Summary
Vi beskriver montering, drift, och rengöring av ett flöde apparater för bild-svamp biofilm bildning i realtid medan under flöde. Vi tillhandahåller också och diskutera kvantitativa algoritmer som ska användas på de förvärvade bilderna.
Abstract
I orofaryngeal candidiasis, måste medlemmar av släktet Candida följa och växa på muntliga slemhinneepitel medan under påverkan av saliv flöde. Och modeller för tillväxt under flöde har utvecklats, många av dessa system är dyra, eller Tillåt inte imaging medan cellerna är under flöde. Vi har utvecklat en ny apparat som tillåter oss att bild tillväxt och utveckling av Candida albicans celler under flöde och i realtid. Här, detalj vi protokollet för montering och användning av denna apparat i flöde, samt kvantifiering av data som genereras. Vi kan kvantifiera de priser som cellerna fäst och lossa från bilden, samt att fastställa ett mått av biomassa i bilden över tid. Detta system är både ekonomiskt och mångsidigt, arbetar med många typer av ljus Mikroskop, inbegripet billig bänkmonterade Mikroskop, och kan utökas imaging gånger jämfört med andra flödessystem. Sammantaget är detta en låg genomströmning-system som kan ge mycket detaljerade realtid information om biofilm tillväxten av svamp arter under flöde.
Introduction
Candida albicans (C. albicans) är en opportunistisk svamp patogen för människor som kan infektera många vävnadstyper, inklusive oral slemhinne ytor, orsakar orofaryngeal candidiasis och resulterar i en lägre livskvalitet för drabbade individer1. Biofilm bildning är ett viktigt kännetecken för patogenesen av C. albicans, och många studier har gjorts på bildandet och funktionen av C. albicans biofilmer2,3,4, 5, varav många har utförts med statisk (inget flöde) in vitro- modeller. C. albicans måste dock följa och växa i närvaro av saliv flöde i munhålan. Talrika flödessystem har utvecklats för att tillåta för live-cell imaging6,7,8,9,10. Dessa olika flödessystem har utformats för olika ändamål, och därför varje system har olika styrkor och svagheter. Vi fann att många av flödet system lämpliga för C. albicans var kostsamma, krävs komplex fabricerade delar, eller kan inte avbildas under flöde och måste att stoppas innan imaging. Därför utvecklade vi en roman flöde apparater för att studera C. albicans biofilm bildning under flöde11. Under utformningen av vår flöde apparater följde vi dessa stora överväganden. Först, vi ville kunna kvantifiera flera aspekter av biofilm tillväxt och utveckling i realtid utan att kräva användning av fluorescerande celler (tillåter oss att studien mutant stammar och omodifierad kliniska isolat enkelt). För det andra ville vi alla delar ska vara kommersiellt tillgänglig med lite att inga ändringar (dvs., ingen anpassad fabrication), tillåter andra att mer enkelt återskapa vårt system och möjliggör lätt reparationer. För det tredje, vi ville också möjliggör utökade imaging gånger vid någorlunda höga flöden. Slutligen, vi ville, efter en period av celler fästa på substratet under flöde, för att kunna övervaka den biofilm tillväxten över en längre tid utan att införa nya celler.
Dessa överväganden ledde oss till att utveckla den två-kolv recirkulerande flödessystem illustreras i figur 1. Två kolvar tillåter oss att dela experimentet till två faser, en bifogad fil fas som drar från cell-seedade fastsättning kolven och en tillväxtfas som använder cell-fria medier för att fortsätta biofilm tillväxten utan tillsats av nya celler. Systemet är utformat för att arbeta med en inkubation kammare för mikroskopet, med bilden och slangen före det (2 – 5, figur 1) placeras inuti inkubatorn, och alla andra komponenter placeras i en stor sekundär behållare utanför den Mikroskop. Dessutom används en kokplatta omrörare med en bifogad temperatursond för att upprätthålla svampceller i bifogad fil kolven vid 37 ° C. Som det är recirkulerande, detta system klarar av kontinuerlig avbildning under flöde (kan vara över 36 h beroende på villkor), och kan användas på de flesta vanliga Mikroskop, inbegripet upprätt eller omvänt bänkmonterade Mikroskop. Här diskuterar vi montering, drift och rengöring av flow apparaten, samt som ger några grundläggande ImageJ kvantitativa algoritmer att analysera videor efter ett experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Montera Flow apparaten
- Konfigurera de delar som anges i Tabell av material enligt schematiskt Figur 1 med överväganden diskuteras nedan.
