwantificeren van cellen als ze aan de dia terwijl onder stroom voldoen, en wij het gevoel dat dit is meer vergelijkbaar met wat er gebeurt < c0 > in vivo. Daarnaast hebben we eerder geweest kundig voor aanpassen van onze Microscoop voor snelle beeldvorming en imago hechting gebeurtenissen zoals ze zich in real-time, in tegenstelling tot het kwantificeren van hen na het feit11. Ten tweede, hebben een cel-free groei kolf die recirculates en cel-gratis over een verlenging toegestaan ons om te begrijpen hoe biofilms groeien onder stroom gedurende meer dan 24 uur van de duur kan worden gehandhaafd, een duur die typisch kan niet worden verwezenlijkt met niet-opnieuw circuleren systemen . We hebben nog niet de bovengrens van de tijd van wat kan worden bereikt met onze stroomsysteem bepaald, maar we hebben met succes afgerond 36 h experimenten; echter, hoe langer het experiment, hoe groter de kans op een lek of een verstopte filter. Talrijke factoren kunnen van invloed zijn op de potentiële duur van een experiment, met inbegrip van het groeitempo op jaarbasis van de cellen, hoe zelfklevend zijn en de mate van de vorming van de schimmeldraden, waardoor het moeilijk is vast te stellen van een bovengrens op de duur van een experiment. Echter desgewenst veel langere duur zijn dan met de apparatuur van stroom kan worden bereikt zoals gepresenteerd, kunnen de filters worden vervangen door een in-line ultraviolet (UV) sterilisatie box zoals al eerder beschreven8. Dit vak sterilisatie kan ook toestaan dit apparaat van de stroom moet worden gebruikt om te afbeelding bacteriën; onze vorige pogingen om te afbeelding bacteriestammen resulteerde in snelle verstopping van de 0,2 µm filter. Uiteindelijk hebben we gekozen niet aan te nemen van UV-sterilisatie, zoals het vak is op maat vervaardigd, en aangezien dit zou resulteren in het opnieuw circuleren van dode cellen.
Een ander voordeel van deze stroomsysteem is dat het redelijk goedkoop ten opzichte van de commerciële systemen, vooral als u voor de aankoop van een microscoop met het. In ons lab konden we kopen een fundamentele doorvallend licht benchtop Microscoop en plaats de hele Microscoop binnen een grote standaard convectie incubator. De enige belangrijke eis is dat de Microscoop een sluiter functie (mechanisch of elektrisch moeten) om uit te voeren van time-lapse microscopie.
Terwijl dit systeem veelzijdig is en vele voordelen biedt, is het een lage doorvoersnelheid methode. Onze stroom-apparaat is niet in staat om te groeien van meerdere stammen in parallel, in tegenstelling tot andere systemen beschikbaar stroom. Als gevolg van de uitgebreide voorbereiding en schoonmaak tijd zijn we alleen kunnen uitvoeren van twee experimenten per week. Vele andere systemen van de stroom zijn echter nogal kostbaar, en kunnen verstoppen wanneer Candida -cellen worden gekweekt onder schimmeldraden voorwaarden vormen.
Bovendien, deze stroomsysteem is vrij complex in vergelijking met anderen, en moeilijk om in werking te houden kan zijn. Na veel experimenten, filters beginnen te verstoppen, buis begint te dragen dun en delen beginnen te roesten of losse; dus waarvoor deze onderdelen worden vervangen. Het gebruik van filters maakt dit systeem onverenigbaar is met de voorwaarden van de groei van sommige schimmel stammen; in het bijzonder, zal alles wat flocculatie induceert het 20 µm in-line filter snel verstoppen. Echter, met voldoende ervaring in het gebruik van het stroomsysteem, het makkelijker om te ontdekken van potentiële problemen voordat ze in een mislukte experiment resulteren. Een ding dat kan worden gedaan om de dagelijkse werking van het apparaat van de stroom een beetje eenvoudiger is dat een machinist maken een replica van de waterventiel huisvesting uit een autoclaaf materiaal (zoals aluminium of roestvrij staal), zodat u de zeepbel autoclaaf overlappen met de rest van het apparaat van de stroom, zoals de PTFE-membraan en adapter componenten van het waterventiel autoclaaf zijn.