Notera: För enkelhetens skull flödet apparater är uppdelad i två sidor, den gröna sidan (allt uppströms av bilden till media kolvar) och orange sida (allt nedströms av bilden till media kolvar).- Se till att allt flöde apparaten är lufttäta som att förhindra läckor, med undantag av media kolvar (figur 1, 1). För att åstadkomma detta, gäller rörmokare tejp för alla manliga gängning innan montering utom den pulsering dämpare (PD) och 2 µm filter flaska (FB), som inte kräver rörmokare tejp som gummipackningar förvara dem lufttätt.
- Tillämpa öra klämmor på varje hullingförsedda montering som är positiva påtryckningar under normal drift (dvsnedströms pumpen).
- Använd färgkodade lab band att märka de ventil platserna med en A- eller G (för fastsättning och tillväxt, respektive), platsen pump, på bilden anslutning platser och 0,2 µm filter anslutningen.
- Bestäm längden på slangen som ska användas baserat på avståndet mellan flödessystem och Mikroskop, att hålla i minnet att alla flöde utrustningen nedströms av pumpen till kolvar (majoritet av orange sida) skall vara i sekundär inneslutning. Lägg till ca 1 m av extra slangar uppströms bilden (och helst i bubbelfällan) att placera inom Mikroskop inkubation kammaren, eftersom detta garanterar att alla media når bilden kommer att vara vid rätt temperatur.
- Plats bubbelfällan så nära som möjligt till bild, helst inne i inkubation kammaren under ett experiment (bubblor ofta form längs slangar väggen); men tänk på att det måste vara ansluten till ett vakuum att fungera.
- Se till att slangen mellan FB och den 0,2 µm engångsfiltret är ca 0,5 m lång.
- Lägga till en ca 2 cm magnetisk uppståndelse bar till varje media-kolv.
- Skaffa någon form av slang klämmor att agera som avstängningsventiler som är (Peanger kan användas).
- För enkel användning, hålla flödet apparaten i ett autoklaverbart korg. Det kan vara bra att ha en andra mindre korg i en större en till tillåta lätt separation av gröna sida och den orange sidan.
- För fastsättning kolven, med ett 4 mm borr, borra ett extra hål i gummiproppen att rymma termisk sonden (var försiktig att inte gå igenom ett annat hål). För att få slangen genom hamnarna, tryck slangen genom med pincett; en gång igenom, klämma slangen för att hålla den på plats, och sedan dra pincetten tillbaka ut.
Obs: Om det inte är möjligt att lägga till den extra hål gummipropp, fungerar en bred mun skruv flaska med skruvlock fyra portar i stället för kolven och gummi proppen.
- När systemets flöde har varit färdigmonterad, stäng ventilerna både gröna och orange sida tillväxt mätkolvar. Använda vatten med bifogad kolv slangen och en graderad cylinder för att kalibrera den peristaltiska pumpen enligt tillverkarens anvisningar.
2. utför ett Experiment
- Dagen innan experimentet, börja förvärmning på mikroskopet inkubation kammaren till 37 ° C, och förbereda en övernattning kultur av en svamp stam (fluorescens krävs inte).
- Samla engångsbruk komponenter och pump, och placera i en steril biosäkerhet skåp.
- Ta bort bubblan fällan och temperatur sond från flow apparaten och placera dessa i skåpet biosäkerhet.
- Reder ut och organisera slangen, om det behövs.
- Autoklav flow apparaten, inklusive stir barer, för 30 min att säkerställa steriliteten; När du är klar att överföra till biosäkerhet skåp.
- Bifoga bubbelfällan, temperatursond och alla engångsbruk komponenter (utom i bilden) som avbildas i figur 1.
- För det 0,2 µm filtret (figur 1, 11), ta bort kolven från 1 mL sprutan att göra det som en ”adapter”. Tvinga slangen från FB i detta syfte, och bifoga det 0,2 µm filtret till slangen leder till tillväxt kolven.
- Applicera silikonfett vakuum runt barb av bild adaptern (var försiktig att inte få något fett på insidan) innan du ansluter den, eftersom detta hjälper till att förhindra luftläckage in i systemet.
- Fyll i bifogade kolven med 100 mL 1% (w/v) jästextrakt, 2% (w/v) pepton och 2% (w/v) glukos (YPD) och fyll tillväxt kolven med 200 mL YPD. Se till att den gröna sida slangen når media i varje kolv.
- Kontrollera att alla ventiler är öppna. Bifoga bubbelfällan till ett vakuum och ansluta pumpen till gröna sidan slangen nedströms i bubbelfällan.
- Pumpa vätskan med en flödeshastighet av 3,3 mL/min till helt fylla den gröna sidan, sedan dosera och kassera cirka 1 – 2 mL av media eftersom de första par milliliter innehåller ofta döda celler eller slumpmässiga skräp. Se till att den gröna sidan av slangen fylls med media, och har inga bubblor nedströms bubbla fällans innan du fortsätter.
- Fyll kanal bilden och reservoaren med YPD, noga med att inte införa bubblor.
- Anslut bilden till flöde apparater och pumpen mer vätska för att skapa en buffert på ca 0,5 m på orange sida. Detta är att förhindra oavsiktligt svällning luft i bilden vid återflödet.
- Förbereda flow apparaten för transport till mikroskopet: Clamp stängt in- och utlopp av bubbelfällan och klämma den gröna och orange side fastsättning kolv ventiler stängda. Se till att skruven mössor för PD och FB tight som de kan lossa under autoklavering.
- Koppla bort pumpen från slangen för att underlätta transport. Flytta sedan alla komponenter, inklusive kokplatta omröraren, i en sekundär behållare nära mikroskopet.
- Förbereda flow apparaten för avbildning.
- Bifoga den temperatur sonden till kokplatta omröraren och påbörja uppvärmning fastsättning kolven till 37 ° C. Rör om media vid 300 rpm och upprätthålla detta för hela experimentet.
- Montera bilden på mikroskopet och använda tejp om det är nödvändigt att ordentligt förankra det.
- Bifoga bubbelfällan till ett vakuum (inte ångrar klämman ännu).
- Ansluta pumpen till flow apparaten på plats som anges i figur 1.
- Starta pumpen med en flödeshastighet av 3,3 mL/min, låta det köras för cirka 5 – 10 s och ta sedan bort bubblan fälla inlopp/utlopp klämman.
- Låt pumpen för att fortsätta köra medan fastsättning kolven värms upp. När media har cirkulerat hela flödet systemet, kolla för normal drift.
- Kontrollera beslag för luftläckaget i uppströms pumpen (vissa bubbla bildandet är normalt), eller vätska som läcker ut nedströms.
- Kontrollera att den tillväxt medier kolv, PD och FB är alla droppande media från inlopp röret (om inte, kan detta tyda på ett igensatt filter eller en hårt öra klämma).
- Kontrollera bifogade eller rullande celler i kanal-bilden med hjälp av mikroskopet. Ett alltför stort antal celler kan tyda kontaminering under set-up, eller att polytetrafluoreten (PTFE) membranet i bubblan fälla behöver bytas ut.
- När bifogade kolv och inkubation kammaren är både vid 37 ° C, lägga till bifogade kolven att nå 1 x 106 celler/mL tillräckligt övernattning kultur av svamp cellerna.
Obs: Volymen för att lägga till i µL kan beräknas med följande formel:
- Vänta 15 min så att cellerna att acklimatisera.
- Öppna båda gröna och orange side fastsättning kolv ventiler medan stänga båda tillväxt kolv ventilerna för att starta flödet av celler.
- Vänta cirka 5 minuter att tillåta celler att nå i bilden, och möjliggör initial fokusering av mikroskopet (denna tid kan behöva justeras beroende på längden av den gröna sida slangen). Under denna tid justera mikroskopet till samma imaging parametrar används i tidigare experiment. Om detta är den första körningen, Följ dessa steg:
- Växla till en låg förstoring luft mål.
- Hitta och fokusera på en bifogad cell eller små spirande cell.
- Konfigurera kondensor för Köhler belysning och sedan växla till darkfield.
- Ställa in exponeringstiden till 300 ms.
- Justera den lysande intensiteten tills en liten cell svagt ännu tydligt mot bakgrunden (en signal till bakgrunden förhållandet mellan cirka 7 – 8 för en spirande dotter cell är ett rimligt värde). Obs/mark lysande intensiteten för framtida experiment.
- Konfigurera programvaran för att förvärva en bild varje 2 min över 2 h.
- Börja bild förvärv för fasen fastsättning. Kontrollera tillbaka efter ca 5 och 10 min att se till att fokus har bibehållits. Om inte, försök att justera fokus omedelbart efter nästa bild förvärvas.
- Omedelbart efter den bifogade fasen är klar, spara filen, och öppna sedan både gröna och orange sida tillväxt kolv ventiler medan stänga båda fastsättning kolv ventilerna. Se till att inte stöta scenen om några ventiler släpper inkubation kammaren.