Kortom, vertegenwoordigt de twee fasen recirculatie stroom apparatuur hier gepresenteerde een uniek model voor het beeld en kwantificeren van in vitro biofilm vorming van schimmels onder stroom en in real-time. Terwijl het systeem zijn beperkingen heeft, het is hoogst aanpasbaar en werkt goed met de meeste microscopen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs wil erkennen van Dr. Wade Sigurdson voor het verstrekken van waardevolle inbreng in het ontwerp van het apparaat van de stroom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pump | Cole Parmer | 07522-20 | 6 |
| Pump head | Cole Parmer | 77200-60 | 6 |
| Tubing | Cole Parmer | 96410-14 | N/A |
| Bubble trap adapter | Cole Parmer | 30704-84 | 3 |
| Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line | Cole Parmer | 31500-55 | 3 |
| In-line filter adapter (4 needed) | Cole Parmer | 31209-40 | 8,9 |
| Orange-side Y | Cole Parmer | 31209-55 | 7 |
| Green-side Y | ibidi | 10827 | 2 |
| * Slides | ibidi | 80196 | 4 |
| * Slide luers | ibidi | 10802 | 4 |
| Vacuum assisted Bubble trap | Elveflow/Darwin microfluidics | KBTLarge - Microfluidic Bubble Trap Kit | 3 |
| Media flasks | Corning | 4980-500 | 1 |
| 0.2 µm air filter | Corning | 431229 | 1 |
| Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed) | Corning | 1395-100 | 5,10 |
| Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed) | Wheaton | 1129750 | 5,10 |
| Screwcap tubing connector | Wheaton | 1129814 | 5,10 |
| Tubing connector beveled washer | Danco | 88579 | 5,10 |
| Tubing connector flat washer | Danco | 88569 | 5,10 |
| Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed) | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 15100002-100 | 7,8,9 |
| Clamp tool | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 14100386 | N/A |
| 20 μm in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1331 | 8 |
| 10 μm in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1333 | 9 |
| 2 μm inlet media filter | Supelco/Sigma-Aldrich | 58267 | 10 |
| * 0.22 µm media filter | Millipore | SVGV010RS | 11 |
| * 0.22 µm media filter “adapter” | BD Biosciences | 329654 | 11 |
| Rubber stopper | Fisher Scientific | 14-131E | 1 |
| Hotplate stirrer with external probe port | ThermoFisher Scientific | 88880006 | N/A |
| Temperature probe | ThermoFisher Scientific | 88880147 | N/A |
References
- Pankhurst, C. L. Candidiasis (oropharyngeal). BMJ clinical evidence. 2012, 1304 (2012).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Revista iberoamericana de micología. 18 (4), 163-170 (2001).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Current biology: CB. 15 (12), 1150-1155 (2005).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Current opinion in microbiology. 9 (6), 588-594 (2006).
- Araújo, D., Henriques, M., Silva, S. Portrait of Candida Species Biofilm Regulatory Network Genes. Trends in microbiology. 25 (1), 62-75 (2017).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of visualized experiments. (59), e3349 (2012).
- Bakker, D. P., van der Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Applied and environmental microbiology. 69 (10), 6280-6287 (2003).
- Zhang, W., Sileika, T. S., Chen, C., Liu, Y., Lee, J., Packman, A. I. A novel planar flow cell for studies of biofilm heterogeneity and flow-biofilm interactions. Biotechnology and bioengineering. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J. L. An easy and economical in vitro method for the formation of Candida albicans biofilms under continuous conditions of flow. Virulence. 1 (6), 483-487 (2010).
- Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
- McCall, A., Edgerton, M. Real-Time Approach to Flow Cell Imaging of Candida albicans Biofilm Development. Journal of fungi. 3 (1), Basel, Switzerland. 13 (2017).
- Zhang, B., Zerubia, J., Olivo-Marin, J. -C. Gaussian approximations of fluorescence microscope point-spread function models. Applied optics. 46 (10), 1819-1829 (2007).
- Tati, S., et al. Candida glabrata Binding to Candida albicans Hyphae Enables Its Development in Oropharyngeal Candidiasis. PLoS pathogens. 12 (3), 1005522 (2016).