- Koppla bort sonden termometer från kokplatta omröraren.
- Ta bort bifogad fil kolven från kokplatta omröraren och placera tillväxt kolven i dess ställe.
- Konfigurera programvaran för att förvärva en bild varje 15 min över 22 h och börja bild förvärv för tillväxtfasen. Bör inte vara nödvändigt att åter fokusera, men det rekommenderas starkt att kontrollera flödet apparaten efter några timmar.
- Kontrollera beslag för luftläckaget i uppströms pumpen (igen vissa bubbla bildandet är normalt), eller vätska som läcker ut nedströms
- Kontrollera att den tillväxt medier kolv, PD och FB är alla droppande media (om inte, kan detta tyda på ett igensatt filter, en hårt öra klämma eller en täppa på en taggtråd passande om cellerna används flockas).
- Kontrollera vätskenivån i FB. Om media närmar sig toppen av flaskan (över 1,5 cm ovanför toppen av filtret), dra båda skruvlock (inte lossa dem, eftersom denna kolv är under tryck). Om de inte kommer att dra vidare, fortsätta experimentet (även om detta kan leda till en läcka), och ersätta gummipackningar på PD och FB efter nästa rengöring.
- När tillväxt fas förvärvet har färdig, spara filen och sedan öppna gröna och orange side fastsättning kolv ventilerna som får göra en buller som trycket släpper på orange sida. Dra upp på gröna sidan slangen kommer från både media kolvar tills de är minst flera centimeter ovanför media. Köra pumpen med hög hastighet (ca 100 mL/min eller håll knappen snabbspolning framåt på pumpen) för att ta bort alla medier från slangen, vilket gör rengöringen mycket lättare. När töms, koppla flödet apparaten från pumpen och ta bort den från Mikroskop.
3. ren Flow apparaten
- Ta bort alla icke-autoklaverbart komponenter (engångsbruk komponenter, bubbelfällan och temperatursond), och autoklav flow apparaten för 30 min. Kassera använt engångsbruk komponenter, ren sond med 70% etanol, och avsätta bubbelfälla.
- Efter autoklavering är färdig, ignorera media, och skölj och avsätta media kolvar. Sedan åter ansluta bubbelfällan, ansluta en ibidi kanal bild som ska användas för rengöring (återanvändas) och ansluta systemets flöde pumpen på den plats som visas i figur 1.
- Klämman stängd orange sida tillväxt kolv ventilen.
- Placera ca 200 mL outspädd blekmedel i en bägare. Placera gummiproppar till lut och startar pumpen vid hög hastighet för att cirkulera blekmedel i hela flödet apparaten (förutom alla filter). När fyllt med blekmedel, stoppa pumpen eftersom lämnar pumpen på med hög hastighet kan bära och bryta slangen.
- Efter blekning för 15 min, håll gummistoppers ovan bägaren och starta pumpen igen för att ta bort lut från flow apparaten.
- Upprepa steg 3,4 och 3,5 gånger med överflödigt vatten i stället för blekmedel att skölja flödessystem. Under denna tid, ren filtren bara med vatten eftersom andra rengöringsmedel fräta eller täppa till filtren.
- Placera slangen som normalt ansluter till 0,2 µm media filtret (kommer från de 2 µm FB) i bägare vattnet med gummiproppar från steg 3.6.
- Koppla bort slangen kopplad till inloppet av 20 µm inline filter, som vanligtvis kan dras isär med lätthet trots öra klämman.
- Använda en vakuum filterkolv och ett långt avsnitt av slangar genom en extra 3-håls propp för att skapa ett vakuum som kan ansluta till flow apparaten.
- Anslut detta vakuum system till inloppet av 20 µm filter inlopp och starta dammsugaren; Detta kommer att dra vatten genom filtren i omvänd riktning, ta bort döda celler.
- Dra minst 200 mL vatten genom på filter och sedan på ta bort slangen från vattnet för att tömma filtret raderna i vatten.
- Koppla bort vakuum systemet från 20 µm filter och återanslut filter till dess normala slangar.
4. kvantifiering av videor
Obs: Alla filer måste konverteras till tagg bild (TIF) formatet att arbeta. Dessutom, för att jämföra mellan experiment, är det viktigt att alla bilder är tagna med samma mikroskopet och imaging parametrar, som diskuterats ovan.
- Hämta och installera ImageJ om inte redan är installerad.
- Hämta den kompletterande makro-filen och placera den i mappen ImageJ\macros.
- Justera angivna makrot:
- Öppna en bildstapel från en tidigare experiment i ImageJ och välj en tidpunkt med celler som finns.
- Välj från menyn via ”bild | Typ | 8-bitars ”.
- Välj från menyn via ”bild | Justera | Threshold ”. Markera rutan ”Mörk bakgrund” . Ställa in menyn höger till rött.
- Justera det lägre värdet tills alla celler är täckta med minimalt överflödigt brus (vissa icke-cell prickar är okej och kommer att behandlas ut av makrot) rött. Anteckna detta lägre värde.
- Stäng både fönstret tröskel och den öppna bilden.
- Välj från menyn via ”Plugins | Makron | Redigera ”. När du uppmanas att öppna en fil: ”flytta upp en mappnivå”, markera mappen makron och öppna filen flöde biofilm kvantifiering makro.
- Ändra värdet 15 i alla instanser av ”setThreshold (15, 255)”; till det värde som fastställts i steg 4.3.4. Spara filen och Stäng fönstret.
- Välj från menyn via ”Plugins | Makron | Installera ”och välj filen flöde biofilm kvantifiering.
- Nu, under ”Plugins | Makron ” -menyn visas sex nya alternativ för olika video kvantifieringar. Kör fullständig analys och välj fastsättning och tillväxt videofiler när du uppmanas att utföra alla tillgängliga analyser på förvärvade data och automatiskt generera utdatafiler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa bilder av en normal övernattning time-lapse experiment med vildtyp C. albicans celler vid 37 ° C kan ses i figur 2A och kompletterande Video 1. Bilderna har varit kontrast för att förbättra sikten. Kvantifiering av de ursprungliga uppgifterna utfördes, och representativa grafer kan ses i figur 2B. För att generera dessa grafer, data var först normaliserade till området imaging (dvs, dividerat med den totala imaging område) och avskildheten var ytterligare normaliserade till biomassa, som beskrivs ovan. Dessutom visar den bifogade filen och avlossning de ackumulerade värdena över tid, snarare än de enskilda ram-värden som genereras av makrot flöde biofilm kvantifiering. När diagrammen har nått detta stadium, kan statistiska jämförelser utföras genom regressionsanalyser.
Figur 1 : Schematisk av tvåfas recirkulerande flow apparaten. Anslutande svarta linjerna anger slangar och pilspetsar anger riktningen av flödet under normal drift. (A) A Schematisk överblick över systemets flöde illustreras. För bekvämlighet, systemets flöde är uppdelad i en grön sida (uppströms bild) och en orange sida (nedströms bild). Djärva siffrorna motsvarar delarna som anges i tabell av material. Etiketter för ventiler helt enkelt markera platsen för slang klämmor eller Peanger placeras under experiment. Filtret är följande: 8 – 20 µm inline filter, 9 – 10 µm inline filter, 10 – 2 µm filter flaska (FB) och 11 – 0,22 µm engångsbruk disponibla filter. Schematiska är inte skalenlig. (B) en närbild av gummiproppen för fastsättning kolven, som illustrerar de fyra komponenter som passera genom portarna: media utlopp, 0,2 µm luftfiltret som tillåter gasutbyte, den temperatursond (kräver borra ett extra hål), och media tillbaka. (C), en närbild av den pulsering dämpare (PD) och FB, samt skruvlock montering används för varje port. Dessa flaskor behöver vara lufttät till funktion. Utlopp slangen för PD bör nå djupare in i flaskan än inlopp slangen för väl fungerande. Den grå rektangeln i FB representerar stål filtret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Candida albicans vildtyps-celler odlas under flöde vid 37 ° C. (A) representant darkfield mikroskopi bilder av den microcolonies som bildar under flöde vid 37 ° C angivna punkter. Skalstapeln = 100 µm. (B) representativ kvantifiering bilddata. Den totala biomassan inom regionen imaging (bestäms av densitometry analys), den kumulativa incidensen av cell fastsättning och procent biomassa avskildheten (avlossning rate normaliserade till biomassa) över tid visas för varje stam. Data är medel för n ≥ 3 experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Video 1. Candida albicans vildtyps-celler odlas under flöde vid 37 ° C. Denna time-lapse darkfield mikroskopi video visar kvarstad på WT celler till substratet under fasen fastsättning (tid som anges i det övre vänstra hörnet; bilder förvärvade varje 2 min), följt av efterföljande tillväxt och utveckling under de tillväxtfas (börjar på 2 h; bilder förvärvade varje 15 min). Cell-seedade media (1 x 106) användes under fastsättning fas, medan cell-fria medier användes under tillväxtfasen. Flödet är från höger till vänster. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Använder systemets flöde kan enligt ovan för generering av kvantitativa time-lapse video av svamp biofilm tillväxt och utveckling. För att möjliggöra jämförelser mellan experiment är det av avgörande betydelse att säkerställa att parametrarna imaging hålls samma. Detta inkluderar att säkerställa att mikroskopet är inställd för Köhler belysning för varje experiment (många guider är tillgängliga online för denna process). Bortsett från imaging parametrar, finns det några viktiga steg att ha i åtanke när du arbetar med flow apparaten. Först, är det viktigt att säkerställa att bubbelfällan upprätthålls under vakuum under vätskeflöde, eftersom underlåtenhet att göra detta kommer att leda till luft dras in genom bubbelfällan. Likaså när bubblan fällan inte är under vakuum (dvs.vid transport av flow apparaten) måste både in- och utlopp förbli spänns shut; annars kommer luft läcka i genom PTFE membran. Denna klämma behöver inte avlägsnas förrän bubbelfällan placeras återigen under vakuum. Slutligen är det mycket viktigt att övervaka ditt flöde apparater för potentiella träskor eller läckor. Det mest effektiva sättet att kontrollera för träskor i ditt system är att kontrollera att det finns media droppande från öppningarna av bifogad fil eller tillväxt kolven, PD och FB. Media från dessa bör droppande på relativt liknande priser om allt fungerar smidigt. Om en täppa är närvarande, kan du vanligtvis bestämma på plats som slangen bara uppströms täppa blir styvare.
När data har erhållits, ge vi många ImageJ makron för att kvantifiera videor. Dessa makron avgöra flera parametrar av biofilm tillväxt och utveckling, inklusive ett mått av biomassa, och den ränta som celler tillmäter och loss från ytan eller biofilm. Beskrivningar av de medföljande makrona finns nedan.
Fullständig analys utför alla analyser som anges nedan, och utgångar automatiskt data. Detta makro kan utföras utan en öppen bildfil medan alla andra kräver en öppen video. När utförat, vilja den snabb användaren att öppna en bifogad stack fil, sedan en tillväxt stack fil. Efter detta kommer det automatiskt analysera bilderna och utgång en datamapp som innehåller alla datatabeller, som beskrivs nedan, i samma mapp som filen bifogad bild. Bifogad fil counter makrot utförs endast på den bifogade filen; alla andra analyser utförs på en länkad stack på filerna fastsättning och tillväxt. Utdata filer som genereras är textfiler, men bör importeras till excel för enkel användning.
Den Summa intensitet analysen analyserar varje bildruta i det aktiva fönstret. Den lägger upp alla grå värden för varje pixel som ligger över tröskeln lägre designerat i steg 4.3.7 och utgångar en ackumulerade värdet per bildruta. De värden som genereras är proportionell mot biomassa inom ramen, fram till någon kamera mättnad som uppstår. Uppgifterna bör då normaliseras i området imaging regionen. Detta utförs inte av makrot.
Täckningsområde analysen kommer att analysera varje bildruta i det aktiva fönstret för den ram som täcks av celler (ovanför lägre tröskelvärdet) som en procentandel.
Bifogad fil counter använder ram subtraktion för att bestämma summan intensiteten i alla celler som fäster mellan varje bildruta. Den första datapunkten är således biomassan av de celler som fäster mellan bildrutorna 1 och 2; det andra data är biomassa av fästa celler mellan ramar 2 och 3, etc. Dessa data bör normaliseras i området i regionen imaging. För enklare läsbarhet är det också bra att integrera detta värde före graphing.
Avlossning räknaren fungerar på samma sätt som bifogad fil counter, men vänder den ram subtraktionen, sådan att den bestämmer summan intensiteten i de celler som kopplar loss mellan varje bildruta. Dessa uppgifter bör också vara normaliserade till området i regionen imaging och integrerad före graphing. Före integrering, kan uppgifterna normaliseras ytterligare till summan intensiteten av den föregående bildrutan beräknas summan intensitet analysen. Denna nya värdet representerar andelen celler som kopplar loss från biofilmen som tidpunkt, vilket är ofta mer värdefulla data, eftersom biomassan av de lossa cellerna kommer att öka med ökande biofilm biomassa.
Även om systemets flöde som presenteras här är mer komplicerad att bygga och driva än andra flödessystem, erbjuder det flera fördelar. Många av dessa fördelar resultera från vår användning av en kommersiellt tillgänglig kanal bild. Vävnadsodling behandling tillgänglig för dessa bilder är tillräcklig för att Candida celler att följa ytan. Profilen för denna kanal bild som liknar en traditionell bild gör dessutom att lätt användas på en mängd olika Mikroskop system, inklusive upprätt Mikroskop med genomlysning vid låg förstoring. Använder denna typ av mikroskopet tillät oss att använda darkfield mikroskopi, som gjorde kvantifiering av data mycket lättare, särskilt jämfört med fluorescerande mikroskopi (som det fanns ingen fotoblekning och låg fototoxicitet). Traditionella mikroskopi (utan optisk snittning), är kraft konservativ, innebörden av fokus celler bidrar liknande antalet fotoner till en bild som i fokus celler av liknande storlek12. Detta innebär att den full 3D växande biofilmen trots vår enda plan för imaging, fortfarande att kvantifieras i hela experimentet, även om de högsta regionerna är ur fokus. Denna singel-plane imaging har fördelen av dramatiskt sänka fototoxicitet skador på celler, men ger inte någon information på 3D-arkitekturen av biofilmen. Dock kan detta flödessystem också användas med fluorescerande celler och confocal Mikroskop för att erhålla denna information13.
De unika två kolv recirkulerande inställning av vår flöde apparater också har många fördelar. Första, många flödessystem kräver att bilderna före vara seedad med celler, men vår användning av en separat cell-seedade fastsättning kolv tillåter oss att bild och kvantifiera celler som de iakttar i bilden samtidigt under flöde, och vi anser att detta är mer liknar vad inträffar < C0 > i vivo. Dessutom har vi tidigare kunnat justera våra Mikroskop för höghastighetståg imaging och bild vidhäftning händelser som de inträffade i realtid, i motsats till kvantifiera dem efter faktum11. För det andra har en cell-fri tillväxt kolv som återcirkulerar och kan bibehållas cellfria över förlängning av giltighetstiden får oss att förstå hur biofilmer växa under flöde för över 24 h, en längd som vanligtvis inte kan åstadkommas med icke-recirkulerande system . Vi har inte ännu bestämt den övre tid gränsen för vad som kan uppnås med vår flödessystem, men vi har slutfört 36 h experiment; men ju längre experimentet, desto större chans till en läcka eller ett igensatt filter. Många faktorer kan påverka potentiella varaktigheten av ett experiment, inklusive tillväxten av cellerna, hur självhäftande de är och i vilken grad av hyfer bildas, vilket gör det svårt att definiera en övre gräns på varaktigheten av ett experiment. Dock om mycket längre varaktigheter önskas än kan uppnås med flow apparaten som presenteras, kan filtren ersättas med en i-line ultraviolett (UV) sterilisering box som har varit tidigare beskrivna8. Kryssutan sterilisering kan också flödet apparaten ska användas till bilden bakterier; våra tidigare försök att bilden bakteriestammar resulterade i snabb igensättning av 0,2 µm filter. Slutligen, vi valde att inte anta UV sterilisering, som rutan är anpassade fabricerade, och eftersom detta skulle resultera i recirkulerande döda celler.
En annan fördel med detta flödessystem är att det är någorlunda billig i förhållande till kommersiella system, särskilt om du behöver köpa ett Mikroskop med det. I vårt labb kunde vi köpa ett grundläggande överförda ljus bänkmonterade Mikroskop och placera hela mikroskopet inuti en stor standard konvektion inkubator. Det enda stora kravet är att mikroskopet bör ha en slutarfunktion (mekaniska eller elektriska) för att utföra time-lapse mikroskopi.
Även detta system är mångsidig och erbjuder många fördelar, är det en låg genomströmning metod. Vår flöde apparater är oförmögen att växa flera stammar parallellt, till skillnad från andra tillgängliga flödessystem. På grund av den omfattande förberedelser och rengöringstiden är vi bara kunna utföra två experiment en vecka. Men många andra flödessystem är ganska kostsamma och kan täppa när Candida celler odlas under hyfer bildar villkor.
Dessutom detta flödessystem är ganska komplicerat jämfört med andra och kan vara svårt att hålla i drift. Efter många experiment, filter börjar täppa, slangar börjar att bära tunna och delar börjar rosta eller lossna; vilket kräver dessa komponenter bytas. Användning av filter gör detta system oförenlig med tillväxt villkorar av vissa svamp stammar; i synnerhet täpper något som inducerar flockning snabbt det 20 µm in-line-filtret. Dock med tillräcklig erfarenhet av att använda systemets flöde, blir det lättare att upptäcka potentiella problem innan de leder till ett misslyckat experiment. En sak som kan göras för att göra den dagliga användningen av flow apparaten lite enklare är att ha en maskinist göra en replik av den bubbelfälla bostäder ur ett autoklaverbart material (såsom aluminium eller rostfritt stål), så att du kan autoklav bubblan fälla med resten av flödet apparaten, PTFE membran och adapter komponenterna i bubbelfällan är autoklaverbart.
Avslutningsvis representerar två faser recirkulerande flow apparaten presenteras här en unik modell att bild och kvantifiera i vitro biofilm bildning av svampar under flöde och i realtid. Medan systemet har sina begränsningar, det är mycket anpassningsbar och fungerar bra med de flesta Mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna Dr. Wade Sigurdson för att ge värdefull input i utformningen av flow apparaten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pump | Cole Parmer | 07522-20 | 6 |
| Pump head | Cole Parmer | 77200-60 | 6 |
| Tubing | Cole Parmer | 96410-14 | N/A |
| Bubble trap adapter | Cole Parmer | 30704-84 | 3 |
| Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line | Cole Parmer | 31500-55 | 3 |
| In-line filter adapter (4 needed) | Cole Parmer | 31209-40 | 8,9 |
| Orange-side Y | Cole Parmer | 31209-55 | 7 |
| Green-side Y | ibidi | 10827 | 2 |
| * Slides | ibidi | 80196 | 4 |
| * Slide luers | ibidi | 10802 | 4 |
| Vacuum assisted Bubble trap | Elveflow/Darwin microfluidics | KBTLarge - Microfluidic Bubble Trap Kit | 3 |
| Media flasks | Corning | 4980-500 | 1 |
| 0.2 µm air filter | Corning | 431229 | 1 |
| Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed) | Corning | 1395-100 | 5,10 |
| Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed) | Wheaton | 1129750 | 5,10 |
| Screwcap tubing connector | Wheaton | 1129814 | 5,10 |
| Tubing connector beveled washer | Danco | 88579 | 5,10 |
| Tubing connector flat washer | Danco | 88569 | 5,10 |
| Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed) | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 15100002-100 | 7,8,9 |
| Clamp tool | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 14100386 | N/A |
| 20 μm in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1331 | 8 |
| 10 μm in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1333 | 9 |
| 2 μm inlet media filter | Supelco/Sigma-Aldrich | 58267 | 10 |
| * 0.22 µm media filter | Millipore | SVGV010RS | 11 |
| * 0.22 µm media filter “adapter” | BD Biosciences | 329654 | 11 |
| Rubber stopper | Fisher Scientific | 14-131E | 1 |
| Hotplate stirrer with external probe port | ThermoFisher Scientific | 88880006 | N/A |
| Temperature probe | ThermoFisher Scientific | 88880147 | N/A |
References
- Pankhurst, C. L. Candidiasis (oropharyngeal). BMJ clinical evidence. 2012, 1304 (2012).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Revista iberoamericana de micología. 18 (4), 163-170 (2001).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Current biology: CB. 15 (12), 1150-1155 (2005).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Current opinion in microbiology. 9 (6), 588-594 (2006).
- Araújo, D., Henriques, M., Silva, S. Portrait of Candida Species Biofilm Regulatory Network Genes. Trends in microbiology. 25 (1), 62-75 (2017).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of visualized experiments. (59), e3349 (2012).
- Bakker, D. P., van der Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Applied and environmental microbiology. 69 (10), 6280-6287 (2003).
- Zhang, W., Sileika, T. S., Chen, C., Liu, Y., Lee, J., Packman, A. I. A novel planar flow cell for studies of biofilm heterogeneity and flow-biofilm interactions. Biotechnology and bioengineering. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J. L. An easy and economical in vitro method for the formation of Candida albicans biofilms under continuous conditions of flow. Virulence. 1 (6), 483-487 (2010).
- Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
- McCall, A., Edgerton, M. Real-Time Approach to Flow Cell Imaging of Candida albicans Biofilm Development. Journal of fungi. 3 (1), Basel, Switzerland. 13 (2017).
- Zhang, B., Zerubia, J., Olivo-Marin, J. -C. Gaussian approximations of fluorescence microscope point-spread function models. Applied optics. 46 (10), 1819-1829 (2007).
- Tati, S., et al. Candida glabrata Binding to Candida albicans Hyphae Enables Its Development in Oropharyngeal Candidiasis. PLoS pathogens. 12 (3), 1005522 (2016).
